11個(gè)苜蓿品種種子寄藏真菌檢測(cè)與鑒定

先米西努爾·肉孜，李克梅，阿提開(kāi)姆·如則，古麗巴哈爾·熱合買提

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

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11個(gè)苜蓿品種種子寄藏真菌檢測(cè)與鑒定

先米西努爾·肉孜，李克梅，阿提開(kāi)姆·如則，古麗巴哈爾·熱合買提

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

【目的】分離和鑒定不同產(chǎn)地的苜蓿種子寄藏真菌，明確其寄藏真菌種類和帶菌率，為苜蓿的引進(jìn)、抗病育種及生產(chǎn)中苜蓿病害綜合防治提供理論依據(jù)。【方法】采用平皿測(cè)定方法，分別對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同區(qū)域的11個(gè)苜蓿品種，進(jìn)行種子寄藏真菌分離、純化和鑒定?！窘Y(jié)果】共檢測(cè)到種子寄藏真菌13屬16種。其中來(lái)自國(guó)外的阿爾岡金、4030、金皇后、巨能2號(hào)、超音速等品種帶菌率較高。黑曲霉(Aspergillusniger)、細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata)是優(yōu)勢(shì)種群?！窘Y(jié)論】苜蓿種子攜帶真菌現(xiàn)象極為普遍，經(jīng)消毒處理的種子帶菌率顯著降低，且經(jīng)過(guò)表面消毒處理的種子，與未進(jìn)行表面消毒種子檢出寄藏真菌種類存在顯著差異。

苜蓿；種子；寄藏真菌；種類

0 引 言

【研究意義】苜蓿是世界上最重要的、栽培最早、分布面積最大的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好，素有“牧草之王”的美譽(yù)[1]。隨著我國(guó)苜蓿栽培面積的不斷擴(kuò)大，尤其是苜蓿在我國(guó)西部開(kāi)發(fā)、退耕還草、種草養(yǎng)畜、改善生態(tài)環(huán)境等方面的重大作用，苜蓿必將成為我國(guó)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整的切入點(diǎn)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展新的增長(zhǎng)點(diǎn)[2]。 種子作為高等植物的繁殖器官可攜帶大量危害種苗或植株的真菌、細(xì)菌、病毒等微生物和線蟲[3]，它既是病害的載體又是受害者。在這些微生物中，真菌對(duì)種子的質(zhì)量影響最大[4-6]。種子品質(zhì)是提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)是保證種子質(zhì)量的重要內(nèi)容之一[7]。近年來(lái)隨著種子市場(chǎng)的開(kāi)放，種子貿(mào)易量的迅速增長(zhǎng)，帶菌種子已成為病害跨地區(qū)傳播流行的重要原因，因此對(duì)種子進(jìn)行健康檢測(cè)是保證種子質(zhì)量，及控制種傳病害最方便有效的方法，可有效地防治病害的發(fā)生，因此，對(duì)苜蓿種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)和種子處理是生產(chǎn)上減低種子帶菌率、有效控制種子病原菌擴(kuò)大傳播、培育壯苗、增加草場(chǎng)建植持久性的重要措施，對(duì)建立苜蓿病害綜合防治體系，將危害降到最低限度，促進(jìn)苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，種子帶菌是普遍現(xiàn)象，李春杰等[8]曾對(duì)國(guó)內(nèi)38個(gè)苜蓿種子樣品進(jìn)行了系統(tǒng)的種帶真菌檢測(cè)研究，參試種樣不經(jīng)過(guò)表面消毒測(cè)定出21種25個(gè)真菌分離物， 李克梅等[9]用吸水紙檢驗(yàn)法，對(duì)新疆苜蓿品種種子及植物組織殘?bào)w上進(jìn)行種帶真菌檢測(cè)，總共測(cè)定了21種真菌，種子分為經(jīng)過(guò)表面消毒(0.1%升汞消毒)只檢測(cè)到7種真菌，而不經(jīng)表面消毒苜蓿種子檢測(cè)到13種真菌。陳燾等[10]對(duì)來(lái)自青海的5個(gè)不同收獲年份的老芒麥種樣進(jìn)行種帶真菌研究(NaClO消毒處理)測(cè)定了12種種帶真菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，隨著國(guó)外作物種子的大量引進(jìn)，傳入新疆的植物病害種類逐漸增多。由于苜蓿品種和產(chǎn)地不同，消毒方法不同，檢測(cè)方法也有差異，故常造成帶菌種類檢測(cè)結(jié)果的差異。分離鑒定苜蓿種子寄藏真菌，明確苜蓿種子寄藏真菌檢測(cè)的適宜方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究針對(duì)來(lái)自美國(guó)、加拿大、澳大利亞、中國(guó)新疆、黑龍江、寧夏、甘肅等11個(gè)來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同區(qū)域的苜蓿種樣，進(jìn)行種子表面不消毒和消毒處理，分別檢測(cè)寄藏真菌種類鑒定。比較兩種處理方式對(duì)種子寄藏真菌種類檢測(cè)結(jié)果的影響，為選擇合適的種子寄藏真菌檢測(cè)方法提供依據(jù)。同時(shí)，確定引進(jìn)的苜蓿種子帶菌情況，可為種子生產(chǎn)、儲(chǔ)藏加工、包衣劑的設(shè)計(jì)、種子消毒方式的選擇，及對(duì)控制苜蓿種傳病害的發(fā)生、危害及采取有效防治措施提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試11份苜蓿種樣分別來(lái)自美國(guó)、加拿大、澳大利亞，中國(guó)新疆、黑龍江、寧夏、甘肅。表1

