全局調(diào)控因子CodY在益生菌中的研究進(jìn)展

馮佳，吳昊，王斌斌，喬建軍

(天津大學(xué) 化工學(xué)院，制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072)

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全局調(diào)控因子CodY在益生菌中的研究進(jìn)展

馮佳，吳昊，王斌斌，喬建軍*

(天津大學(xué) 化工學(xué)院，制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072)

CodY是一個(gè)具有一定的保守性的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，普遍存在于低G-C含量的革蘭氏陽(yáng)性菌中。對(duì)枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌等益生菌的研究表明，CodY對(duì)菌株的碳代謝、氮代謝、脅迫響應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及自然感受態(tài)等具有重要的調(diào)控作用。文中對(duì)益生菌中調(diào)控因子CodY的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行綜述，并以枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌等為例介紹CodY的調(diào)控作用，為進(jìn)一步改造菌株，探索CodY潛在的調(diào)控功能,以及為其在食品發(fā)酵中的應(yīng)用提供參考。

CodY；調(diào)控因子； 革蘭氏陽(yáng)性菌；益生菌

乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌和枯草芽孢桿菌都屬于益生菌，具有不產(chǎn)生毒素和致熱致敏蛋白、非致病性等特點(diǎn)，可用于食品及發(fā)酵工業(yè)中。乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)屬于乳酸菌的乳球菌屬，可以產(chǎn)生一種多肽物質(zhì)——乳酸鏈球菌素(Nisin)[1]，是被FDA唯一公認(rèn)的一種高效的天然食品防腐劑，并廣泛應(yīng)用于肉制品、魚類制品、果汁飲料等食物的保鮮和防腐中。Nisin進(jìn)入人體消化道后，會(huì)被蛋白酶降解成游離氨基酸并維持正常的菌落環(huán)境。但是乳酸乳球菌在發(fā)酵過(guò)程中不斷產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致pH值降低，不利于Nisin的產(chǎn)生[2]，所以乳酸乳球菌的耐酸調(diào)控機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。枯草芽孢桿菌是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株和遺傳改造受體菌株，在工業(yè)上廣泛用來(lái)生產(chǎn)α-淀粉酶、中性蛋白酶、納豆以及肌苷發(fā)酵；在植物病原菌生物防治領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理中也有重要的作用。嗜熱鏈球菌來(lái)源于牛乳中，與瑞士乳桿菌等混合發(fā)酵生產(chǎn)酸奶和奶酪，可以借助自身合成β-半乳糖苷酶高效利用乳糖為自己的生長(zhǎng)提供能量，并且?guī)椭荒褪苋樘堑娜讼樘?，但自身合成的蛋白酶的活性很弱[3]，只能利用氨基酸和寡肽來(lái)補(bǔ)充氮源，所以氨基酸的合成代謝和寡肽的高效攝取對(duì)于嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)非常重要。

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY普遍存在于低G-C含量的革蘭氏陽(yáng)性菌中，在面對(duì)環(huán)境變化時(shí)，通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄速率調(diào)控靶基因的表達(dá)水平，對(duì)細(xì)胞內(nèi)10%以上的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而對(duì)細(xì)胞代謝做出迅速的調(diào)整，構(gòu)成一個(gè)巨大的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)不同的作用機(jī)制調(diào)控菌體內(nèi)不同基因的轉(zhuǎn)錄，幫助細(xì)胞適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)匱乏的環(huán)境。目前，CodY的調(diào)控作用主要集中在碳代謝、氮代謝以及自然感受態(tài)等過(guò)程。本文對(duì)全局調(diào)控因子CodY的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、結(jié)合位點(diǎn)以及在乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌的生物功能的研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，為深入了解細(xì)菌體內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及解決食品和發(fā)酵工業(yè)中的問(wèn)題提供有效的參考。

1 全局調(diào)控因子CodY的結(jié)構(gòu)

