生物轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸植物乳桿菌的篩選及特性研究

楊芹，楊波，劉李至，陶瑞，陳永泉，陳衛(wèi)，陳海琴

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

?

生物轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸植物乳桿菌的篩選及特性研究

楊芹，楊波，劉李至，陶瑞，陳永泉，陳衛(wèi)，陳海琴

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid，CLNA)是一類具有抗癌、降脂減肥、抗炎等生理功能的活性物質(zhì)，為了得到高產(chǎn)或具有生物轉(zhuǎn)化CLNA性能的生物合成體系，采用GC-MS分析方法檢測了31株不同來源的植物乳桿菌的脂肪酸組成，篩選得到8種可以高效轉(zhuǎn)化亞麻酸至共軛亞麻酸的菌株?；贕C-MS分析結(jié)果，對其中1株高產(chǎn)共軛亞麻酸的植物乳桿菌CCFM261的轉(zhuǎn)化特性進行了研究。結(jié)果表明，植物乳桿菌CCFM261對亞麻酸的轉(zhuǎn)化率高于50%，所得產(chǎn)物存在3種異構(gòu)體(CLNA1，CLNA2，CLNA3)，大部分以游離脂肪酸的形式存在于發(fā)酵液中，總含量可達到0.186 0 mg/mL。菌體中也積累了一定量的結(jié)合狀態(tài)的CLNA。產(chǎn)物以CLNA1和CLNA2為主，比例約為2∶1，占總共軛亞麻酸含量的90%以上。經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，確定CLNA1和CLNA2分別為生物活性較高的c9,t11,c15-CLNA和t9,t11,c15-CLNA。

亞麻酸；共軛亞麻酸；GC-MS；植物乳桿菌；生物轉(zhuǎn)化

共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid，CLNA)是亞麻酸(linolenic acid，LNA)衍生而來具有共軛雙鍵的十八碳三烯酸多種位置與構(gòu)型異構(gòu)體的總稱，它具有多種營養(yǎng)和保健功能，能夠抗癌、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、降低體脂含量、胰島素抵抗、調(diào)節(jié)機體免疫等，已成為醫(yī)學(xué)、化學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點[1-2]。在共軛亞麻酸的各種異構(gòu)體中，c9,t11,c15-CLNA(CLNA1)、t9,t11,c15-CLNA(CLNA2)、t10,c12,c15-CLNA和c6,c9,t11-CLNA等是被認為最具生物活性的異構(gòu)體。

自然界的一些植物種子諸如石榴籽、油桐籽、苦瓜籽、金盞花籽、栝樓和藍花楹籽等均富含共軛亞麻酸[3-4]，但僅栝樓籽可直接食用，且由于植物種籽中的油脂成分很復(fù)雜，實現(xiàn)共軛亞麻酸的分離與純化十分困難。目前可通過堿處理亞麻酸異構(gòu)化而成，但產(chǎn)率較低，以6.6%的氫氧化鉀/乙二醇作催化劑時，CLNA的產(chǎn)率僅為17.0%，且有溶劑殘留[5-6]。目前國外有一些學(xué)者報道微生物轉(zhuǎn)化CLNA的能力，HENNESSY等[7]和GORISSEN等[8]研究表明雙歧桿菌、乳桿菌、丙酸桿菌等多種菌株可生物轉(zhuǎn)化合成共軛亞麻酸，最高轉(zhuǎn)化率可達80%，其中c9,t11,c15-CLNA，t9,t11,c15-CLNA兩種活性異構(gòu)體在乳酸菌轉(zhuǎn)化的CLNA中所占比例達90%以上[9]。

乳酸菌轉(zhuǎn)化所產(chǎn)的共軛亞麻酸，單體較唯一，轉(zhuǎn)化率高，且產(chǎn)物絕大多數(shù)都在發(fā)酵液，易于實現(xiàn)后期的分離純化，因此，生物法與化學(xué)法相比具有選擇性合成生物活性CLNA的優(yōu)點，更適合后期的綜合利用。