表1 苜蓿種樣來(lái)源

1.2 方 法

1.2.1 種子寄藏真菌的檢測(cè)

1.2.1.1 未處理種子寄藏真菌檢測(cè)

將供試的不同苜蓿品種不經(jīng)表面消毒分別隨機(jī)選取10粒種子均勻擺放于含有100 mg/L氯霉素的9 cm直徑PDA平板上，5皿為一個(gè)重復(fù)，共設(shè)4個(gè)重復(fù)，置25℃恒溫黑暗培養(yǎng)。第3 d挑取不同顏色、形狀的菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，第7 d時(shí)鏡檢記錄每粒種子上分離出真菌種類及分離頻率。

1.2.1.2 表面消毒種子寄藏真菌檢測(cè)

采用李春杰的方法[8]，稍有改動(dòng)。每個(gè)品種隨機(jī)選取200粒種子， 1%NaClO溶液浸泡消毒10 min，無(wú)菌蒸餾水充分洗滌5次，用滅菌濾紙吸干種子表面的水分[11]。用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鑷子隨機(jī)選取10粒種子，等距離置于含有100 mg/L氯霉素的9 cm 直徑PDA平板上，每皿10粒，5皿為一重復(fù)，共設(shè)4個(gè)重復(fù)，25℃ 恒溫黑暗培養(yǎng)。第7 d時(shí)記錄每粒種子上分離出真菌種類、檢出率。

計(jì)算公式如下：

帶菌率(%)=(帶菌種子總數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100。

某菌檢出率(%)=(帶某類菌種子數(shù)/帶菌種子總數(shù))×100。

1.2.2 種子寄藏真菌的鑒定

將從種子分離得到的真菌做標(biāo)記并分別進(jìn)行純化、轉(zhuǎn)管保存和鏡檢。根據(jù)真菌培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征，依據(jù)Barnett H.L.和Hunter B.B.(沈崇堯譯)《半知菌屬圖解》[12]、張中義《植物病原真菌學(xué)》[13]、邵力平等《真菌分類學(xué)》[14]等資料的描述將其鑒定到種，個(gè)別真菌鑒定到屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 未處理種子寄藏真菌檢測(cè)

未處理種子帶菌率為13.5%～87.5% ，平均為36.9% 。不同種樣帶菌率差異顯著(P<0.05)，其中來(lái)自加拿大的3份種樣帶菌率均較高，阿爾岡金帶菌率高達(dá)87.5%，4030、金皇后帶菌率分別為60%和51.5%；美國(guó)的巨能2號(hào)、澳大利亞的超音速種子帶菌率分別為45.5%和40%，上述種樣帶菌率均顯著高于6個(gè)國(guó)內(nèi)種樣。表2

供試11個(gè)未經(jīng)處理的苜蓿種子檢出寄藏真菌9屬12種真菌。分別為4種曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黃曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、雜色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)、細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata)、鐮刀菌(Fusariumsp)。

