運(yùn)用半導(dǎo)體測序法檢測4種遺傳病常見突變

王輝芳 梁志坤 葉倩平 楊旭

·論著·

運(yùn)用半導(dǎo)體測序法檢測4種遺傳病常見突變

王輝芳1梁志坤1葉倩平1楊旭2★

目的運(yùn)用基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)的下一代測序方法對地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥和肝豆?fàn)詈俗冃圆∠嚓P(guān)的38個(gè)常見致病突變位點(diǎn)進(jìn)行基因測序，探討半導(dǎo)體測序技術(shù)在遺傳病檢測方面的應(yīng)用價(jià)值。方法采用AmpliSeq方法通過多重PCR捕獲目的片段，然后構(gòu)建文庫，用Ion Torrent ProtonTM測序儀進(jìn)行測序反應(yīng)，進(jìn)而通過Sanger一代測序法進(jìn)行結(jié)果比較驗(yàn)證。結(jié)果33個(gè)樣本中共檢測出15例樣本存在功能性遺傳變異，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_ 46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例，Sanger一代測序結(jié)果與下一代測序結(jié)果完全一致。結(jié)論半導(dǎo)體測序能準(zhǔn)確檢測該4種遺傳病常見突變，對遺傳病發(fā)病機(jī)制的研究及篩查具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

半導(dǎo)體測序；下一代測序；Ion Torrent ProtonTM；遺傳病；基因突變

地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥及肝豆?fàn)詈俗冃圆閲鴥?nèi)4種常見的高發(fā)遺傳病，嚴(yán)重影響我國出生人口素質(zhì)。地中海貧血（thalas?semia）（簡稱“地貧”）是一組全球最常見、對人類健康影響最大的單基因遺傳?。?］。α?地貧發(fā)病相關(guān)基因?yàn)镠BA2，β?地貧發(fā)病相關(guān)基因?yàn)镠BB［2?4］。遺傳性耳聾是影響人類健康和致殘的常見病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，新生兒中耳聾的發(fā)病率為1‰［5］，其中大約一半的耳聾與遺傳因素相關(guān)［6?7］，相關(guān)基因主要有GJB2、GJB3和SLC26A4等。苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）是由于肝臟苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）缺乏所致的一種嚴(yán)重的遺傳性氨基酸代謝障礙性疾病，呈常染色體隱性遺傳［8］，該病可分為經(jīng)典型PKU與非經(jīng)典型PKU 2種類型［9?10］。苯丙酮尿癥是可治性的遺傳病之一，早期基因診斷可以盡早發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用飲食療法可以減輕或者控制患者癥狀［10］。肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD）是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳病，是由于細(xì)胞內(nèi)銅代謝障礙造成胞內(nèi)銅過多積聚，而引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞功能受損甚至細(xì)胞凋亡，其致病基因?yàn)锳TP7B基因［11?16］。

當(dāng)今社會，分子生物學(xué)發(fā)展迅速，用于檢測基因變異的方法多種多樣，包括有Sanger測序法、基因芯片法、液相芯片法、變性高效液相色譜分析法、MassARRAY分子量陣列技術(shù)、SNaP shot技術(shù)、高分辨融解法及高通量的下一代測序技術(shù)等。這些技術(shù)雖各有優(yōu)缺點(diǎn)，但就整體而言，測序技術(shù)可更直接檢測基因序列，不僅可檢出已知的SNP位點(diǎn)，還可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)出新的SNP位點(diǎn)，被廣泛用于基因檢測領(lǐng)域。

上述4種常見遺傳病都存在有臨床表現(xiàn)復(fù)雜，突變異質(zhì)性高等特點(diǎn)，因此常規(guī)臨床診斷很難從根本上確診，從而延誤最佳治療時(shí)間。而近幾年高速發(fā)展的下一代測序技術(shù)，不僅可從基因水平上檢測出已知或未知的突變位點(diǎn)，而且克服了一代測序成本高、效率低的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了快速、通量高的規(guī)?；瘻y序［17?18］，為臨床診斷提供必要的依據(jù)。本研究擬采用高通量的半導(dǎo)體測序技術(shù)同時(shí)對上述4種遺傳病多個(gè)常見致病突變點(diǎn)進(jìn)行檢測，探討半導(dǎo)體測序技術(shù)在遺傳病檢測中應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