目前研究較為透徹的是枯草芽孢桿菌CodY 的結(jié)構(gòu)，它是1個(gè)具有259個(gè)氨基酸殘基的二聚體蛋白，序列高度保守[4]，其結(jié)構(gòu)由C端和N端2部分組成。N端為GAF結(jié)構(gòu)域，是鳥嘌呤三磷酸(Guanosine-5′- Triphosphate，GTP)和分支氨基酸(Branched Chain Amino Acids，BCAAs)2個(gè)效應(yīng)分子的結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)構(gòu)廣泛存在于環(huán)核苷酸磷酸二酯酶和腺苷酸環(huán)化酶中。當(dāng)BCAAs作用于CodY時(shí)，CodY的構(gòu)型轉(zhuǎn)變并再次折疊，從而形成一個(gè)疏水口袋，這一疏水口袋既是BCAAs的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)構(gòu)型的轉(zhuǎn)變會(huì)傳遞給C端，激活CodY和DNA的相互作用。在這一過(guò)程中，CodY的核心部分及二聚作用界面不發(fā)生變化[5]。C端含1個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(“HTH”)結(jié)構(gòu)域，與DNA啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。每個(gè)螺旋含有20個(gè)氨基酸且成120角，這種結(jié)構(gòu)有利于螺旋和DNA的相互作用。

通過(guò)對(duì)CodY的晶體結(jié)構(gòu)的研究，STENZ等[6]歸納出較為簡(jiǎn)單易懂的平面結(jié)構(gòu)圖，如圖1，G1、G3和G4是GTP結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)精氨酸(Arg8)，谷氨酸(Glu144)，谷氨酰胺(Gln15)和蘇氨酸(Thr148)對(duì)于CodY二聚體的形成具有關(guān)鍵作用[4]。利用定點(diǎn)誘變和DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙氨酸(Ala207)，天冬氨酸(Asp208)，精氨酸(Arg214)和絲氨酸(Ser215)對(duì)C端特異性與DNA結(jié)合具有重要作用[7]。

在長(zhǎng)期的自然進(jìn)化中，CodY蛋白序列在不同菌中會(huì)發(fā)生變異，導(dǎo)致CodY結(jié)合不同DNA，改變了CodY調(diào)控的基因[8]。

圖1 枯草芽孢桿菌CodY二級(jí)平面結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of Bacillus subtilis CodY

2 CodY的調(diào)控機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)

2.1 CodY的效應(yīng)分子

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY有2個(gè)效應(yīng)分子[9]，分別是 GTP[10-11]和BCAAs[5,12-13]，其中BCAAs包括異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸，它們的存在能提高CodY與DNA結(jié)合的活性。GTP和BCAAs既可協(xié)調(diào)作用于CodY，也可單獨(dú)作用于CodY。在不同的菌株中，效應(yīng)分子對(duì)CodY的作用是不同的。例如，在枯草芽孢桿菌中，CodY同時(shí)受到GTP和BCAAs的作用，而在肺炎鏈球菌和乳酸乳球菌中，CodY的活性只受到BCAAs的作用，與GTP沒(méi)有關(guān)系[12]，當(dāng)細(xì)胞處于營(yíng)養(yǎng)豐富的狀態(tài)下，受CodY調(diào)控抑制的基因都處于靜止?fàn)顟B(tài)，此時(shí)高濃度的GTP可以激活CodY的抑制作用[10]；在培養(yǎng)基里營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生變化時(shí)，細(xì)菌會(huì)改變CodY調(diào)控的靶基因的表達(dá)模式，在沒(méi)有BCAAs結(jié)合的情況下CodY會(huì)喪失調(diào)控大部分依賴于CodY表達(dá)的基因的能力。在枯草芽孢桿菌中，由于碳源、氮源或者磷源的缺乏而限制菌體生長(zhǎng)時(shí)，GTP的濃度下降，CodY就會(huì)失去抑制活性，被抑制的基因就會(huì)被轉(zhuǎn)錄激活，同時(shí)，由于胞內(nèi)BCAAs的濃度也下降，進(jìn)一步增強(qiáng)了下游基因的表達(dá)[9]。