本研究通過對一系列不同來源的植物乳桿菌進行GC-MS脂肪酸分析，篩選能夠生物轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的菌株，并對高產(chǎn)共軛亞麻酸的菌株轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的特性進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：α-亞麻酸(LNA)購自Sigma-Aldrich，三甲基硅烷化重氮甲烷購自上海百靈威科技有限公司，其他試劑均為普通分析純或色譜純,購自國藥集團。

主要儀器：GCMS-QP2010 Ultra SYSTEM氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津；ND100-2氮吹儀，四川匯巨儀器設(shè)備有限公司；GRP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；ST40R型冷凍離心機，Thermo Scientific。

1.2 樣品準備與取樣

實驗所使用的菌株來自江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫，MRS培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

將植物乳桿菌劃線于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化3代。將活化好的菌液按照1%接種量接種至含LNA(30 mg/mL，含2% Tween-20)的10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h。分別取其發(fā)酵液及菌體檢測其脂肪酸組成，以篩選具有轉(zhuǎn)化生成LCNA性能的菌株。

另以植物乳桿菌CCFM261為對象，在與上述相同條件下活化，添加不同濃度的LNA (0.1，0.3，0.5，1.0 mg/mL)于MRS培養(yǎng)基，在37 ℃下分別培養(yǎng)0，12，24，48，72 h，分析發(fā)酵液和菌體的脂肪酸，監(jiān)測共軛亞麻酸在該菌生長歷程中的最佳轉(zhuǎn)化時間。

1.3 樣品處理

將培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)移至離心管，5 000 r/min，離心5 min；取發(fā)酵液1.5 mL四份及對應(yīng)5 mL發(fā)酵液的菌體4份用于脂肪酸的提取分析。菌體分別用2 mL 鹽溶液(0.137 mol/L NaCl; 7.0 mmol/L K2HPO4; 2.5 mmoL/L KH2PO4)洗滌，4 000 r/min離心5 min；重復(fù)2次。

1.3.1 游離脂肪酸提取及甲酯化處理

發(fā)酵液：取2份發(fā)酵液，加入35 μL全氘代十八碳酸(d35C18∶0，2.058 mg/mL)作為內(nèi)標，后添加2 mL異丙醇，充分振蕩；再添加3 mL正己烷，充分振蕩；5 000 r/min，離心3 min，取正己烷層，用氮氣吹干。

菌體：將菌體重懸于2 mL 鹽溶液中，加入d35C18∶0作為內(nèi)標，按上發(fā)酵液相同的方法進行脂肪酸提取及氮氣吹干。

甲酯化：將上述脂肪酸提取物用400 μL甲醇復(fù)溶，添加適量重氮甲烷進行甲酯化，氮氣吹干后用500 μL正己烷溶解，13 000 r/min離心10 min取上清，進行GC/MS分析。

1.3.2 總脂肪酸提取及甲酯化處理

取發(fā)酵液和菌體各2份，加入d35C18∶0作為內(nèi)標，凍干。殘渣加入1 mL 0.5 mol/L NaOH-MeOH于100 ℃加熱5 min，冷卻后加入1 mL 14% BF3-MeOH仍置于100 ℃加熱5 min。冷卻，加入1 mL飽和NaCl溶液，分別以1 mL正己烷萃取2次，氮氣吹干后用500 μL正己烷溶解，13 000 r/min離心10 min取上清，進行GC/MS分析。

1.4 GC-MS檢測

島津氣相色譜儀(GC 2010 plus)，氣相柱Rtx-Wax(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，質(zhì)譜儀(島津Ultra QP2010)。程序升溫條件：初始150 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持10 min，后以4 ℃/min升溫至240 ℃，保持10 min。采用分流進樣，進樣量為1 μL，分流比10∶1，氦氣為載氣。進樣器溫度和檢測器溫度均為240 ℃。離子源220 ℃，強度為70 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的情況

實驗分析評估了31株植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力，具體菌株信息見表1。在確定底物LNA的添加量時，考慮到較高濃度的游離脂肪酸對細菌的生長具有一定的毒害或抑制作用，而且COAKLEY等人[10]也發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌(B.breve)對亞油酸的耐受量為0.2～1.5 mg/mL，我們比較了目標菌株CCFM261在分別添加0.1，0.3，0.5和1.0 mg/mL亞麻酸的培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)以及底物的消耗量與產(chǎn)物的生成量的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著底物LNA濃度的升高，目標產(chǎn)物CLNA的含量呈上升趨勢，但在底物添加量大于0.3 mg/mL時，產(chǎn)物的生成漸趨平緩且菌體對底物的利用率顯著降低(圖1)，綜合考慮高濃度游離脂肪酸對菌體生長的影響，本實驗中底物的添加量確定為0.3 mg/mL。

