乳酸菌基因組研究應(yīng)用進(jìn)展

馬長(zhǎng)路, 逄曉陽(yáng), 張書文, 劉鷺, 蘆晶,呂加平*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京，100193)2(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京，102442)

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乳酸菌基因組研究應(yīng)用進(jìn)展

馬長(zhǎng)路1, 2, 逄曉陽(yáng)1, 張書文1, 劉鷺1, 蘆晶1,呂加平1*

1(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京，100193)2(北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京，102442)

為了更好地了解乳酸菌基因組研究和應(yīng)用的現(xiàn)狀，通過對(duì)近幾年來國(guó)內(nèi)外乳酸菌基因組相關(guān)研究的整理分析，發(fā)現(xiàn)目前的3個(gè)研究重點(diǎn)：菌種鑒定、菌種改良(基因重組)和基因組學(xué)研究。結(jié)果表明，對(duì)乳酸菌突變體和特異性菌種的基因組研究，結(jié)合蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和相關(guān)研究成果，將進(jìn)一步揭示乳酸菌功能特性的實(shí)質(zhì)，讓乳酸菌更好的成為細(xì)胞工廠、防腐抑菌和營(yíng)養(yǎng)保健的家庭成員。

乳酸菌，菌種鑒定，基因重組，基因組學(xué)

書面記載發(fā)酵食品的生產(chǎn)可以追溯到大約公元前4000年，這可能是“最古老的”生物技術(shù)實(shí)踐。乳酸菌(LAB)一直是在這些應(yīng)用的核心，從而起到了重要的作用。這個(gè)長(zhǎng)期的使用傳統(tǒng)中，人類利用LAB參與食品發(fā)酵，達(dá)到理想的效果，同時(shí)獲得由美國(guó)食品和藥物管理局認(rèn)可的安全地位(GRAS)。

乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性微生物，兼性厭氧，主要發(fā)酵產(chǎn)物是乳酸。因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，乳酸菌快速產(chǎn)酸，從而能夠防止腐敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。此外，乳酸菌還有助于改善發(fā)酵的風(fēng)味、質(zhì)地和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

近年來，人們利用基因組相關(guān)技術(shù)研究了食品，如奶酪、肉、發(fā)酵谷物食品、葡萄酒、發(fā)酵洋橄欖和食醋中的乳酸菌，也研究了青貯飼料中的乳酸菌，而且還研究了活性物質(zhì)，如D-乳酸、活性肽、納豆激酶中的相關(guān)的乳酸菌。除了上述應(yīng)用層面的研究，人們利用基因組相關(guān)技術(shù)研究了生物模型的構(gòu)建[1]、代謝工程[2]和易錯(cuò)全基因組擴(kuò)增技術(shù)。本文通過對(duì)這些研究的整理與分析，從菌種鑒定、菌種改良(基因重組)和基因組學(xué)研究3個(gè)方面加以闡述。

1 基因組學(xué)在菌種鑒定中的應(yīng)用

常規(guī)乳酸菌菌種的分離鑒定流程是在分離純化微生物后，通過表型特征、形態(tài)學(xué)觀察，以及生理生化反應(yīng)分析來實(shí)現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開始從分子和基因水平來研究菌種，PCR技術(shù)成為研究的熱門。國(guó)外對(duì)于益生菌菌種的研究主流是以各類乳酸菌菌株的基因指紋特征為基礎(chǔ)，建立針對(duì)單個(gè)乳酸菌的特征性圖譜庫(kù)。表1給出了近年來一些利用基因組學(xué)信息開展菌種鑒定的研究成果。

FOLARIN等人在2種傳統(tǒng)的非洲發(fā)酵谷物食品中，采用微生物基因組分類法，研究土著細(xì)菌的基因差異和分布。從尼日利亞北部和南部地區(qū)的奧吉和軍隅崎中分離獲得85個(gè)主要的細(xì)菌種類。它們的種類通過16S rRNA 基因序列分析結(jié)合基于rpoA，pheS和atpA基因和M13-PCR凝膠圖譜的多位點(diǎn)序列分析(MLSA)得到確認(rèn)。結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌是從奧吉(71.4%)和軍隅崎(84.5%)中分離獲得最常見的菌種。其他種類的乳酸菌(LAB)鑒定為植物乳桿菌，Streptococcusgallolyticussubsp.macedonicus和戊糖片球菌。對(duì)乳酸菌M13-PCR指紋圖譜的非度量多維標(biāo)度(nMDS)分析表明，同一物種的菌株之間存在克隆多樣性[6]。