未處理種子中各種真菌的分離頻率為0%～75.5%，檢出率最高的是黑曲霉(Aspergillus niger)，高達(dá)75.5%，最低的是高大毛殼(Chaetomiumelatum)，僅2.3%。其中11個(gè)種子樣品中檢出黑曲霉，8個(gè)樣品中檢出意大利青霉，6個(gè)樣品中檢出黃曲霉、細(xì)交鏈孢，5個(gè)樣品中檢出鐮刀菌。表3

2.2 表面消毒種子寄藏真菌檢測(cè)

經(jīng)表面消毒處理種子寄藏真菌帶菌率為3.5%～46.5% ，平均為19.6% 。其中來(lái)自加拿大的阿爾岡金、4030、美國(guó)的巨能2號(hào)帶菌率分別是46.5%、36%、28.5%，高于其他種樣。表2

經(jīng)表面消毒處理的種子中分離鑒定出9屬12種真菌。分別為4種曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黃曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、雜色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)。與未經(jīng)處理種子檢測(cè)到的寄藏真菌相比，枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp.)4種菌在經(jīng)處理的種子上檢測(cè)到，而未經(jīng)處理種子中檢測(cè)到的桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)4種菌在種子表面消毒處理后未檢測(cè)到。表3

各種真菌的分離頻率為1.1%～75%。分離頻率最高的是細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata，75%)最低的是聚多曲霉(Aspergillussydowii，1.1%)。較未經(jīng)處理的種子，各種真菌經(jīng)消毒處理帶菌率顯著降低，且各種真菌的檢出率則有差異。

表2 苜蓿種子寄藏真菌帶菌率(%)

注：同列不同小寫字母表示差異達(dá)(P<0.05)顯著水平

Note：Different lowercase letter in same line means the test differences are significant (P<0.05)

表3 苜蓿種帶真菌種類及檢出率

3 討 論

研究顯示，未經(jīng)表面消毒處理的種子帶菌率為13.5%～87.5% ，平均為36.9%，而經(jīng)消毒處理的種子帶菌率為3.5%～46.5% ，平均為19.6%，種子消毒前后的帶菌率存在顯著差異，說(shuō)明表面消毒處理可顯著減少種子寄藏真菌的帶菌率。

11份苜蓿種樣共檢測(cè)到13屬16種真菌，但其中枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp.)4種菌在未經(jīng)處理的種子上未檢測(cè)到，推測(cè)這幾種菌可能需要較多的水分才能生長(zhǎng)，因未處理的種子是干種子而未能很好的萌發(fā)生長(zhǎng)；桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)4種菌在種子表面消毒處理后未檢測(cè)到，推測(cè)該類菌對(duì)表面消毒劑次氯酸鈉敏感而被殺死故沒(méi)有長(zhǎng)出。目前針對(duì)種子寄藏真菌帶菌檢測(cè)，常用的方法是種子不經(jīng)處理直接培養(yǎng)檢驗(yàn)[7,8]，但這一結(jié)果說(shuō)明，可能直接培養(yǎng)干種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)，可能會(huì)使一些對(duì)濕度要求高的真菌檢測(cè)不出來(lái)，因而造成漏檢的現(xiàn)象，這是在種子寄藏真菌檢測(cè)中值得注意的問(wèn)題。

苜蓿不同產(chǎn)地各種樣之間以及同產(chǎn)地不同品種之間種子帶菌率均存在較大的差異，來(lái)自加拿大、美國(guó)、澳大利亞的苜蓿種子帶菌率相對(duì)于國(guó)內(nèi)種子帶菌率偏高，而新疆、寧夏、甘肅等干旱地區(qū)種子帶菌率則較低。南志標(biāo)[15]報(bào)道沙打旺種子成熟和收打期間產(chǎn)地的濕潤(rùn)度與種子帶菌率呈正相關(guān)，故外國(guó)種子帶菌率偏高可能與當(dāng)?shù)亟邓^豐富有關(guān)。

被檢測(cè)的國(guó)外種子在收集、儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中程序多，流程長(zhǎng)，更容易沾染和滋生真菌，故建議在加強(qiáng)國(guó)外苜蓿種子的帶菌檢測(cè)，尤其是加強(qiáng)一些高危、檢疫性的病害的檢測(cè)，如，苜蓿黃萎病Verticilliumalbo-atrumReinke & Rerthold的檢測(cè)，或者直接引進(jìn)經(jīng)過(guò)包衣處理的種子。