2.2 效應(yīng)分子的來(lái)源和CodY的相互作用

在細(xì)菌體內(nèi)，GTP的來(lái)源有兩條途徑：(1)從細(xì)菌生存的環(huán)境中獲取(2)通過(guò)合成途徑從5-磷酸核糖經(jīng)過(guò)purCLFMNH和purDEK進(jìn)行合成。當(dāng)GTP的水平降低時(shí)，會(huì)促進(jìn)一個(gè)特殊的反應(yīng)發(fā)生——細(xì)胞的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)[14]。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的壓力響應(yīng)系統(tǒng)，在營(yíng)養(yǎng)受到限制時(shí)，大量的空載tRNA激活核糖體上的RelA蛋白，由GTP和ATP合成ppGpp或pppGpp調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)，從而引發(fā)細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，如圖2。有研究表明ppGpp或pppGpp對(duì)GTP水平的平衡有著關(guān)鍵作用，從而影響CodY調(diào)控氨基酸代謝途徑。這個(gè)過(guò)程中，GTP將全局調(diào)控因子CodY和細(xì)菌嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)聯(lián)系在一起進(jìn)行氨基酸的代謝調(diào)控。

圖2 細(xì)胞的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)示意圖Fig.2 Rigorous reaction of cells

BCAAs既可以通過(guò)ilvBHC和leuABCD合成途徑進(jìn)行自身合成，也可以通過(guò)吸收并利用環(huán)境中的氮源加工得到。研究發(fā)現(xiàn)CodY對(duì)BCAAs的合成途徑也具有調(diào)控作用，而BCAAs作為CodY的效應(yīng)分子，2者相互作用完成CodY對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的調(diào)控作用。

2.3 CodY的作用機(jī)制和結(jié)合位點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，CodY至少通過(guò)4種不同的機(jī)制調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程[15]：(1)通過(guò)結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域附近發(fā)揮正調(diào)控，(2)通過(guò)結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域附近發(fā)揮負(fù)調(diào)控，(3)通過(guò)充當(dāng)RNA聚合酶的路障發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[16]，(4)通過(guò)干擾正調(diào)控因子的作用發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

研究發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌中，CodY蛋白的結(jié)合位點(diǎn)必須是一個(gè)15 bp的標(biāo)準(zhǔn)的共同回文序列(AATTTTCNGAAAATT)[17]，稱為CodY-box，位于目標(biāo)啟動(dòng)子區(qū)域-35區(qū)附近。HENGST等[18]發(fā)現(xiàn)CodY-box普遍存在于葡萄球菌、李斯特菌、芽孢桿菌和鏈球菌中，并通過(guò)體外足跡法實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這個(gè)回文序列在其他革蘭氏陽(yáng)性菌中的保守性。在枯草芽孢桿菌中，CodY調(diào)節(jié)操縱子區(qū)包含重疊的CodY結(jié)合位點(diǎn)[19]，這2個(gè)獨(dú)立作用的CodY高親和位點(diǎn)可以抑制基因ybgE的表達(dá)，其中位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游80bp處的位點(diǎn)在調(diào)控中發(fā)揮主要作用[20]。CodY還可以通過(guò)控制sigma因子sigD的表達(dá)和活性來(lái)直接調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和成鏈[21]。研究表明，CodY可以結(jié)合于sigD的第1個(gè)基因上游位置的PD3和Pfla/che啟動(dòng)子區(qū)，CodY的敲除導(dǎo)致sigD累積量和活性急劇增加，并使得非鏈狀的細(xì)胞數(shù)量從15%增加到75%，這表明codY是sigD的1個(gè)重要的翻譯后調(diào)控因子。通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌突變體的全基因組分析表明，表達(dá)受到影響的基因都沒(méi)有CodY結(jié)合位點(diǎn)，而有CodY結(jié)合位點(diǎn)的基因的表達(dá)在codY缺失菌株中不受影響[15]。這些發(fā)現(xiàn)也潛在的解釋了CodY通過(guò)控制其他調(diào)控因子來(lái)間接調(diào)控基因以及和其他蛋白共同調(diào)控相同基因的復(fù)雜調(diào)控模式。

