• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雪菊黃酮對(duì)脂肪變肝細(xì)胞的降脂效果

    2016-12-02 01:08:26方煊李雅麗陳新梅
    關(guān)鍵詞:雪菊細(xì)胞培養(yǎng)降脂

    方煊,李雅麗,陳新梅

    (1.紹興第二醫(yī)院 普外科,浙江 紹興 312000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 VIP內(nèi)科,新疆 烏魯 木齊 830054;3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

    雪菊黃酮對(duì)脂肪變肝細(xì)胞的降脂效果

    方煊1,李雅麗2,陳新梅3

    (1.紹興第二醫(yī)院 普外科,浙江 紹興 312000;2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 VIP內(nèi)科,新疆 烏魯 木齊 830054;3.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

    目的:研究雪菊黃酮對(duì)發(fā)生脂肪變的正常人肝細(xì)胞系L-02的影響。方法:醫(yī)用脂肪乳注射液制備人肝L-02細(xì)胞的高脂細(xì)胞模型。以不同濃度(20、50、100 μmol/L)的雪菊黃酮進(jìn)行共培養(yǎng),分別孵育高脂變性的肝細(xì)胞不同時(shí)間(3、12、24、48 h)后,用油紅脂肪染色法觀察細(xì)胞脂滴形成情況。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)的酶學(xué)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)及甘油三酯(TG)的含量。結(jié)果:醫(yī)用脂肪乳培育人肝L-02細(xì)胞脂肪變性模型可行。高濃度的雪菊黃酮(100 μmol/L)培養(yǎng)后高脂肝細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴明顯減少,TG含量降低。不同孵育時(shí)間培育(3、12、24、48 h)后,TG含量隨培育時(shí)間延長而逐步降低。結(jié)論:雪菊黃酮能降低脂肪變性肝細(xì)胞中TG的含量,作用效果與雪菊黃酮的作用濃度和培育時(shí)間相關(guān),未見明顯肝細(xì)胞酶學(xué)損害。

    雪菊;黃酮;甘油三酯;高脂細(xì)胞模型

    本課題組前期進(jìn)行了雪菊黃酮的制備、成分分離鑒定和分析工作,并進(jìn)行了小鼠調(diào)脂作用分析[1],初步證明雪菊黃酮具有降低小鼠血脂的作用,其作用機(jī)制尚不清楚。前期研究主要采用的是動(dòng)物模型,存在個(gè)體差異較大、實(shí)驗(yàn)條件不好控制、周期較長、材料耗費(fèi)較多等缺點(diǎn)。而細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)不僅能針對(duì)性地研究細(xì)胞水平的脂肪肝發(fā)病機(jī)制,并且能精確控制用藥濃度,研究分子作用機(jī)制,有效地縮短篩選治療藥物的進(jìn)程,有助于篩選大量的藥物。本研究采用脂肪乳作用于在體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株的方式,建立脂肪肝的體外模型,結(jié)合油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴變化情況,來驗(yàn)證該肝細(xì)胞是否產(chǎn)生脂肪變性,并觀察雪菊黃酮對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞的作用,探索雪菊在高脂細(xì)胞模型上的作用及可能的分子機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 雪菊黃酮 前期的研究[1]已完成了雪菊總黃酮提取物的制備和化學(xué)成分分析,通過對(duì)雪菊中主要成分的分離純化,采用乙醇提取、大孔樹脂精制工藝,獲得了雪菊總黃酮提取物(CTTFE),并采用 HPLC/DAD建立了雪菊提取物的多波長定性和定量分析方法,采用核磁測(cè)試、液相質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù),鑒 定了雪菊中黃諾馬苷(CT01)、馬里苷(CT02)、奧卡 寧(CT04)等12種主要成分,其中10種主要成分為黃 酮類,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