表1 利用基因組信息進(jìn)行菌種鑒定

VASILEIOS采用多相分類的方法確定了22 ℃， 5天平板培養(yǎng)后，占主導(dǎo)地位的嗜冷乳酸菌的微生物多樣性得以恢復(fù)。以前，采用時(shí)溫枚舉技術(shù)，觀測(cè)嗜冷菌的乳酸菌(LAB)在儲(chǔ)存在低溫的33種零售包裝食品的污染水平，作為保質(zhì)期的參考參數(shù)，該污染水平有相當(dāng)大的低估(0.5～3.2 lg CFU/g)。目前研究中，通過rep-PCR指紋圖譜分析結(jié)合擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析和pheS基因測(cè)序分析，共有212株乳酸菌被鑒定[7]。

FELIX等人研究了接種布氏乳桿菌cd034對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。由16S rDNA擴(kuò)增序列導(dǎo)出的分類群落概況表明，在發(fā)酵過程中，乳酸乳球菌的相對(duì)豐度減少，同時(shí)，屬于門變形菌和擬桿菌的細(xì)菌的比例在未經(jīng)處理的青貯發(fā)酵過程中有所增加。此外，通過宏基因組分析青貯樣品，確認(rèn)基于16S rDNA擴(kuò)增的分類圖譜。通過篩選宏基因組序列片段，分析讀取完整的參考基因組序列，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌，短乳桿菌和乳酸菌在青貯飼料中是占主導(dǎo)地位的菌種[9]。

2 基因組學(xué)在乳酸菌菌種改良(基因重組)的應(yīng)用進(jìn)展

隨著生命科學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入和細(xì)化,通過研究乳酸菌的遺傳變異及多樣性，采用分子生物學(xué)手段對(duì)乳酸菌進(jìn)行遺傳修飾和改造，以期能夠生產(chǎn)某種特定產(chǎn)物，提高某種性能或改善產(chǎn)品品質(zhì)。表2列出一些利用乳酸菌基因組信息改造菌株的研究數(shù)據(jù)。

EnantiopurityLactobacilluscoryniformis在30 ℃培養(yǎng)時(shí)主要發(fā)酵產(chǎn)物為D-乳酸。然而，在發(fā)酵溫度高于40 ℃時(shí)能夠檢測(cè)到一定量的L-乳酸。因?yàn)楣鈱W(xué)純的乳酸是由手性D-或L-乳酸脫氫酶(D-LDHs或L-LDHs)催化丙酮酸合成的，較高熱穩(wěn)定性的L-LDHs被認(rèn)為是降低L.coryniformis生產(chǎn)D-乳酸光學(xué)純度的關(guān)鍵因素之一。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)，在Escherichiacoli中合成并且表達(dá)了基于L.coryniformis基因組信息的2種D-LDH基因和6種L-LDH基因。結(jié)果表明，同D-LDH1相比具有較高的熱穩(wěn)定性的L-LDHs可能是高溫發(fā)酵時(shí)D-乳酸純度降低的主要原因[10]。

馮浩等研究者構(gòu)建整合型表達(dá)載體pFY008，以HisH基因作為同源重組的靶位點(diǎn)，通過同源重組將含有納豆激酶原基因的表達(dá)盒PnisA-aprN整合到乳酸菌的基因組上，實(shí)現(xiàn)納豆激酶在乳酸乳球菌中表達(dá)[14]。

YE等研究戊糖乳桿菌ATCC 8041的耐酸性，是通過使用隨機(jī)引物和TaqDNA聚合酶對(duì)基因組DNA易錯(cuò)擴(kuò)增而得以改進(jìn)。僅僅一輪突變后，突變體(MT3)被發(fā)現(xiàn)，在pH 3.8的1 L MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h，能夠完全消耗20 g/L葡萄糖，產(chǎn)生乳酸，得率為95%，而在相同條件下野生型菌株均未觀察到生長(zhǎng)或生產(chǎn)乳酸。突變體MT3耐酸性保持穩(wěn)定遺傳至少25代[13]。

郭晶等研究者利用基因組改組方法篩選出促進(jìn)干酪成熟的非發(fā)酵劑乳酸菌。采用紫外線和亞硝基胍兩種傳統(tǒng)的誘變方法對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行誘變，通過檢測(cè)自溶度、氨肽酶、產(chǎn)酸能力指標(biāo)獲得6株氨肽酶活性和自溶度均有所提高的突變菌株。以獲得的突變菌株為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行基因組改組，經(jīng)自溶度、氨肽酶、產(chǎn)酸能力篩選，獲得1株遺傳性能穩(wěn)定的菌株，其氨肽酶活力為34.01個(gè)酶活單位，比出發(fā)菌株提高了3.09倍，自溶度為56.45%，比出發(fā)菌株提高了3.16倍[15]。