實(shí)驗(yàn)所用的全血基因組DNA樣本共33例，來自于福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院。33例樣本詳細(xì)信息見表1。

表1 樣本詳細(xì)信息Table 1 The detailed information of the samples

1.2 半導(dǎo)體測序方法

1.2.1 文庫構(gòu)建

首先利用Ampliseq技術(shù)針對地中海貧血、遺

傳性耳聾、苯丙酮尿癥和肝豆?fàn)詈俗冃圆?種遺傳病常見突變點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，包含3個(gè)引物池，3個(gè)引物池分開進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，反應(yīng)條件為：首先99℃預(yù)變性2m in；然后99℃變性15 s，60℃退火和延伸4m in進(jìn)行16個(gè)循環(huán)數(shù)；最后10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)FuPa酶消化引物，用DNA連接酶將特異性接頭序列連接在目的片段兩端，磁珠純化后進(jìn)行一步擴(kuò)增反應(yīng)，最后經(jīng)兩步磁珠純化去除較大或較小的片段，構(gòu)建成片段大小在200 bp左右的基因文庫。Qubit?3.0熒光計(jì)對文庫濃度進(jìn)行定量。

表2 38個(gè)常見突變點(diǎn)詳細(xì)信息Table 2 The details of 38 commonmutations

1.2.2 模板制備和模板富集

建好的文庫等量混合使每個(gè)文庫的終濃度為200 pmol/L，根據(jù)自己測序的flow數(shù)、片段大小以及芯片所能測的數(shù)據(jù)量等信息確定上樣量。用Ion Torrent OTTM進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，將Ion PITMEnzyme M ix 120μL、Ion PITMISPs 100μL、稀釋好的文庫和無核酸酶水共400μL加入到PITMMaster M ix中，此時(shí)體積共2 400μL，震蕩離心后分3次勻速緩慢注入到Ion One TouchTMReaction Filter中，并注入200μL Ion One TouchTMReaction Oil，此過程避免注入氣泡，將Ion One TouchTMReaction Filter安裝在Ion One TouchTM2上，選擇相應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。模板制備完成后用One TouchTMES進(jìn)行模板富集。

1.2.3 Ion TorrentProton測序

用Ion Torrent ProtonTM測序儀進(jìn)行測序反應(yīng)，首先進(jìn)行儀器的氯洗和水洗，然后更換初始化芯片進(jìn)行初始化反應(yīng)以調(diào)節(jié)各位置的pH值在一定范圍內(nèi)，將ES制備的模板Loading在PI芯片上，安裝在測序儀相應(yīng)位置，選擇預(yù)先設(shè)置好的Plan進(jìn)行測序反應(yīng)。測序結(jié)束后在Ion Torrent服務(wù)器上運(yùn)行插件分析每個(gè)樣本的38個(gè)致病位點(diǎn)的突變情況。38個(gè)常見致病突變點(diǎn)詳細(xì)信息見表2。

1.3 Sanger一代測序驗(yàn)證方法

將DNA樣本及相應(yīng)的引物打包送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger一代測序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析選用符合方案數(shù)據(jù)，即所有符合試驗(yàn)方案要求的受試者樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，主要采用四格表整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，陽性代表檢測出的含38個(gè)致病突變點(diǎn)的樣本，陰性代表沒檢測出38個(gè)致病突變點(diǎn)的樣本。半導(dǎo)體測序結(jié)果和Sanger一代測序驗(yàn)證結(jié)果對比采用Kappa一致性檢驗(yàn)。

試驗(yàn)真實(shí)性評價(jià)：靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性、Kappa值等指標(biāo)計(jì)算。