    圖1 雪菊黃酮的分離鑒定和主要成分

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 正常肝細(xì)胞株L-02培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期,用6孔板接種,培養(yǎng)板內(nèi)加入含5%胎牛血清、5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)放入蓋玻片,使細(xì)胞貼壁在蓋玻片上附著貼壁生長。培養(yǎng)板放入飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)條件設(shè)置如下:溫度為37 ℃,氣體濃度為5% CO2。根據(jù)細(xì)胞生長情況,每2~3 d用0.25%的胰蛋白酶消化,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 接種L-02細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板上,孵育24 h,待細(xì)胞貼壁生長后,設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和高脂模型組,實(shí)驗(yàn)組又分為雪菊黃酮低、中、高3個(gè)不同濃度給藥組(不同藥物濃度分別為20、50、100 μmol/L),分別用含脂肪乳的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),每組均設(shè)3個(gè)平行孔,培養(yǎng)3 d,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成狀況。取細(xì)胞上清液,檢測(cè)肝細(xì)胞分泌在上清中的肝臟酶學(xué)指標(biāo)和甘油三酯(triglyceride,TG)。

    1.4 細(xì)胞內(nèi)脂滴形成的觀察 將貼壁生長肝細(xì)胞的蓋玻片從6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中取出,清洗3次,采用固定液(4%多聚甲醛)固定20 min。清洗細(xì)胞2次,異丙醇漂洗數(shù)秒。室溫下采用紅色染料(油紅O)染色10~15 min,蒸餾水終止染色,細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪可被染成桔紅色或紅色。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。

    1.5 細(xì)胞酶學(xué)指標(biāo)和TG測(cè)定 在細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,在檢驗(yàn)科自動(dòng)生化儀上(BIO-RAD)定量測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的代謝酶及TG含量。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示,組間比采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 脂肪染色觀察 雪菊100 μmol/L組脂肪染色后觀察,在顯微鏡下看到胞漿內(nèi)脂滴與高脂模型組比較明顯減少,因此雪菊100 μmol/L組降脂效果最明顯。各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞染色結(jié)果及分析結(jié)果見圖2。

    2.2 不同雪菊黃酮濃度對(duì)降脂效果的影響 雪菊黃酮配制成雪菊100 μmol/L組、雪菊50 μmol/L組、雪菊20 μmol/L組3個(gè)濃度后加入培養(yǎng)液,孵育48 h 后測(cè)定肝臟酶學(xué)指標(biāo)和TG,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

    2.3 不同孵育時(shí)間對(duì)降脂效果的影響 雪菊黃酮孵育3、12、24、48 h后檢測(cè)培養(yǎng)液體上清中TG,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。TG含量隨雪菊黃酮作用時(shí)間延長而相應(yīng)降低,在48 h效果顯著(P<0.01)。

    3 討論

    雪菊是一種藥食兩用植物,又稱為蛇目菊、雙色金雞菊,是新疆特色中草藥[1-2],原產(chǎn)北美洲,在我國新疆和田地區(qū)高緯度昆侖山北麓一帶生長,新疆維醫(yī)稱作“古麗恰爾”(維吾爾語,意即花茶)[3], 性味苦、辛,歸肺、肝經(jīng)?!侗静輩R言》稱其可“破血疏肝,解疔散毒”。雪菊在新疆當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族中作為茶飲使用多年,含有酮、生物堿、揮發(fā)性油、有機(jī)酸、皂井、氨基酸等多種藥理成分,已成為營養(yǎng)學(xué)家、藥理學(xué)家以及養(yǎng)生專家研究的熱點(diǎn)[4-9]。我們前期試驗(yàn)采用柱層析法和質(zhì)譜色譜聯(lián)用技術(shù)已從雪菊中分離鑒定出多種黃酮類物質(zhì),發(fā)現(xiàn)黃酮含量 很高[1],可有效地清除體內(nèi)的氧自由基,防止細(xì)胞的退化、衰老及癌變的發(fā)生[10],也具有免疫調(diào)節(jié)的作用,是降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤與抗衰老相關(guān)藥物中的重要元素[11-13]。上述研究資料表明,雪菊具有較為確切的降血糖、降脂、降壓等功效,但一般采用雪菊提取物進(jìn)行,缺乏對(duì)應(yīng)的有效成分的分析和鑒定。此外,尚未見有關(guān)雪菊對(duì)非酒精性脂肪肝是否有保護(hù)作用的報(bào)道。