圖1 底物添加量對CCFM261生物轉(zhuǎn)化CLNA能力的影響Fig.1 Effect of the substrate concentration on the fatty acid conversion of CCFM261

發(fā)酵液的脂肪酸GC-MS分析結(jié)果顯示，植物乳桿菌CCFM78、CCFM174、CCFM177、CCFM179、CCFM181、CCFM183、CCFM240、CCFM261可將10%以上的底物轉(zhuǎn)化為共軛亞麻酸，可認為具有生物轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的潛力，其中植物乳桿菌CCFM78、CCFM240、CCFM261可將超過30%的亞麻酸轉(zhuǎn)化為共軛亞麻酸，為高產(chǎn)菌株。但在CCFM166、CCFM169、CCFM170、CCFM188、CCFM307中未檢測到任何CLNA的異構(gòu)體，認定這幾株菌不具備轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力(表1)。

從菌株的來源上看，源自泡菜的植物乳桿菌普遍具備轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的潛力。而來源于酸粥的植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力較弱，這可能與這些菌株的生活史中接觸到底物的可能性有關(guān)聯(lián)。

表1 在含LNA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后發(fā)酵液的脂肪酸組成

注：CCFM：江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫；CLNA1：c9,t11,c15-CLNA；CLNA2：t9, t11,c15-CLNA；N.D.：未檢出。

2.2 植物乳桿菌CCFM261轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸

所有的實驗菌株中，植物乳桿菌CCFM261屬于高產(chǎn)共軛亞麻酸的優(yōu)良菌株，在本實驗中被選作后續(xù)工作的研究對象，進一步探討植物乳桿菌轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸菌株的一些相關(guān)共性問題。由圖2(a)可知，植物乳桿菌CCFM261在含有α-LNA的MRS中生長時主要的代謝產(chǎn)物為CLNA1, 2, 3。圖2(b)表明，植物乳桿菌CCFM261對α-LNA的代謝始于菌體培養(yǎng)12 h后，隨著菌體生長共軛亞麻酸的含量逐漸增加 (24 h、36 h)，在48 h左右達到最高值，此時CLNA的總含量約為0.186 0 mg/mL。植物乳桿菌CCFM261轉(zhuǎn)化α-LNA的主要產(chǎn)物是CLNA1 和CLNA2，二者約占總CLNA的90%，以前者為主，且二者在菌體生長達穩(wěn)態(tài)時的比例約為2∶1。

圖2 植物乳桿菌CCFM261在添加LNA的MRS中生長0 h和72 h的色譜圖 (a)及發(fā)酵液中CLNA各異構(gòu)體隨時間的變化(b)Fig.2 GCMS chromatograms CCFM261 in LNA spiked MRS at 0 h and 72h (a), and contents of CLNAs in CCFM261 ferment at different fermentation time (b)

從圖2(b)我們還可以看出，植物乳桿菌CCFM261對CLNA1, 2, 3三個異構(gòu)體的積累也存在先后秩序，分別是含量最高的CLNA1最先達到平衡，其次是含量次之的CLNA2和CLNA3。此外，圖2(b)也表明在植物乳桿菌CCFM261培養(yǎng)36 h后，CLNA各異構(gòu)體之間存在著轉(zhuǎn)化，即 CLNA1含量逐漸減少，而CLNA2和CLNA3的含量增加。