3 CodY的生物學(xué)功能

全局調(diào)控因子CodY是作為枯草芽孢桿菌中寡肽通透酶(dppABCDE)操縱子的抑制物被發(fā)現(xiàn)的[22]，隨后發(fā)現(xiàn)CodY對(duì)芽孢的形成和穩(wěn)定期早期基因的表達(dá)有重要的調(diào)控作用[23]。DNA微陣列、染色質(zhì)免疫沉淀與微陣列(ChIP-chip)、體外DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)、大規(guī)模并行測(cè)序(IDAP-Seq)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析(RNA測(cè)序)等表明， CodY直接或者間接調(diào)控枯草芽孢桿菌中200多個(gè)基因的表達(dá)[15]，調(diào)控作用主要表現(xiàn)為基因表達(dá)抑制。通過(guò)對(duì)CodY調(diào)控細(xì)菌的碳代謝、氮代謝和自然感受態(tài)等研究，可以通過(guò)基因編輯技術(shù)改造CodY，得到基因工程改造菌株，用于食品和發(fā)酵工業(yè)中。下面以CodY在枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌中的調(diào)控作用對(duì)CodY的生物學(xué)功能進(jìn)行詳細(xì)介紹。

3.1 CodY對(duì)碳和能量代謝的調(diào)控作用

碳代謝是細(xì)菌體內(nèi)能量來(lái)源的主要途徑，當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中，細(xì)菌會(huì)改變代謝方式來(lái)增加ATP應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境，而CodY作為全局調(diào)控因子，對(duì)菌體碳代謝的過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。在枯草芽孢桿菌中，調(diào)控因子CcpA主要對(duì)碳代謝途徑具有調(diào)控作用，并控制了菌體內(nèi)10%的基因的表達(dá)[24]。當(dāng)枯草芽孢桿菌處于營(yíng)養(yǎng)豐富的情況下，ROBERT等[25]發(fā)現(xiàn)乳酸激酶基因ackA受CcpA和CodY的共同正調(diào)控，且作用是累積的，CodY通過(guò)和CcpA共同作用于乳酸激酶和乳酸脫氫酶使丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸或乙酸，體外實(shí)驗(yàn)中CodY結(jié)合到ackA啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn)，并激活ackA轉(zhuǎn)錄，不同于負(fù)調(diào)控，影響CodY活性的只有BCAAs一個(gè)效應(yīng)分子，具體調(diào)控機(jī)制見圖3。

圖3 CodY和CcpA共同調(diào)控作用機(jī)制示意圖Fig.3 Common regulation mechanism of CodY and CcpA(AlsS and IlvBH: α-acetolactate synthetase; AlsD: α-acetolactate dehydrogenase; PDH: pyruvate dehydrogenase; PTA, phosphotransacetylase; ACK, acetate kinase; LDH: lactate dehydrogenase. Bold lines with arrow heads indicate positive regulation by CcpA or CodY; bold blunted lines indicate repression of gene expression by CcpA or CodY.)

嗜熱鏈球菌的碳代謝過(guò)程主要是乳糖代謝過(guò)程，通過(guò)β-半乳糖苷酶以及半乳糖代謝途徑(Leloir途徑)利用乳制品中的乳糖，生成UDP-半乳糖和1-磷酸葡萄糖，后者在磷酸變位酶的催化下生成6-磷酸葡萄糖。研究發(fā)現(xiàn)，缺失codY的枯草芽孢桿菌中磷酸變位酶STND_1003、STND_1004和STND_1007的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)，從而更加充分地利用半乳糖產(chǎn)生乳酸，因此調(diào)控因子CodY對(duì)半乳糖的調(diào)控作用是通過(guò)對(duì)磷酸變位酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

3.2 CodY對(duì)氮代謝的調(diào)控作用

全局調(diào)控因子CodY在氮代謝方面有重要的調(diào)控作用，包括寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸降解途徑、胞外蛋白酶以及支鏈氨基酸的生物合成。