    圖2 細(xì)胞染色結(jié)果及雪菊作用后脂肪滴減少的鏡下結(jié)果

    表1 不同劑量雪菊黃酮對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中酶學(xué)指標(biāo)以及TG的影響(48 h)

    表2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TG的影響

    本研究探討了脂肪乳作用于在體外培養(yǎng)的人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株建立高脂細(xì)胞模型的可行性,建立脂肪肝的體外中藥篩選模型,結(jié)合油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪滴變化情況,可以反映肝細(xì)胞產(chǎn)生脂肪變性的程度,并證實(shí)雪菊黃酮能夠減少脂肪變性肝細(xì)胞的脂滴,降脂作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性,為雪菊的藥物開發(fā)奠定了細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    雪菊作為一種昆侖山特殊藥用植物,在民間作為茶飲已經(jīng)有多年歷史,有一些觀察描述性論述,但 大多數(shù)的研究僅限于驗(yàn)方使用,沒有進(jìn)行嚴(yán)格的雪菊化學(xué)單體分離鑒定,缺乏嚴(yán)格對(duì)照,本研究采用質(zhì)譜連用的現(xiàn)代藥物分離鑒定手段,對(duì)新疆雪線以上的雪菊進(jìn)行單體分離,化學(xué)組分鑒定,在光譜和色譜測(cè)試指導(dǎo)下提取分離獲取雪菊特征總提物,采用植物化學(xué)的研究方法對(duì)特征總提物進(jìn)行分離,得到各單體化合物,并鑒定了主要單體化合物的結(jié)構(gòu),在體外培養(yǎng)體系中研究了雪菊降脂藥效物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。該研究采納了民間驗(yàn)方和維醫(yī)為基礎(chǔ),有利于提高雪菊提取的標(biāo)準(zhǔn)化,有助于推動(dòng)雪菊的物質(zhì)學(xué)基礎(chǔ)和藥效學(xué)研究。

    中藥在治療慢性病方面有獨(dú)特的療效,是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的瑰寶,目前各種中藥材都采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法證實(shí)藥物的有效性,并闡明其作用機(jī) 制[14-17]。而本研究采用植物化學(xué)、工業(yè)色譜等技術(shù)和方法,篩選雪菊核心成分,并且闡明雪菊降低肝臟細(xì)胞脂肪的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn),能夠提升地方特色藥材雪菊開發(fā)利用的效率,為雪菊藥物開發(fā)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    [1] LI Y, CHEN X, XUE J, et al. Flavonoids furom Coreopsis tinctoria adjust lipid metabolism in hyperlipidemia animals by down-regulating adipose differentiation-related protein [J]. Lipids Health Dis, 2014, 13: 193.

    [2] YAO X, WANG X, GU C, et al. Chemical composition, N-nitrosamine inhibition and antioxidant and antimicrobial properties of essential oil from Coreopsis tinctoria flowering tops[J]. Nat Prod Res, 2016, 30(10): 1170-1173.

    [3] DU H, LI S S, WU Q, et al. Analysis of active compounds and antioxidant activity assessment of six popular Chinese Juhua teas[J]. Nat Prod Commun, 2015, 10(3): 495-498.

    [4] YAO X, GU C, TIAN L, et al. Comparative study on the antioxidant activities of extracts of Coreopsis tinctoria flowering tops from Kunlun Mountains, Xinjiang, north-western China[J]. Nat Prod Res, 2016, 30(4): 429-432.

    [5] JIANG B, LE L, WAN W, et al. The fower tea Coreopsis tinctoria increases insulin sensitivity and regulates hepatic metabolism in rats fed a high-fat diet[J]. Endocrinology, 2015, 156(6): 2006-2018.

    [6] LIU Y, DU D, LIANG Y, et al. Novel polyacetylenes from Coreopsis tinctoria Nutt[J]. J Asian Nat Prod Res, 2015, 17 (7): 744-749.

    [7] WANG W, CHEN W, YANG Y, et al. New phenolic compounds from Coreopsis tinctoria Nutt. and their antioxidant and angiotensin i-converting enzyme inhibitory activities [J]. J Agric Food Chem, 2015, 63(1): 200-207.