表2 利用基因組信息進(jìn)行菌種改良(基因重組)

3 基因組學(xué)研究進(jìn)展

基因組學(xué)由美國(guó)科學(xué)家THOMAS R于1945年提出, 是指對(duì)基因組進(jìn)行作圖、序列分析、基因定位及功能分析的科學(xué)。功能基因組學(xué)Functional genomics的研究又被稱為后基因組學(xué),是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物, 通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能, 使得生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)研究。功能基因組學(xué)的研究包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)分析及突變檢測(cè)。它采用一些新的技術(shù)對(duì)成千上萬(wàn)的基因表達(dá)進(jìn)行分析和比較, 力圖從基因組整體水平上對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行闡述。表3列出近些年乳酸菌基因組信息研究的數(shù)據(jù)。

如今，人們對(duì)促進(jìn)健康的功能性食品的興趣與日俱濃，從而使消費(fèi)者持有更高的期望，超過基本的營(yíng)養(yǎng)訴求，更加注重健康。 膳食蛋白提供了一個(gè)豐富的生物活性肽資源，這是隱藏在天然蛋白質(zhì)內(nèi)的一個(gè)潛在狀態(tài)，需要酶促蛋白水解釋放。生物活性肽能夠在體內(nèi)消化和/或食品加工過程中產(chǎn)生。乳酸菌是最廣泛使用的微生物發(fā)酵食品的發(fā)酵劑，并通過其蛋白水解系統(tǒng)，促進(jìn)膳食蛋白質(zhì)的生物活性肽的釋放。在體外和體內(nèi)研究表明多種生物學(xué)功能歸結(jié)為生物活性肽，如抗菌，免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)礦物質(zhì)的吸收，增強(qiáng)抗血栓形成，抗高血壓藥物和抗氧化的活性。在這些產(chǎn)品中巨大的復(fù)雜性和廣泛的相對(duì)肽豐度的動(dòng)態(tài)范圍，嚴(yán)重挑戰(zhàn)現(xiàn)有分析方法的能力。然而，功能和比較基因組學(xué)研究，以及蛋白質(zhì)組學(xué)方法提供了豐富的知識(shí)，揭示這些乳酸菌利用食物蛋白釋放生物活性肽的方式[16]。

布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，是青貯微生物組的普通一員。L.布氏cd034全基因組測(cè)序是在羅氏基因組測(cè)序FLX平臺(tái)上進(jìn)行的。它被發(fā)現(xiàn)有4個(gè)復(fù)制子，1個(gè)圓形的染色體，和3個(gè)質(zhì)粒。預(yù)測(cè)環(huán)狀染色體是編碼2 319個(gè)蛋白，含有基因組島和2個(gè)原噬菌體。原噬菌體同其余染色體具有顯著不同的G+C含量。它具有1個(gè)完整的酶磷酸途徑酶的所有基因，而缺乏2個(gè)必要的糖酵解酶。這證實(shí)了cd034 L.布氏的分類為一種專性異型發(fā)酵乳酸菌。一組基因被認(rèn)為參與乳酸降解途徑，同時(shí)一組基因被證實(shí)可能參與植物細(xì)胞壁聚合物的分解。此外，一些位于染色體的編碼S-層蛋白和兩個(gè)CRISPR系統(tǒng)的基因，屬于子類I-E和II-A。最大的質(zhì)粒pcd034-3被認(rèn)為編碼57個(gè)基因，其中包括一個(gè)多糖合成基因簇，而2個(gè)小質(zhì)粒pcd034-1和pcd034-2的功能仍保持神秘?；诒Ｊ氐臉?biāo)記基因rpoA序列比較的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，L.布氏cd034和布氏乳桿菌菌株同短乳桿菌和植物乳桿菌菌株相比更為密切相關(guān)。同其他全序列測(cè)定的和乳桿菌屬的成員密切相關(guān)的核心基因組比較，L.布氏cd034和最近測(cè)序的L.布氏乳桿菌菌株NRRL b-30929存在高度的保守，同時(shí)它和L.布氏乳桿菌菌株ATCC 11577和L.brevisssp.ravesensisATCC 27305之間存在更遠(yuǎn)的關(guān)系。L.布氏cd034基因組信息將提供深入研究后基因組的基礎(chǔ)，以期優(yōu)化青貯生產(chǎn)菌株的應(yīng)用[17]。