在乳酸乳球菌里，全局調(diào)控因子CodY作為蛋白水解的中央調(diào)控因子被發(fā)現(xiàn)，作為一個(gè)全局調(diào)控因子[18]，對(duì)一系列的細(xì)胞功能的表達(dá)都具有調(diào)控作用，包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、大分子降解、氨基酸代謝和肽代謝等[26]。與枯草芽孢桿菌不同的是，乳酸乳球菌的CodY只受BCAAs這一個(gè)效應(yīng)分子的影響，而BCAAs的濃度決定了CodY的調(diào)控作用，所以BCAAs對(duì)菌體的生長(zhǎng)非常重要。研究發(fā)現(xiàn)CodY對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨基酸的合成也具有負(fù)調(diào)控作用，包括纈氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸、絲氨酸[26]和谷氨酸[27]的合成。

乳酸乳球菌CodY可以抑制包括寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(oppopt)、肽酶(pepC，pepN)[28]和轉(zhuǎn)氨酶(araT,bcaT)[29]相關(guān)基因的表達(dá)。其中轉(zhuǎn)氨酶(bcaT)在BCAAs的合成代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，支鏈酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下可以合成BCAAs，促進(jìn)CodY的調(diào)控作用。作為枯草芽孢桿菌中的通透酶BcaP的遠(yuǎn)親，乳酸乳球菌中的通透酶BcaP 除了對(duì)BCAAs有作用外還對(duì)蛋氨酸有運(yùn)輸作用[30]。

BELITSKY等[31]發(fā)現(xiàn)在基本培養(yǎng)基里枯草芽孢桿菌內(nèi)在的CodY效應(yīng)分子池足夠去調(diào)控一些基因，但是在存在BCAAs和其他氨基酸的培養(yǎng)基里，CodY顯示出最高的活性。因此，BCAAs通透酶的活性和BCAAs攝取的效率對(duì)CodY的激活起著關(guān)鍵的作用。研究表明，有3個(gè)通透酶(BcaP、BraB和BrnQ)作用于異亮氨酸和纈氨酸的高效攝取過(guò)程，同時(shí)失活這3個(gè)通透酶時(shí)對(duì)CodY活性的影響。更多的研究表明，至少有一個(gè)通透酶作用于亮氨酸攝取過(guò)程和異亮氨酸及纈氨酸的運(yùn)輸過(guò)程。編碼寡肽通透酶的基因dtpT，被ScoC直接負(fù)調(diào)控，而CodY通過(guò)抑制ScoC間接激活dtpT基因的表達(dá)[32]。同時(shí)opp操縱子也負(fù)責(zé)編碼一個(gè)寡肽通透酶，與孢子的形成和基因感受態(tài)相關(guān)。研究證明opp直接被CodY和ScoC共同抑制，而不會(huì)被CodY或者ScoC單獨(dú)影響，這種聯(lián)合作用保證了當(dāng)其中一個(gè)調(diào)控因子失去活性的時(shí)候保持對(duì)opp的抑制作用，但是作用會(huì)減弱[32]。

AprE和NprE是枯草芽孢桿菌中兩個(gè)重要的胞外蛋白酶，占總胞外蛋白酶活性的95%以上，它們是由幾個(gè)多效轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控表達(dá)的，包括AbrB、DegU,、ScoC和 SinR。在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中， AprE和NprE僅在指數(shù)期后期大量表達(dá)。CodY是另一個(gè)調(diào)控因子ScoC的抑制子，在缺失codY的菌株中，ScoC的過(guò)表達(dá)很少或不會(huì)對(duì)AprE和NprE產(chǎn)生去阻遏作用；而在含有CodY的菌株中，缺失scoC對(duì)AprE和NprE的表達(dá)沒(méi)有影響，所以CodY通過(guò)限制第二抑制子ScoC的合成間接正調(diào)控AprE和NprE[33]。GIULIA等[34]通過(guò)構(gòu)建vpr-lacZ或者mpr-lacZ融合菌株使CodY結(jié)合位點(diǎn)失活，發(fā)現(xiàn)CodY對(duì)枯草芽孢桿菌中的胞外蛋白酶(Vpr和Mpr)的表達(dá)具有直接負(fù)調(diào)控作用，同時(shí)vpr的啟動(dòng)子不僅受CodY調(diào)控同時(shí)也是sigma H依賴型啟動(dòng)子。在缺失codY的菌株中，Vpr蛋白表達(dá)量顯著提高。同時(shí)，枯草芽孢桿菌中的CodY對(duì)編碼肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Dpp和App)、胞內(nèi)肽酶(DppA)以及胞內(nèi)蛋白酶(IspA)的基因都具有負(fù)調(diào)控作用[35]。

