一株抗木霉菌解淀粉芽孢桿菌的篩選與鑒定

努爾孜亞，管建華，賈培松，魏鵬，羅影，賈文捷，郝敬吉吉，3

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2. 青河縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆青河 836200；3. 中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，北京 100193)

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一株抗木霉菌解淀粉芽孢桿菌的篩選與鑒定

努爾孜亞1，管建華2，賈培松1，魏鵬1，羅影1，賈文捷1，郝敬吉吉1，3

(1. 農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，烏魯木齊 830091；2. 青河縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，新疆青河 836200；3. 中國農(nóng)業(yè)大學生物學院，北京 100193)

【目的】將一株從阜康市食用菌栽培基地棉籽殼發(fā)酵料中的分離得到的芽孢桿菌FKB-1，依據(jù)形態(tài)學與16S rDNA序列比對明確其分類地位。【方法】采用對峙平板法進行初篩、復(fù)篩，然后利用抑菌圈法測定抑菌效果，并鏡檢菌絲生長情況。通過形態(tài)學觀察，生理生化及16S rDNA 基因序列對比分析研究其分類地位?！窘Y(jié)果】生防細菌FKB-1對綠色木霉菌具有穩(wěn)定的抑菌效果，抑菌直徑率達57%；同時16S rDNA序列比對結(jié)果顯示其為解淀粉芽孢桿菌?！窘Y(jié)論】FKB-1是一株抗木霉菌的生防解淀粉芽孢桿菌。

解淀粉芽孢桿菌；綠色木霉菌；抑菌作用；生理生化

0 引 言

【研究意義】 蘑菇綠霉病又稱木霉病，可對阿魏蘑菇、雙孢蘑菇等多種食用菌菌絲與子實體造成危害，木霉是一類普遍存在的真菌，常見于土壤中，是土壤微生物的重要群落，也見于植物殘體及動物糞便上，從植物根圍，葉圍及種子、球莖表面經(jīng)?？梢苑蛛x到[1-3]?！厩叭搜芯窟M展】木霉可侵染阿魏蘑菇、雙孢蘑菇、香菇、銀耳、杏鮑菇、毛木耳、靈芝等多種食用菌，各種食用菌的菌種、菌筒、栽培料和子實體上均可發(fā)病，如阿魏菇受害后菌柄和菌蓋背面變褐腐爛，病部產(chǎn)生綠色霉層；食用菌早期染病的子實體萎縮不長，后期感染的子實體逐漸腐爛，產(chǎn)量損失巨大[4]。常見的病原菌是綠色木霉菌(TrichodermaviridePers.)。廣泛存在于阿魏蘑菇等食用菌生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)，是食用菌生產(chǎn)和袋料栽培的一種重要的競爭性病害。其分解纖維素能力強，不僅與阿魏菇等蘑菇爭奪營養(yǎng)，而且還分泌毒素影響蘑菇菌絲的定植及子實體的形成。分生孢子通過氣流、水滴、昆蟲等傳播擴散，高溫高濕有利該病害的發(fā)生[5]。防治綠霉病傳統(tǒng)的主要方法是培養(yǎng)料中拌入化學藥劑。但是這種方法不僅帶來環(huán)境污染，同時也威脅著人類健康。隨著化學農(nóng)藥的使用，病原菌抗藥性不斷增加，使防效降低。近年來。生物農(nóng)藥具有成本低，無污染，無殘留，不產(chǎn)生抗藥性等與傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥相比較的優(yōu)點[6]，被廣大生產(chǎn)者認同?！颈狙芯壳腥朦c】目前關(guān)于生防菌株的研究主要是生防細菌包括芽孢桿菌、土壤放射桿菌、假單孢桿菌等。芽孢桿菌屬中的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)抑菌廣譜性強，對炭疽病(Anthracnose.spp )[7]、青霉病(Penicilliumitalicum)[8]、柑桔青霉菌(Penicilliumdigitatum)[9]等都有抑制作用，因此在生物防治中有廣闊的應(yīng)用前景?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究室從阿魏蘑菇培養(yǎng)料中采用抑菌實驗法篩選鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌。利用對峙平板法，菌絲鏡檢等證明其抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

FKB-1篩選自阜康市魚兒溝3隊阿魏蘑菇栽培基地棉籽殼發(fā)酵料中。

木霉病菌株(T.viride),由新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(固體)：胰化蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，水1 000 mL ，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基(固體)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2 方 法

1.2.1 菌株初篩

將1 g棉籽殼加入100 mL 蒸餾水中，制備懸濁液，分別稀釋獲得濃度為10-6，10-7，10-8(W/V)的樣品溶液，分別移取0.1 mL 涂布于固體初篩培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株復(fù)篩

以對峙平板法復(fù)篩[10]，從上述初篩平板上挑取形態(tài)不同的菌落在木霉病菌瓊脂塊的一側(cè)劃線，以不劃線的作為對照組，培養(yǎng)4 d , 測其抑菌率。