用下列公式計(jì)算：

靈敏性=A/（A+C）×100％

特異性=D/（B+D）×100％

準(zhǔn)確性=（A+D）/（A+B+C+D）×100％

Kappa值采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 半導(dǎo)體測序結(jié)果

半導(dǎo)體測序結(jié)果顯示，33個(gè)樣本中共檢測出15例樣本存在突變，包含單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)、插入、刪除的8種突變，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例。檢測的每個(gè)堿基位點(diǎn)的Coverage在390～400，其中13例檢測突變頻率在42.5％～52.8％的為雜合突變型樣本，檢測突變頻率為100％的為純合突變型樣本。突變樣本檢測結(jié)果如表4。

2.2 Sanger一代測序驗(yàn)證結(jié)果

采用Sanger測序法對檢測出的突變樣本的突變點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與半導(dǎo)體測序結(jié)果完全一致。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

根據(jù)檢測結(jié)果得知，A=15，B=0，C=0，D=18，靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性、Kappa值的計(jì)算結(jié)果都為1，結(jié)果表明，半導(dǎo)體測序結(jié)果與Sanger一代測序驗(yàn)證結(jié)果完全一致。

3 討論

據(jù)估算遺傳病在活嬰中的發(fā)病率為23‰～25‰，但由于人口基數(shù)大，遺傳病種類多，總體患病人數(shù)將會是很大的數(shù)目，這無論是對家庭還是對社會都將造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)［19］。且遺傳病在遺傳和臨床上都具有高度異質(zhì)性，患兒出生后即使檢測出患有某種遺傳病也很難治愈，因此，積極開展對新生兒父母的遺傳病基因檢測或者胎兒產(chǎn)前檢測工作，對患者或者及時(shí)采取治療

并提供生育指導(dǎo)，選擇性終止異常胚胎妊娠，可有效防止患病胎兒的出生，并可在胚胎植入前選擇正常的胚胎植入，從而誕生出健康的胎兒。

表4 15例突變樣本檢測結(jié)果Table 4 The test results of 15mutational samples

基因測序是遺傳病檢測的重要手段，Sanger一代測序技術(shù)已成為分析基因序列的金標(biāo)準(zhǔn)，但卻因費(fèi)用高、技術(shù)難度大等原因很難在基層推廣。而近年來以芯片測序、合成測序和焦磷酸測序?yàn)榇淼南乱淮鷾y序技術(shù)能彌補(bǔ)一代測序的不足，實(shí)現(xiàn)快速、通量高的規(guī)模化測序。以Ion Torrent PGMTM以及更高通量的Ion TorrentProtonTM測序儀為代表的半導(dǎo)體測序技術(shù)，其不屬于熒光檢測、核酸標(biāo)記的生化技術(shù)，與其他下一代測序技術(shù)相比更簡單、性價(jià)比更高，并且具有強(qiáng)大的擴(kuò)展性［20?21］。

本實(shí)驗(yàn)中我們用Ion Torrent ProtonTM半導(dǎo)體測序儀對地中海貧血、遺傳性耳聾、苯丙酮尿癥以及肝豆?fàn)詈俗冃圆〕Ｒ姷?8個(gè)致病突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，33個(gè)樣本中共檢測出15例樣本突變，其中HBB：52A＞T 5例、HBB：84_85insC 3例、HBB：45_ 46insG 2例、HBB：2T＞G 1例、GJB3：538C＞T 1例、ATP7B：2333G＞T 1例、GJB2：235delC 1例、SLC26A4：IVS7?2A＞G 1例，檢測結(jié)果與Sanger一代測序驗(yàn)證結(jié)果完全一致。成建等［22］應(yīng)用IonTorrent半導(dǎo)體測序檢測了馬凡綜合征患者FBN1基因致病突變點(diǎn)，檢測到3個(gè)馬凡綜合征家系和1個(gè)馬凡綜合征的致病基因突變，并與Sanger驗(yàn)證結(jié)果一致。周保成等［23］提取15例確診為經(jīng)典型PKU患兒及其父母的外周血DNA，應(yīng)用IonTorrent PGMTM進(jìn)行測序檢測，共檢測出29個(gè)突變點(diǎn)，分屬17種突變，并發(fā)現(xiàn)p.P292L的新突變點(diǎn)，且該檢測結(jié)果與Sanger驗(yàn)證結(jié)果一致。這些研究作為半導(dǎo)體測序技術(shù)應(yīng)用于遺傳病檢測的強(qiáng)有力的證據(jù)，表明高通量的半導(dǎo)體測序技術(shù)應(yīng)用于遺傳病檢測的可行性。