在嗜熱鏈球菌中，調(diào)控因子CodY對(duì)谷氨酸脫氫酶(gdhA)、氨基酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用[38]。

3.3 CodY對(duì)脅迫響應(yīng)的調(diào)控作用

在枯草芽孢桿菌中，Com分泌途徑是蛋白質(zhì)分泌途徑之一，而Com家族和自然感受態(tài)相關(guān)，CodY對(duì)comK具有負(fù)調(diào)控作用[36]。研究發(fā)現(xiàn)CodY的結(jié)合位點(diǎn)也位于乳酸乳球菌中自然感受態(tài)相關(guān)蛋白基因(coiA、comEA、comEC和comGC)的上游[37]，說(shuō)明在細(xì)菌面對(duì)脅迫環(huán)境時(shí)，不僅通過(guò)改變碳、氮代謝來(lái)應(yīng)對(duì)脅迫，也通過(guò)CodY對(duì)自然感受相關(guān)基因的調(diào)控，提高菌體對(duì)外源DNA的攝入，來(lái)獲得有利于應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境的基因，使菌株更好地生長(zhǎng)。

ONUR等[44]利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)通過(guò)堿基替換證實(shí)了乳酸乳球菌中CodY-box與CodY的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CodY基序位于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因、細(xì)胞分裂機(jī)制相關(guān)基因(ddl、murCDFG、mutM、papL、parC、r/minF、rexB、truA和yacB)和嘌呤代謝過(guò)程相關(guān)基因(guaC和purHL)的上游。這說(shuō)明在菌體面對(duì)饑餓環(huán)境時(shí)，為了適應(yīng)惡劣的環(huán)境，CodY對(duì)于細(xì)胞的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)和嘌呤代謝等過(guò)程具有重要的調(diào)控過(guò)程。在嗜熱鏈球菌中，CodY可以抑制雙組分系統(tǒng)(TCS01)的轉(zhuǎn)錄，并調(diào)控與脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如分子伴侶蛋白DnaK以及和氧脅迫、滲透壓脅迫相關(guān)的基因[38]。

3.4 CodY在一些毒力菌株中的調(diào)控作用

調(diào)控因子CodY對(duì)一些有毒力的菌株也具有調(diào)控作用。LOBEL等[39]發(fā)現(xiàn)CodY可以激活李斯特菌的鞭毛生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)菌性黏附，并首次驗(yàn)證了CodY對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性、抗脅迫、毒力相關(guān)功能和適應(yīng)性等生物代謝途徑的調(diào)控作用。TAYLOR等[40]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)relA突變會(huì)引起毒力的喪失，缺失codY后減弱了relA突變帶來(lái)的影響，使毒力功能恢復(fù)，說(shuō)明至少有一個(gè)毒力因子是被CodY調(diào)控的，而relA突變喪失了減弱GTP濃度使CodY活性降低的能力[41]。在梭狀芽胞桿菌、炭疽芽孢桿菌和釀膿鏈球菌中，調(diào)控因子CodY可以間接地激活毒力因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[42-44]。在蠟樣芽孢桿菌中CodY是調(diào)控毒力基因的重要因子，同時(shí)也是ces操縱子的阻遏蛋白[45]。在金黃色葡萄球菌中，當(dāng)菌體處于極度營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)時(shí)，才會(huì)利用codY去限制對(duì)菌株的損害，缺失codY的菌株會(huì)發(fā)生毒力基因，蛋白酶等的去阻遏作用，激活下游基因的表達(dá)[46]。