抑菌率(%)=[(對照組木霉菌直徑-處理木霉菌直徑)/對照組木霉菌直徑]×100%。

1.2.3 形態(tài)學特性

將有抑菌效果的菌株接種于固體初篩培養(yǎng)基平板中，27℃培養(yǎng)，觀察單菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)特征。采用革蘭氏染色法，觀察菌體形狀、革蘭氏染色反應(yīng)。

1.2.4 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》等相關(guān)內(nèi)容[11-13]，菌株對應(yīng)生理生化進行驗證。測定項目包括：革蘭氏染色，生長溫度測定，甲基紅，淀粉水解，明膠液化，厭氧性測定，葡萄糖、甘露醇產(chǎn)酸，V-P測定，過氧化氫酶，氧化酶, 菌落顏色等。

1.2.5 菌株的分子生物學鑒定

采用酚氯仿抽提法提取菌株的DNA。以16S rDNA 引物進行PCR 擴增。Forward primer P1(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)；Reverse primerP2(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。擴增反應(yīng)體系25 uL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.0 uL，MgCl22 mmol/L,dNTPs 400 mmol/L,ITS4,ITS5為0.8 umol,模版DNA 50 ng，TaqDNA聚合酶1U。PCR反應(yīng)條件：105℃預(yù)熱，94℃ 5 min；94℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 1 min,35個循環(huán)；72℃ 10 min, 擴增產(chǎn)物于4℃保存。檢測后送北京鼎國公司測序。PCR 產(chǎn)物測序，與NCBI 進行BLAST 比對[9]，并以MEGA6軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

拮抗菌FKB-1的鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]、《伯杰細菌鑒定手冊》[15]及《分子克隆實驗指南》[16]的方法對拮抗菌F1 的菌體形態(tài)、生理生化指標進行測定及16S rDNA 測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

在營養(yǎng)瓊脂板上菌落為圓形，乳白色，表面初始光澤，幾天后變?yōu)轳薨?，邊緣翹起。平板中可獲得直徑為5 mm 的菌落，如圖1(A)。通過革蘭氏染色驗證為革蘭氏陽性，菌體呈現(xiàn)橢圓形，兩端紫色，中間較透明，如圖1(B)(10×100oil)。圖1

圖1 FKB-1菌落形態(tài)及菌體革蘭氏染色

2.2 抑菌效果驗證

2.2.1 抑菌效果的平板驗證

通過對峙平板法檢驗FKB-1的抑菌效果，其抑菌率為57%。圖2

圖2 FKB-1對木霉菌的抑菌效果

2.2.2 抑菌效果的鏡檢

研究表明，正常菌絲(B)粗壯，孢子濃密，有明顯的孢子束。受抑制的菌絲(A)出現(xiàn)彎曲、褶皺、斷裂、畸形等現(xiàn)象，且沒有孢子囊和孢子束。因細胞膜通透性的增加，細胞質(zhì)基質(zhì)外流，使菌絲明顯變細，并影響染色效果。圖3

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化結(jié)果

FKB-1的部分生理生化特征表現(xiàn)為，菌株不能厭氧生長，生長溫度范圍5～50℃，最適生長溫度30～37℃。甲基紅反應(yīng)陰性，V-P反應(yīng)陰性。能分解葡萄糖、甘露醇、水解淀粉、明膠等。過氧化氫酶陽性、氧化酶陰性，革蘭氏染色呈陽性，菌落乳白色。表1

圖3 FKB-1對木霉菌菌絲作用顯微形態(tài)(10×40)

2.3.2 FKB-1菌株的16S rDNA鑒定

FKB-1菌株經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像。測序結(jié)果表明，擴增的16S rDNA序列全長1 190 bp。將序列提交GenBank經(jīng)與GenBank中相關(guān)基因序列進行同源性比對，菌株FKB-1與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的DNA 重合率100%同源性達到99%。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，供試菌16S rDNA與解淀粉芽孢桿菌親緣最近。鑒定結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacien)。表1，圖3～5

圖4 FKB-1菌株的16S rDNA PCR擴增電泳結(jié)果

特征CharacteristicsFKB-1特征CharacteristicsFKB-1厭氧生長Anaerobiccondition-生長溫度/℃Growthtemperature5～50℃-甲基紅M．Rreaction-V-P反應(yīng)V-Preaction-葡萄糖產(chǎn)酸Acidroductionfromglucose+甘露醇產(chǎn)酸AcidproductionfromMannito+淀粉水解Starchhydrolysis+明膠液化試驗Glutinhydrolysis+過氧化氫酶Peroxidase+氧化酶Oxidase-革蘭氏染色Grams-staining陰性(G-)陽性(G+)G+菌落顏色Colorofcolony乳白色

注：“ + ”陽性反應(yīng)(表示存在或有反應(yīng)) ,“ - ”陰性反應(yīng)(表示不存在或無反應(yīng))

Note:“ + ”Positive ( show existence or reaction) ， “ -”Negative ( show no existence or no reaction)