    [8] LAN S, LIN J, ZHENG N. Evaluation of the antioxidant activity of Coreopsis tinctoria Nuff. and optimisation of isolation by response surface methodology[J]. Acta Pharm, 2014, 64(3): 369-378.

    [9] SUN Y H, ZHAO J, JIN H T, et al. Vasorelaxant effects of the extracts and some flavonoids from the buds of Coreopsis tinctoria[J]. Pharm Biol, 2013, 51(9): 1158-1164.

    [10] ZHANG Y, SHI S, ZHAO M, et al. Coreosides A-D, C14-polyacetylene glycosides from the capitula of Coreopsis tinctoria and its anti-inflammatory activity against COX-2 [J]. Fitoterapia, 2013, 87: 93-97.

    [11] DIAS T, LIU B, JONES P, et al. A. Cytoprotective effect of Coreopsis tinctoria extracts and flavonoids on tBHP and cytokine-induced cell injury in pancreatic MIN6 cells[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 139(2): 485-492.

    [12] DIAS T, BRONZE M R, HOUGHTON P J, et al. The flavonoid-rich fraction of Coreopsis tinctoria promotes glucose tolerance regain through pancreatic function recovery in streptozotocin-induced glucose-intolerant rats[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 132(2): 483-490.

    [13] DIAS T, MOTA-FILIPE H, LIU B, et al. Recovery of oral glucose tolerance by Wistar rats after treatment with Coreopsis tinctoria infusion[J]. Phytother Res, 2010, 24(5): 699-705.

    [14] 邢沖云, 周琳, 莊強(qiáng), 等. 姜黃素通過上調(diào)SOCS表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的機(jī)制[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(10): 718-722.

    [15] 孟珊珊, 呂芳芳, 胡曉光, 等. 柚皮素對(duì)RSVA2株感染引起氣道黏液高分泌的抑制作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(9): 631-635.

    [16] 皮治兵, 申邦利, 蔡振, 等. 姜黃素通過下調(diào)p-NF-κB表達(dá)減輕大鼠帶狀皰疹神經(jīng)痛[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(7): 512-515.

    [17] 周子曄, 金輝, 王陳翔, 等. 綠茶水提物對(duì)大鼠CYP450酶活力和mRNA表達(dá)的調(diào)控作用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 45(7): 502-511.

    (本文編輯:趙翠翠)

    Experimental study of flavonoids from Coreopsis tinctoria of lipid-lowering effect on liver cells

    FANG

    Xuan1, LI Yali2, CHEN Xinmei3. 1.Department of General Surgery, the Second Hospital of Shaoxing, Shaoxing, 312000; 2.Department of Internal Medicine VIP Ward, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, 830054; 3.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, 250355

    Objective: To study the lipid-lowering effect of flavonoids from Coreopsis tinctoria on the liver cells with fatty degeneration. Methods: The medical fat emulsion injection was used as fat resource to make human liver fat cell model on normal liver cell line L-02. With different concentrations (20, 50, and 100 μmol/L flavonoids from Coreopsis tinctoria were co-cultured with hepatocytes with fatty degeneration and incubated for different times (3, 12, 24, 48 h). The oil red staining was used to mark the intracellular lipid droplets and morphological changes. The cell culture supernatants were collected to test triglyceride content. Results: L-02 high fat cell model was feasible. High concentration of flavonoids (100 μmol/L) showed the significant decrease of lipid droplets and lower triglyceride levels. The triglyceride decreased with prolonged incubation time. Conclusion: Flavonoids from Coreopsis tinctoria can reduce triglyceride in the liver cells with fat degeneration. There is no significant liver cell enzyme damage. The effect depends on the concentration and incubation time.