在蘇云金芽孢桿菌中，調(diào)控因子CodY也可以調(diào)控蘇云金芽孢桿菌孢子的形成、聚-β-羥基丁酸酯的生物合成、菌體生長(zhǎng)、基因的自然感受和翻譯過(guò)程。QI等[47]通過(guò)細(xì)菌單雜交和凝膠遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌中自然感受基因comEA基因含有一個(gè)保守的10bp大小的CodY結(jié)合位點(diǎn)(TTTCAGAAAA)，這說(shuō)明CodY可以直接調(diào)控“com”基因。研究發(fā)現(xiàn)CodY通過(guò)控制調(diào)控因子PlcR的信號(hào)肽PapR的輸入對(duì)PlcR調(diào)控的毒力基因進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)發(fā)現(xiàn)OppA不是PapR識(shí)別的唯一底物結(jié)合蛋白，還有其他類似于OppA的蛋白對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行運(yùn)輸[48]。

4 總結(jié)與展望

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY具有非常重要的調(diào)控作用，可正向和負(fù)向?qū)ο嚓P(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行直接調(diào)控或間接調(diào)控，從而控制細(xì)菌的生長(zhǎng)活動(dòng)。GTP和BCAAs作為CodY的兩個(gè)效應(yīng)分子，可以幫助細(xì)胞感受營(yíng)養(yǎng)和能量狀態(tài)，從而促進(jìn)CodY對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用。通過(guò)和這兩個(gè)效應(yīng)分子結(jié)合，CodY發(fā)生二聚作用并被激活，從而結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū)域的一段共同回文序列上發(fā)揮調(diào)控作用。作為全局調(diào)控因子，CodY對(duì)細(xì)菌的碳代謝、氮代謝、支鏈氨基酸代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、運(yùn)動(dòng)功能、趨藥性、致病性、大分子的降解、芽孢形成、抗生素的合成、毒力，環(huán)境適應(yīng)以及自然感受態(tài)等相關(guān)基因都具有調(diào)控作用。

細(xì)菌體內(nèi)的CodY和其他調(diào)控因子共同發(fā)揮作用組成了細(xì)菌體內(nèi)的聯(lián)合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如全局調(diào)控因子AbrB，基因citB和citZ的抑制子CcpC，碳代謝的調(diào)控因子CcpA[25]，以及自然感受相關(guān)基因ComK[49]。然而，CodY和其他調(diào)控因子之間形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需要進(jìn)一步探究。CodY對(duì)CRISPR/Cas系統(tǒng)也具有調(diào)節(jié)作用[38]，但是相關(guān)機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。由于CodY對(duì)菌株自然感受相關(guān)基因也具有調(diào)控作用，所以通過(guò)研究CodY和自然感受之間的調(diào)控機(jī)制對(duì)構(gòu)建耐受性菌株也具有一定的價(jià)值。同時(shí)通過(guò)對(duì)CodY對(duì)毒力因子的調(diào)控作用機(jī)制研究，為定向改造毒力菌株也提供了一定的參考。CodY的深入研究有助于全面了解細(xì)菌在面對(duì)營(yíng)養(yǎng)匱乏環(huán)境時(shí)的作用機(jī)制，為利用基因工程改造技術(shù)獲得適用于食品和發(fā)酵工業(yè)中的菌株奠定基礎(chǔ)。

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Advances in research on global regulatory factor CodY of probiotics

FENG Jia, WU Hao, WANG Bin-bin, QIAO Jian-jun*

(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

CodY is a highly conserved global regulator of transcription in most Gram-positive bacteria. Studies onBacillussubtilisandLactococcuslactisand other probiotics show that CodY-regulated genes are involved in carbon or nitrogen metabolism, environmental stress responses, absorption of nutrients, genetic competence and other relevant processes. The structure, regulatory mechanisms and binding sites of CodY are summarized in this article, which may provides effective reference for further exploration of the potential regulatory functions of CodY and manufacture and modification of probiotics.

CodY; regulator; Gram-positive bacteria; probiotics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610037

碩士研究生(喬建軍教授為通訊作者,E-mail：jianjunq@tju.edu.cn)。

2016-04-05，改回日期：2016-05-11