表3 利用基因組信息進(jìn)行組學(xué)研究

植物乳桿菌是一類與人類的生活關(guān)系密切， 具有多種益生功能的乳酸菌。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用， 越來越多的植物乳桿菌基因組全序列測(cè)定得以實(shí)現(xiàn)。以植物乳桿菌基因組為主要研究對(duì)象，陳臣等人采用比較基因組學(xué)分析和比較了幾株測(cè)序的植物乳桿菌的基因組特點(diǎn)[18]。

HIKMATE等人從4個(gè)西班牙中小企業(yè)的自然發(fā)酵的洋橄欖中篩選144株乳酸菌，包括乳酸桿菌(81.94%)，明串珠菌 (10.42%) 和片球菌(7.64%)。 REP-PCR聚類和phes和rpo基因測(cè)序進(jìn)一步鑒定表明，從不同的中小企業(yè)篩選出的乳酸桿菌菌株是戊糖乳桿菌?；蚍中徒Y(jié)果顯示，菌株沒有克隆的相關(guān)性，而是展現(xiàn)一定的基因組多樣性，尤其是乳桿菌和明串珠菌[20]。

傳統(tǒng)食醋具有悠久的歷史，生產(chǎn)工藝獨(dú)特，釀造過程中復(fù)雜的微生物群落及其代謝產(chǎn)物賦予了傳統(tǒng)食醋獨(dú)特的風(fēng)味。采用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成及其多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：在醋酸發(fā)酵前期細(xì)菌具有較高的多樣性，主成分分析表明與醋酸發(fā)酵過程相關(guān)的細(xì)菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)、醋桿菌屬(Acetobacter)和念珠藻屬(Nostoc)。隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，醋酸菌的含量呈增加趨勢(shì)，乳酸菌的豐度降低，在整個(gè)醋酸發(fā)酵過程中乳酸菌的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他細(xì)菌，說明乳酸菌可能對(duì)食醋的風(fēng)味形成具有重要作用[22]。

4 組學(xué)與代謝工程

YOSHIDA等人引入植物乳桿菌基因組中2份戊糖乳桿菌xylAB操縱子。由此產(chǎn)生的菌株能夠發(fā)酵1個(gè)25 g/L木糖和75 g/L葡萄糖的混合物，無(wú)碳代謝抑制的影響，乳酸產(chǎn)率為0.78 g/g[23]。

VAN等人開展了對(duì)于能夠適應(yīng)8%乙醇的植物乳桿菌細(xì)胞的全局轉(zhuǎn)錄組分析，過表達(dá)檸檬酸代謝和細(xì)胞包絡(luò)結(jié)構(gòu)的基因，以及由中央應(yīng)激調(diào)控子HrcA 與CtsR控制的典型應(yīng)激反應(yīng)途徑中的基因[24]。而且，目前能夠獲得乙醇耐受型菌株的基因組序列[25]?？傊@些信息肯定會(huì)發(fā)現(xiàn)適合的基金用于乙醇生產(chǎn)的乳酸菌設(shè)計(jì)途徑。

最近，枯草芽孢桿菌(納豆)丙氨酸脫氫酶用于乳酸丙氨酸生物合成的潛力被證明。這種酶在42 ℃保留高活性，使其在應(yīng)用時(shí)需要高溫顯得非常有趣。事實(shí)上，這是一個(gè)應(yīng)用于酸奶中的嗜熱鏈球菌的工程策略，典型的生物發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生甜而健康的產(chǎn)品，這個(gè)目標(biāo)是依賴于有機(jī)體及其表達(dá)系統(tǒng)的有效轉(zhuǎn)型[26]。

最近幾年來，通過引入下一代測(cè)序培養(yǎng)技術(shù)和隨之而來測(cè)序成本的降低，乳酸菌的基因組項(xiàng)目激增。目前，大約40種相關(guān)的工業(yè)乳酸菌的基因組都存放在公共數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)報(bào)告了100多個(gè)基因組測(cè)序項(xiàng)目仍在繼續(xù)(http://www.genome.jp/kegg/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome; http://www.jgi.doe.gov/)。利用這些基因組序列促進(jìn)全基因組芯片的發(fā)展，能夠分析在任何一個(gè)給定的時(shí)間的基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄組分析)，能夠識(shí)別全部基因的基因型-表型聯(lián)系(比較基因組雜交)[27]。在未來的幾年里，測(cè)序的進(jìn)展有望推動(dòng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的數(shù)量和質(zhì)量。