    Coreopsis tinctoria; flavonoid; triglyceride; fat degeneration

    R93

    A

    10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.004

    2015-11-02

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460634);山東中醫(yī)藥

    大學(xué)2013年“名科工程”青年骨干培養(yǎng)計(jì)劃課題(ZYDXY1337); 新疆醫(yī)科大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013ZRZD07)。

    方煊(1976-),男,浙江紹興人,副主任醫(yī)師,碩士。

    陳新梅,副教授,Email:xinmeichen@126.com。

    猜你喜歡
    雪菊細(xì)胞培養(yǎng)降脂
    蜜桑白皮的體內(nèi)降脂作用研究
    HPLC法同時(shí)測(cè)定三參降脂液中9種成分
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:34
    酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
    UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定降脂活血片中5種成分
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:30
    昆侖雪菊中活性成分提取條件的探究
    西藏科技(2016年10期)2016-09-26 09:02:10
    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
    色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
    昆侖雪菊多糖抗氧化及對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:12
    降脂降壓要吃六種食物
    大孔吸附樹脂對(duì)雪菊黃酮的分離純化工藝研究
    日本熟妇午夜| 两个人看的免费小视频| 久久中文看片网| 韩国av一区二区三区四区| 老司机福利观看| 一级作爱视频免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 久久亚洲真实| 两性夫妻黄色片| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 99精品在免费线老司机午夜| 脱女人内裤的视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲av美国av| 亚洲中文av在线| 久久精品综合一区二区三区| 色综合站精品国产| 变态另类丝袜制服| 欧美黑人巨大hd| 久久久久国内视频| 一本久久中文字幕| 国产欧美日韩一区二区精品| 99在线视频只有这里精品首页| 嫩草影院入口| 成在线人永久免费视频| 国产精品女同一区二区软件 | 精品一区二区三区视频在线 | 日本与韩国留学比较| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩欧美免费精品| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| netflix在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 又粗又爽又猛毛片免费看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 18禁国产床啪视频网站| 国产一区二区在线av高清观看| 中亚洲国语对白在线视频| www.精华液| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲国产欧美网| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品久久久久久,| 极品教师在线免费播放| 成人三级做爰电影| 精品不卡国产一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 99在线视频只有这里精品首页| 怎么达到女性高潮| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99热只有精品国产| 成人av在线播放网站| 看免费av毛片| 神马国产精品三级电影在线观看| 黄频高清免费视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美在线一区亚洲| 国产精品日韩av在线免费观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲激情在线av| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 成人18禁在线播放| 99国产精品99久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 哪里可以看免费的av片| 久久久久久久久久黄片| 久久中文字幕一级| 禁无遮挡网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 色综合婷婷激情| 少妇熟女aⅴ在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲专区中文字幕在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美在线黄色| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美zozozo另类| 日韩有码中文字幕| 99热这里只有精品一区 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美午夜高清在线| 我要搜黄色片| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美中文综合在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 老汉色∧v一级毛片| 在线观看舔阴道视频| 久久人妻av系列| 成年女人毛片免费观看观看9| 国内精品久久久久久久电影| 日本三级黄在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 特级一级黄色大片| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产97色在线日韩免费| 操出白浆在线播放| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| or卡值多少钱| 国产久久久一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲色图av天堂| 好男人电影高清在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 少妇丰满av| 一区二区三区激情视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 一个人看视频在线观看www免费 | 男人舔女人的私密视频| 色吧在线观看| 午夜福利在线观看吧| 午夜精品在线福利| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费看光身美女| 2021天堂中文幕一二区在线观| 88av欧美| 欧美黑人巨大hd| 中亚洲国语对白在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲最大成人中文| 99久久99久久久精品蜜桃| 日韩精品中文字幕看吧| 久久精品91蜜桃| 九九在线视频观看精品| 757午夜福利合集在线观看| 黄色成人免费大全| 日韩人妻高清精品专区| 99国产极品粉嫩在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 嫩草影视91久久| 午夜福利高清视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 黄频高清免费视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩大尺度精品在线看网址| 婷婷精品国产亚洲av| 黄片小视频在线播放| 在线观看免费午夜福利视频| 国产乱人伦免费视频| 日韩欧美三级三区| 美女高潮的动态| 黄色成人免费大全| 极品教师在线免费播放| 久久久精品大字幕| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 99精品久久久久人妻精品| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久99热这里只有精品18| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲成av人片在线播放无| 