雖然半導(dǎo)體測序技術(shù)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是我們也應(yīng)認(rèn)識到其自身的不足，如測序有單堿基誤差與靶基因目標(biāo)區(qū)域的捕獲存在偏倚，導(dǎo)致少量假陰性的產(chǎn)生，這也是目前下一代測序的瓶頸問題，所以對檢測出的突變位點(diǎn)還應(yīng)進(jìn)行一代測序驗(yàn)證。雖然如此，但半導(dǎo)體測序技術(shù)在遺傳病檢測方面的應(yīng)用還是值得肯定的。同時(shí)，半導(dǎo)體測序技術(shù)在遺傳病檢測方面面臨著一些挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在以下方面：（1）多數(shù)遺傳病遺傳機(jī)制復(fù)雜，遺傳異質(zhì)性高，可能導(dǎo)致部分患者基因型和表型不相符。（2）已報(bào)道的致病位點(diǎn)雖然很多，但對患者篩查過程中，少部分病例檢測到的可能是一些不能解釋的未知突變點(diǎn)，這些突變點(diǎn)致病性還有待驗(yàn)證，如何準(zhǔn)確確定突變點(diǎn)與疾病的是否相關(guān)是目前遇到的又一難題。針對這些問題，筆者認(rèn)為

可從以下方面進(jìn)行解決：（1）改進(jìn)及增強(qiáng)半導(dǎo)體測序信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)換方式。（2）發(fā)展新型統(tǒng)計(jì)模型，優(yōu)化生物學(xué)分析處理方法。（3）研究致病機(jī)制，搞清楚基因型與表型的關(guān)聯(lián)特征。（4）提升科研人員的專業(yè)水平，能認(rèn)識實(shí)驗(yàn)本身及儀器、方法等的不足，在實(shí)際操作過程中盡量避免錯(cuò)誤，減小誤差。

隨著半導(dǎo)體測序技術(shù)的不斷發(fā)展，我們相信目前所面臨的難題將會逐步解決，更好的發(fā)揮半導(dǎo)體測序的優(yōu)勢，在遺傳病檢測領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

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Detection of common mutations in 4 types of genetic disorders by sem iconduc?tor sequencing platform

WANGHuifang1,LIANG Zhikun1,YEQianping1,YANG Xu2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Basic Medical Sciences,Southern MedicalUniversity,Guagngzhou,Guangdong,China,510515)

Objective 38 common pathogenicmutationswhich are related to thalassemia,deafness, phenylketonuria and W ilson's diseasewere detected by using the nextgeneration sequencingmethod in order to evaluate the application value of Sem iconductor sequencing in the field of hereditary disease detection. Methods Targetgeneswere captured by AmpliSeq technology,whichmainly based onmultiple PCR,and the captured fragments were used for construction the DNA libraries,which were sequenced by using the Ion Torrent ProtonTMsequencing platform.Themutations were verified by Sanger sequencing.Results There werewere 15 samplesw ithmutations in 33 samples,and 8mutationswere detected.Among thesemutations,5 caseswerew ith HBB:52A＞T,3 casesw ith HBB:84_85insC,2 cases of HBB:45_46insG,1 case of HBB:2T＞G,1 case of GJB3:538C＞T,1 case of ATP7B:2333G＞T,1 case of GJB2:235delC,1 case of SLC26A4:IVS7?2A＞G. The results of Sanger sequencing were the same w ith the results of the next generation sequencing. Conclusion Semiconductor sequencing can detect the commonmutations of the 4 kinds of hereditary disease accurately,which can be used for mutation detection of these hereditary disease and to illum inate of the pathogenesisof these disorders.

Semiconductor sequencing;Nextgeneration sequencing;Ion Torrent ProtonTM;Hereditary disease;Genemutation

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201504301001493）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司,廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：楊旭，E?mail：yangxu_kuaile@163.com