從培養(yǎng)72 h后植物乳桿菌CCFM261發(fā)酵液及菌體脂肪酸組成可以發(fā)現(xiàn)，菌株內(nèi)仍有部分LNA尚未被轉(zhuǎn)化，而所轉(zhuǎn)化的CLNA絕大多數(shù)在發(fā)酵液，但菌體內(nèi)仍留有少量的CLNA異構(gòu)體，3種異構(gòu)體在發(fā)酵液與菌體內(nèi)的分布情況基本一致(圖3)。為了推斷植物乳桿菌CCFM261生成的CLNA在菌體內(nèi)的分布情況以及存在形式，我們采用了兩種脂肪酸甲酯化方法同時分析發(fā)酵液及菌體的脂肪酸組成。采用皂化-酸催化甲酯化的方法用NaOH-MeOH及BF3-MeOH對發(fā)酵液和菌體中的游離以及結(jié)合的脂肪酸進行衍生(圖3：FA in Pellets/Supernatant)，然后取平行樣品采用只能對游離脂肪酸進行甲酯化的重氮甲烷的方法分析菌體及發(fā)酵液中的游離脂肪酸(圖3：FFA in Pellets/Supernatant)。結(jié)果表明，就整體而言，發(fā)酵液中的CLNA含量最高，以游離的形式存在，該結(jié)果與植物乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸類似，即絕大多數(shù)的產(chǎn)物均不在胞內(nèi)積累，而是被轉(zhuǎn)運至胞外。其次，菌體中也積累了一定量的CLNA，主要以結(jié)合脂質(zhì)的形式存在。CLNA在植物乳桿菌CCFM261體系中的這種分布模式一方面符合常規(guī)情況下脂質(zhì)在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)，另一方面也為最終的產(chǎn)物分離純化工作提供了便利，是采用生物技術(shù)制備共軛亞麻酸的又一優(yōu)勢。

圖3 植物乳桿菌CCFM261發(fā)酵體系中各脂肪酸的分布：FA in Supernatant/Pellets：發(fā)酵液和菌體中結(jié)合形式和游離形式的各脂肪酸含量；FFA in Supernatant/Pellets：發(fā)酵液和菌體中游離形式的各脂肪酸含量Fig.3 Distribution of FAs in CCFM261: FA in Supernatant/Pellets: content of both incorporated and free fatty acids in ferment or pellet; FFA in Supernatant/Pellets: content of free fatty acids in ferment or pellet

從植物乳桿菌CCFM261培養(yǎng)液與菌體中的共軛亞麻酸總量來看植物乳桿菌CCFM261的轉(zhuǎn)化率為56%，為高產(chǎn)菌株。根據(jù)GC-MS所得碎片及共軛亞麻酸可能的異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，與文獻中[9]進行比對可以確定，本工作中的CLNA1即為c9,t11,c15-CLNA，CLNA2為t9,t11,c15-CLNA，但CLNA3中雙鍵位置及順反異構(gòu)等尚待確定。從植物乳桿菌CCFM261所轉(zhuǎn)化的各異構(gòu)體含量來看，主要產(chǎn)物是c9,t11,c15-CLNA和t9,t11,c15-CLNA兩種異構(gòu)體，其中以c9,t11,c15-CLNA為主體，約占總CLNA含量的60%。從植物乳桿菌CCFM261的培養(yǎng)液與菌體的脂肪酸組成來看，所產(chǎn)生的共軛亞麻酸異構(gòu)體絕大部分都在發(fā)酵液中。

3 結(jié)論

本研究從不同來源的31株植物乳桿菌中成功篩選到8株具有可生物轉(zhuǎn)化LNA產(chǎn)CLNA能力的菌株，其中以植物乳桿菌CCFM261的性能為優(yōu)。進一步研究發(fā)現(xiàn) 植物乳桿菌CCFM261對底物亞麻酸的轉(zhuǎn)化率可達56%，所產(chǎn)生的CLNA主要以游離的形式存在于發(fā)酵液中，極利于產(chǎn)物的后期分離與應(yīng)用。植物乳桿菌CCFA261轉(zhuǎn)化的CLNA主要為生物活性較高的c9,t11,c15-CLNA和t9,t11,c15-CLNA，可達總CLNA量的90%以上。

鑒于上述結(jié)果，該植物乳桿菌CCFA261菌株可作為生產(chǎn)CLNA的生物合成系統(tǒng)，在采用生物技術(shù)手段生產(chǎn)共軛亞麻酸領(lǐng)域具有較大的開發(fā)應(yīng)用前景。同時，從CLNA及益生菌對人體健康的改善與調(diào)節(jié)功能出發(fā)，將某些益生菌的抗癌活性與它們轉(zhuǎn)化共軛亞麻酸的能力相關(guān)聯(lián)是非常具有研究價值和市場潛力的。

[1] KRIS-ETHERTON P M, HECKER K D, BINKOSKI A E. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular health[J]. Nutrition Reviews, 2004, 62(11): 414-426.