少妇丰满av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产亚洲精品av在线| 少妇丰满av| 麻豆国产av国片精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99热只有精品国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美日韩黄片免| 嫩草影院精品99| 日本三级黄在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩欧美免费精品| 窝窝影院91人妻| 国产精品久久久av美女十八| 国产真实乱freesex| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品免费一区二区三区在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品九九99| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲国产高清在线一区二区三| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲欧美精品综合久久99| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲在线自拍视频| 无遮挡黄片免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 欧美日本视频| 亚洲国产精品999在线| 最新中文字幕久久久久 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久人人人人人| www日本黄色视频网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费大片18禁| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久精品欧美日韩精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美日韩黄片免| 中文字幕熟女人妻在线| 日本三级黄在线观看| 无限看片的www在线观看| 最好的美女福利视频网| 嫩草影院入口| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产亚洲av高清不卡| 天堂√8在线中文| av片东京热男人的天堂| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 成人亚洲精品av一区二区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 69av精品久久久久久| 亚洲在线观看片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜日韩欧美国产| 国产91精品成人一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| av天堂中文字幕网| 狠狠狠狠99中文字幕| 国内精品久久久久精免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| x7x7x7水蜜桃| av在线蜜桃| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲av免费在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 国产高潮美女av| 嫩草影院入口| 欧美激情久久久久久爽电影| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男人和女人高潮做爰伦理| 一个人看视频在线观看www免费 | 最新在线观看一区二区三区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精华国产精华精| 国产熟女xx| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产视频内射| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成人影院久久av| 免费看光身美女| 国产三级黄色录像| 亚洲人成网站高清观看| 欧美午夜高清在线| 日韩欧美在线二视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 真人一进一出gif抽搐免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 我要搜黄色片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本黄大片高清| 免费电影在线观看免费观看| 久久精品91无色码中文字幕| 伦理电影免费视频| 国产精品1区2区在线观看.| 宅男免费午夜| 久9热在线精品视频| 欧美日本视频| 国产不卡一卡二| 这个男人来自地球电影免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 此物有八面人人有两片| а√天堂www在线а√下载| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费大片18禁| 波多野结衣巨乳人妻| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成年免费大片在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 黄色成人免费大全| 久久亚洲真实| 国产乱人伦免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 看片在线看免费视频| 在线免费观看的www视频| 成人三级做爰电影| www日本黄色视频网| 久久久久性生活片| 男人舔奶头视频| 99在线视频只有这里精品首页| 九九在线视频观看精品| 免费看十八禁软件| 日本成人三级电影网站| 亚洲五月天丁香| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久久久久大精品| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 1024香蕉在线观看| 一本精品99久久精品77| 欧美午夜高清在线| av黄色大香蕉| 免费av毛片视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 午夜免费成人在线视频| av片东京热男人的天堂| 国产乱人视频| 老鸭窝网址在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜福利在线在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜福利在线观看吧| 久久热在线av| 在线观看66精品国产| 亚洲美女视频黄频| 久久久久国内视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品色激情综合| 熟女人妻精品中文字幕| 麻豆一二三区av精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 女人被狂操c到高潮| 婷婷亚洲欧美| 国产精品一及| 三级毛片av免费| 白带黄色成豆腐渣| 免费高清视频大片| 99热这里只有精品一区 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 啪啪无遮挡十八禁网站| 99热精品在线国产| av国产免费在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲一区二区三区不卡视频| 宅男免费午夜| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲中文字幕日韩| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲专区字幕在线| 我要搜黄色片| 亚洲国产精品合色在线| 老鸭窝网址在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品一区二区三区四区久久| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久国产精品麻豆| www.