表2 FKB-1菌株同源性分析

圖5 FKB-1菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討 論

自Baker 等1965 年提出生物防治土傳病害以來，關(guān)于利用生防菌防治植物生長病害的報道屢見不鮮[17]。相對于食用菌競爭性雜菌綠色木霉菌生物有抑制作用的生防細菌的報道相對較少。實驗室從阜康市篩選出一株對綠色木霉病的拮抗菌。通過形態(tài)學、16S rDNA 鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。根據(jù)抑菌效果推測，解淀粉芽孢桿菌可分泌多種抑菌物質(zhì)，引致綠色木霉菌菌絲的細胞壁改變結(jié)構(gòu)，增加細胞膜通透性，導(dǎo)致細胞質(zhì)基質(zhì)外流，使受抑制的木霉病菌絲無法完成菌絲生長、孢子萌發(fā)等代謝過程，最終死亡。

芽孢桿菌作為生防細菌的重要組成部分，解淀粉芽孢桿菌抑菌機理復(fù)雜，利用生防菌防治植物病害，不但要考慮生防菌對病原菌的抑制作用，而且還要考慮生防菌在農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中的生存能力[18]。解淀粉芽孢桿菌在自然界中分布十分廣闊。同時能夠?qū)Χ喾N真菌與細菌產(chǎn)生抑制作用，并且具有豐富的自身代謝產(chǎn)物。 因此在生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可以適當?shù)拇鎮(zhèn)鹘y(tǒng)的化學農(nóng)藥。同時，隨著分子研究技術(shù)的提高．解淀粉芽孢桿菌的基因功能更多地被了解，增加可應(yīng)用的可行性。

4 結(jié) 論

采自阜康市棉籽殼基料中，利用對峙平板法篩選出的一株對木霉病有拮抗作用的芽孢桿菌FKB-1菌株。通過形態(tài)學鑒定與主要生理生化指標測定結(jié)合16S rDNA檢測，該菌株菌落為圓形，乳白色，表面初始光澤，幾天后變?yōu)轳薨?，通過革蘭氏染色驗證為革蘭氏陽性，菌體呈現(xiàn)橢圓形，兩端紫色，中間較透明。擴增的16S rDNA序列全長1 190 bp，同源性比對認為解淀粉芽孢桿菌。抑菌圈法的結(jié)果顯示，其對綠色木霉菌的抑菌率為57%，鏡檢菌絲可以觀察到受抑制的菌絲出現(xiàn)彎曲、褶皺、斷裂、畸形等現(xiàn)象，且沒有孢子囊和孢子束。因細胞膜通透性的增加，細胞質(zhì)基質(zhì)外流，使菌絲明顯變細，并影響染色效果。證明其有良好的抑菌效果。

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Fund project:Supported by The Construction Project of Science and Technology Infrastructure in Xinjiang Uygur Autonomous Region "The wild Germplasm Resources and Genetic Diversity of Pleurotus Preservation Research Platform Construction" (PT1505)and Special Funds for National Modern Agriculture Industry Technology System Construction (CARS-24)

Screening Identification of Bacillus amyloliquefaciens Resisting to Trichoderma Viride

Nuerziya1, GUAN Jian-hua2, JIA Pei-song1, WEI Peng1, LUO Ying1,JIA Wen-jie1, HAO Jing-zhe1 ,3

(1.Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Oasis, MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；2.QingheCountyAgriculturalTechnologyExtensionStation,QingheXinjiang836200，China; 3.CollegeofBiologicalSciences，ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100193,China)

【Objective】 In order to study the bio-control bacteria FKB-1 screened from cottonseed hull of the Experimental Station of edible fungus in Fukang City. Morphological and 16S rDNA sequence alignment were used to identify its species.【Method】he plate-confrontation method and antibacterial circle method were used for preliminary screening and antimicrobial testing in vitro, respectively. Meanwhile, we identified its species by physiological and biochemical characteristics, as well as 16S rDNA gene sequence alignment.【Result】FKB-1 showed a stable inhibitory effect againstTrichodermavirideand inhibition zone diameter was 57%. This bacterium was identified asBacillusamyloliquefaciens.【Conclusion】FKB-1 was a kind of bacillus amyloliquefaciens with bio-control to Trichoderma viride.

Bacillusamyloliquefaciens;Trichodermaviride; inhibition effect; physiological and biochemical characteristics

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.017

2016-03-15

野生阿魏菇種質(zhì)資源保藏與遺傳多樣性研究平臺建設(shè)(PT1505)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-24)

努爾孜亞(1977-)，女，新疆伊犁人，助理研究員，研究方向為阿魏菇種質(zhì)資源保藏與病蟲害防控，(E-mail)823037554@qq.com

郝敬喆(1970-)，男，新疆烏魯木齊人，副研究員，研究方向為設(shè)施食用菌栽培病蟲害防控，(E-mail)urmqhjz@163.com

S182

A

1001-4330(2016)07-1297-06