有報(bào)道認(rèn)為，對(duì)某些作物種子帶菌檢測(cè)的研究發(fā)現(xiàn)，表面消毒是必須的[16]，否則根霉等生長(zhǎng)迅速的真菌會(huì)對(duì)生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的植物病原真菌產(chǎn)生抑制作用[17]。但亦有研究表明表面消毒會(huì)減少檢出的真菌種數(shù)和降低檢出率[18]。研究結(jié)果顯示，苜蓿種子檢測(cè)前是否經(jīng)表面消毒，對(duì)真菌檢出種數(shù)與檢出率有顯著影響。選擇合適的表面消毒劑是植物無(wú)菌操作的重要步驟，提高消毒效果、減輕對(duì)植物傷害以及價(jià)格低廉是選擇表面消毒劑的原則[19]。研究表明，2% NaClO溶液即可起到種子表面消毒的效果，又不影響種子的發(fā)芽率，是一種安全、適用的表面消毒處理劑。

種子寄藏真菌并不都是致病菌，對(duì)從苜蓿種子分離到的真菌開(kāi)展其致病性測(cè)定研究，進(jìn)一步區(qū)分致病菌和腐生菌，評(píng)價(jià)各種寄藏真菌對(duì)苜蓿種子發(fā)芽和出苗的影響，并對(duì)致病菌開(kāi)展種子處理研究，最終達(dá)到防止病害傳播和減輕苗期病害的目的。

4 結(jié) 論

供試11份苜蓿種子共檢出寄藏真菌13屬16種。分別為4種曲霉(Aspergillusniger、Aspergillus.flavus、Aspergillus.sydowii、Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色擬青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛殼(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄狀穗霉(Stachybotrysatra)、細(xì)交鏈孢(Alternariaalternata.)、鐮刀菌(Fusariumsp)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、輪枝菌(Verticilliumsp)。其中來(lái)自國(guó)外的阿爾岡金、4030、金皇后、巨能2號(hào)、超音速等品種帶菌率較高。是否經(jīng)過(guò)表面消毒處理的種子病菌檢出種類有差異，可能與病菌的帶菌部位和病菌萌發(fā)生長(zhǎng)需要的濕度條件不同有關(guān)。

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Fund project:Supported by Special funds for Agricultural scientific research in the national public welfare industry (201303057) and Key Laboratory of grassland resources and ecology in the Xinjiang Uygur Autonomous Region (XJDX0209-2012-01)

Detection and Identification of Eleven Kinds of Alfalfa Seed-Borne Fungi

Xianmixinuer Rouzi, LI Ke-mei, Atikaimu Ruzi, Gulibahaer Rehemaiti

(Key Laboratory of Monitoring and Controlling Agricultural and Forestry Pests /CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 The project aims to isolate and identify the borne fungi on alfalfa seeds from different origins in order to provide a theoretical basis for clearing the fungal species, infection rate and the introduction of alfalfa, breeding for integrated control of alfalfa diseases in disease resistance breeding and production.【Method】Seed-borne fungi and disinfection effect of eleven alfalfa species from different origins at home and abroad were determined by means of perti dish testing.【Result】The results showed that 16 fungi species that belonged to 13 genera were carried by rapeseeds. The carrier rate of species from home and abroad was higher.Aspergillusniger,Alternariaalternatawere the main seed-borne pathogens.【Conclusion】Alfalfa seed carrying the fungus is a common phenomenon, the disinfection of seed infection rate was significantly reduced, and there are significant differences between the seeds after disinfection those without disinfection.

alfalfa；seed；borne fungi；species

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.015

2016-02-20

國(guó)家公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專項(xiàng)(201303057)；新疆維吾爾自治區(qū)草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(XJDX0209-2012-01)

先米西努爾·肉孜(1989-),女, 新疆烏魯木齊人，碩士研究生，研究方向?yàn)槟敛莶『胺乐危?E-mail)840300914@qq.com

李克梅(1973-),女，江蘇如皋人，副教授，博士，研究方向?yàn)槟敛莶『Γ?E-mail) lindali1118@sina.com

S435.4

A

1001-4330(2016)07-1281-07