熟女人妻精品国产| 精品电影一区二区在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品久久久久久成人av| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费高清视频大片| a在线观看视频网站| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品在线观看二区| 最近最新免费中文字幕在线| 久久久久久久久中文| 亚洲激情在线av| 性欧美人与动物交配| 欧美日韩黄片免| 99国产精品一区二区蜜桃av| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久这里只有精品中国| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲黑人精品在线| 看黄色毛片网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜视频精品福利| 亚洲成av人片免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲人与动物交配视频| 国产av在哪里看| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲第一电影网av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美zozozo另类| 久久久精品大字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品国产亚洲在线| 亚洲av电影在线进入| 老司机福利观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产黄色小视频在线观看| 怎么达到女性高潮| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产不卡一卡二| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 淫妇啪啪啪对白视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 午夜激情福利司机影院| 999久久久精品免费观看国产| 日韩av在线大香蕉| 精品福利观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品电影一区二区在线| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美大码av| 十八禁网站免费在线| 99久久精品一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一区二区三区国产精品乱码| 天堂√8在线中文| 日本三级黄在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久香蕉国产精品| 国产综合懂色| 国产三级在线视频| 操出白浆在线播放| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| av黄色大香蕉| 国产又色又爽无遮挡免费看| e午夜精品久久久久久久| 天天一区二区日本电影三级| 97超视频在线观看视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 999久久久国产精品视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一二三四在线观看免费中文在| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 岛国在线观看网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色综合婷婷激情| 久久香蕉国产精品| 怎么达到女性高潮| 男女床上黄色一级片免费看| 精品日产1卡2卡| 亚洲国产看品久久| 99久久综合精品五月天人人| 欧美又色又爽又黄视频| 操出白浆在线播放| 小说图片视频综合网站| 国产成人精品无人区| 国产亚洲精品一区二区www| 淫秽高清视频在线观看| 看片在线看免费视频| 麻豆国产97在线/欧美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 波多野结衣高清作品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品永久免费网站| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 亚洲无线在线观看| 九色国产91popny在线| 午夜福利18| 在线看三级毛片| 久久久久久九九精品二区国产| 99在线视频只有这里精品首页| 免费看光身美女| 欧美成人性av电影在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美国产日韩亚洲一区| 免费看a级黄色片| 美女cb高潮喷水在线观看 | 免费大片18禁| 麻豆一二三区av精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产精品合色在线| 视频区欧美日本亚洲| xxx96com| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区二区激情短视频| 国产激情久久老熟女| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 熟女人妻精品中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 制服丝袜大香蕉在线| 一区二区三区国产精品乱码| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品永久免费网站| 精品久久久久久,| 亚洲人与动物交配视频| 午夜两性在线视频| 久久久久国内视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲人成电影免费在线| 九九在线视频观看精品| 成人午夜高清在线视频| 久久精品国产综合久久久| 97超视频在线观看视频| 一本一本综合久久| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲熟妇熟女久久| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩综合久久久久久 | 岛国视频午夜一区免费看| 校园春色视频在线观看| 美女免费视频网站| 欧美一级毛片孕妇| 美女大奶头视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精品一区av在线观看| 女警被强在线播放| 午夜视频精品福利| 后天国语完整版免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本熟妇午夜| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久香蕉国产精品| 99热精品在线国产| 亚洲熟妇熟女久久| 天堂网av新在线| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩 | 搡老妇女老女人老熟妇| 黑人操中国人逼视频| 淫秽高清视频在线观看| 丁香六月欧美| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美大码av| 丰满人妻一区二区三区视频av | 俺也久久电影网| 日本成人三级电影网站| 国产精品久久视频播放| 日韩精品中文字幕看吧| 观看美女的网站| 搞女人的毛片| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲九九香蕉| 香蕉久久夜色| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品av久久久久免费| 亚洲国产欧美网| or卡值多少钱| 亚洲av成人一区二区三| 成人特级av手机在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲九九香蕉| 在线国产一区二区在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 亚洲中文av在线| 看片在线看免费视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 99精品在免费线老司机午夜| 国产午夜精品久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产一区二区在线av高清观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 麻豆国产97在线/欧美| 一区二区三区国产精品乱码| 舔av片在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日韩乱码在线| 岛国在线观看网站| 国产精品 国内视频| 麻豆成人av在线观看| 午夜免费激情av| 身体一侧抽搐| av女优亚洲男人天堂 | 日本一二三区视频观看| 999久久久精品免费观看国产| 成人性生交大片免费视频hd| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人与动物交配视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品456在线播放app | 丰满人妻一区二区三区视频av | av片东京热男人的天堂| 国产真人三级小视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| 日韩三级视频一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 精品久久久久久久末码| 悠悠久久av|