在乳酸菌中通過蛋白質(zhì)組學(xué)開展全蛋白補(bǔ)充說明沒有轉(zhuǎn)錄組學(xué)頻繁，主要是由于相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)層面的挑戰(zhàn)。然而，在應(yīng)激條件和適應(yīng)環(huán)境變化時(shí)乳酸菌蛋白組定量分析已被報(bào)道[28-29]。這些研究中的大多數(shù)仍然依賴于凝膠為基礎(chǔ)的技術(shù)，但隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)將有更廣泛的應(yīng)用[30]。在體內(nèi)核磁共振的最大優(yōu)勢(shì)是依賴于它的獨(dú)特能力，提供實(shí)時(shí)測(cè)量的細(xì)胞內(nèi)的終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。特別是生產(chǎn)乳酸的乳酸乳球菌，每當(dāng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外空間的PH值的差異能夠充分分離相應(yīng)的共振時(shí)，能夠區(qū)分細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的乳酸；這種分離是由于兩個(gè)部分不同的乳酸質(zhì)子化程度。從實(shí)際角度來看，在葡萄糖謝過程中，當(dāng)細(xì)胞外的PH值低于6時(shí)，量化外部和內(nèi)部的乳酸是可行的[31]。

最近，獲得一種改進(jìn)的乳酸乳球菌的糖酵解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型[32]。隨后，這些作者以乳酸乳球菌模型為藍(lán)本，快速開發(fā)了化膿性鏈球菌糖酵解的第一反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，從而允許物種間比較。雖然該系統(tǒng)并未確定，呈現(xiàn)一些動(dòng)力學(xué)的非可識(shí)別參數(shù)，但磷酸變構(gòu)調(diào)節(jié)的不同，可能是基于在被鏈球菌科占據(jù)的自然環(huán)境的磷酸水平。系統(tǒng)代謝工程的使用將繼續(xù)開展，構(gòu)建模型也將更加重要。對(duì)于給定的試驗(yàn)條件和數(shù)據(jù)集，定義和構(gòu)建最佳的模型方程仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[33]。

不同類型的不同結(jié)構(gòu)的層級(jí)數(shù)據(jù)的整合也是未來研究的有趣課題[34]。例如，熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的整合在基因組規(guī)模模型的限制，被證明是相關(guān)的減少通過消除不可行途徑的通量空間解[35]。預(yù)計(jì)將包含額外的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如基因表達(dá)，蛋白表達(dá)，代謝物濃度，和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可用于減少基于約束模型的解空間[36]。最近，集成模型代謝和大分子表達(dá)模型提出[37]，構(gòu)成一個(gè)有前途的和強(qiáng)大的框架，從一個(gè)系統(tǒng)的水平和基因組規(guī)模定量描述細(xì)胞的生理現(xiàn)象，可以預(yù)見系統(tǒng)代謝工程乳酸菌將受益于這些方法。

5 展望

對(duì)乳酸菌突變體和特異性菌種的基因組研究，結(jié)合蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)和相關(guān)研究成果，將促進(jìn)乳酸菌在如下3個(gè)方面的研究：細(xì)胞工廠，主要指以乳酸菌為載體加工生物活性產(chǎn)物；防腐抑菌，主要指乳酸和其他有機(jī)酸的抑菌防腐作用；營(yíng)養(yǎng)保健，主要包括降血脂、降膽固醇和抗氧化作用。通過各種技術(shù)的結(jié)合，必將推動(dòng)乳酸菌基礎(chǔ)和應(yīng)用研究的不斷發(fā)展。

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Advances in lactic acid bacteria genomics and its application

MA Chang-lu1, 2,PANG Xiao-yang1，ZHANG Shu-wen1， LIU Lu1,LU Jing1,LYU Jia-ping1*

1(Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,China) 2(Beijing Agricultural Vocational College, Beijing 102442,China)

To better know the current advances in the lactic acid bacteria genomics and its application，a lot of literatures were collected and analyzed to find three key points in research, i.e.. Species identification, strain improvement (genetic recombination) and genomics. The results showed that the genomic studies of the mutants and specific strains of lactic acid bacteria, combined with proteomics and the related research results, would further reveal the essence of the functional characteristics of the lactic acid bacteria, and indicate that the lactic acid bacteria could be a member for cell factory, antiseptic function and health care.

lactic acid bacteria; species identification; genetic recombination; genomics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610040

博士研究生，副教授(呂加平為通訊作者， E-mail: kjdairy@126.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31471603)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371808);北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院科技研發(fā)推廣類項(xiàng)目(XY-16-29)

2015-12-01，改回日期：2016-04-12