[2] ROBINSON L E, BUCHHOLZ A C, MAZURAK V C. Inflammation, obesity, and fatty acid metabolism: influence of n-3 polyunsaturated fatty acids on factors contributing to metabolic syndrome[J]. Applied Physiology Nutrition and Metabolism-Physiologie Appliquee Nutrition Et Metabolisme, 2007, 32(6): 1 008-1 024.

[3] KOHNO H, YASUI Y, SUZUKI R, et al. Dietary seed oil rich in conjugated linolenic acid from bitter melon inhibits azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis through elevation of colonic PPAR gamma expression and alteration of lipid composition[J]. International Journal of Cancer, 2004, 110(6): 896-901.

[4] YASUI Y, HOSOKAWA M, SAHARA T, et al. Bitter gourd seed fatty acid rich in 9c,11t,13t-conjugated linolenic acid induces apoptosis and up-regulates the GADD45, p53 and PPAR gamma in human colon cancer Caco-2 cells[J]. Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 2005, 73(2): 113-119.

[5] IGARASHI M, MIYAZAWA T. Preparation and fractionation of conjugated trienes from alpha-linolenic acid and their growth-inhibitory effects on human tumor cells and fibroblasts[J]. Lipids, 2005, 40(1): 109-113.

[6] IGARASHI M, MIYAZAWA T. Newly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells[J]. Cancer Letters, 2000, 148(2): 173-179.

[7] HENNESSY A A, ROSS R P, DEVERY R, et al. The Health Promoting Properties of the Conjugated Isomers of alpha-Linolenic Acid[J]. Lipids, 2011, 46(2): 105-119.

[8] GORISSEN L, RAES K, WECKX S, et al. Production of conjugated linoleic acid and conjugated linolenic acid isomers byBifidobacteriumspecies[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87(6): 2 257-2 266.

[9] HENNESSY A A, BARRETT E, ROSS R P, et al. The production of conjugated alpha-linolenic, gamma-linolenic and stearidonic acids by strains ofBifidobacteriaandPropionibacteria[J]. Lipids, 2012, 47(3): 313-327.

[10] COAKLEY M, ROSS R P, NORDGREN M, et al. Conjugated linoleic acid biosynthesis by human-derivedBifidobacteriumspecies[J]. Journal of Applied Microbiology, 2003, 94(1): 138-145.

The production of conjugated linolenic acid by Lactobacillus plantarum

YANG Qin, YANG Bo, LIU Li-zhi, TAO Rui, CHEN Yong-quan, CHEN Wei, CHEN Hai-qin*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Conjugated linolenic acids (CLNAs) are a class of fatty acids that possess potential biological activity such as anti-carcinogensis, anti-adipogenesis, anti-inflammation and can be produced microbially by a series of bacteria. Gas chromatography mass spectrometry analyses were performed to acquire the fatty acid profiles of 31 strains ofLactobacillusplantarumand the data were used to assess their ability of CLNA accumulation during linolenic acid (LNA) spiked fermentation. 8 strains shown great probability of converting LNA to CLNA and CCFM261, a strain newly isolated from pickled vegetable, was found to be the best CLNA producer. Detailed investigation of the LNA-CLNA bio-converting property of CCFM261 unveiled that more than 50% of the LNA was converted to its conjugated isomers (CLNA1, CLNA2, CLNA3). The accumulation of CLNAs in CCFM261 started 12 h after the culturation and saturated at about 48 h with a final concentration of 0.1860 mg/mL in ferment. 90% of the CLNA isomers were CLNA1 and CLNA2 which accumulated at a ratio of 2∶1 and were identified asc9,t11,c15-CLNA andt9,t11,c15-CLNA by MS spectrum.

linolenic acid;conjugated linolenic acid; GC-MS;Lactobacillusplantarum; conversion

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610006

博士(陳海琴教授為通訊作者，E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(31571810)

2016-03-29，改回日期：2016-04-22