非小細(xì)胞肺癌組織中ALK、ROS1、RET融合基因檢測(cè)方法的比較

郭文靖 朱安娜 吳英松

·綜述·

非小細(xì)胞肺癌組織中ALK、ROS1、RET融合基因檢測(cè)方法的比較

郭文靖1朱安娜1吳英松2★

非小細(xì)胞肺癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率中高居榜首，是中國(guó)首要的一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年出現(xiàn)的分子靶向藥能顯著改善非小細(xì)胞肺癌患者的生存質(zhì)量，因此對(duì)患者突變基因的準(zhǔn)確檢測(cè)顯得尤為重要。目前臨床上檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者ALK、ROS1、RET融合基因的主要方法有熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及新興起的下一代測(cè)序，但這4種方法優(yōu)缺點(diǎn)各異。本文通過(guò)比較這幾種常見(jiàn)的檢測(cè)方法，為融合基因檢測(cè)方法的選擇提供參考。

非小細(xì)胞肺癌；ALK/ROS1/RET融合基因；熒光原位雜交；下一代測(cè)序

肺癌是當(dāng)今社會(huì)對(duì)人群健康和生命威脅最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］，分別占男女性惡性腫瘤中的第一位和第二位［2］。在中國(guó)，肺癌發(fā)病率和死亡率遠(yuǎn)高于西方國(guó)家，且處于持續(xù)上升狀態(tài)。統(tǒng)計(jì)顯示2015年新增肺癌患者達(dá)22萬(wàn)，死亡人數(shù)高達(dá)15萬(wàn)［2］。肺癌根據(jù)免疫組化主要分為2大類(lèi)：非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC約占85％［3?4］。近幾年，肺癌患者中除了存在常見(jiàn)的腫瘤驅(qū)動(dòng)突變基因EGFR、KRAS、BRAF外，還檢測(cè)到存在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）［5］、c?ros原癌基因1酪氨酸激酶（c?ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）、RET原癌基因（RET proto?onco?gene，RET）基因融合的情況。

目前，主要的治療方式為手術(shù)、化療、放療。但是隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制和分子生物學(xué)的不斷深入研究，針對(duì)常見(jiàn)肺癌融合基因的靶向藥以特異性高，不良反應(yīng)輕而逐漸進(jìn)入人們視野。存在ALK、ROS1融合基因的肺癌患者在臨床中使用克唑替尼（crizotinib）的療效顯著［6?8］。此外，以小分子酪氨酸激酶抑制劑為代表的靶向藥已逐步應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，其中卡博替尼（cabozantinib）治療存在RET融合陽(yáng)性的NSCLC的實(shí)驗(yàn)（NCT01639508）已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)Ⅱ期［9］，靶向藥的出現(xiàn)推動(dòng)了NSCLC治療的發(fā)展。因此，對(duì)肺癌患者融合基因的檢測(cè)，提高患者的生存率具有十分重要的意義。目前臨床上檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者ALK、ROS1、RET融合基因的主要方法有熒光原位雜交、免疫組織化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及新興起的下一代測(cè)序，但這4種方法優(yōu)缺點(diǎn)各異。本文通過(guò)比較這幾種常見(jiàn)的檢測(cè)方法，為融合基因檢測(cè)方法的選擇提供參考。

1 ALK、ROS1、RET基因融合及臨床表現(xiàn)特征

ALK是一種跨膜受體的酪氨酸激酶，屬于胰島素受體家族。ALK主要與棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白（echinoderm m icrotubule associated protein?like 4，EML4）發(fā)生融合，EML4結(jié)構(gòu)中的N末端堿基區(qū)與腫瘤的形成有關(guān)。EML4?ALK融合是因?yàn)?號(hào)染色體短臂發(fā)生倒位，導(dǎo)致EML4的N?末端融合到胞內(nèi)ALK激酶區(qū)域［10］。融合后的EML4啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)EML4?ALK轉(zhuǎn)錄活化表達(dá)融合蛋白，ALK活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。已發(fā)現(xiàn)的融合方式有10多種，其中以V1（EML4的13外顯子斷裂）和V3變體（EML4的6外顯子斷裂）最常見(jiàn)［11］，常見(jiàn)融合類(lèi)型見(jiàn)表1。ALK陽(yáng)性NSCLC是肺癌的一個(gè)特定分子亞型，常見(jiàn)于腺癌中，約占全部NSCLC的5％［12］，多見(jiàn)于年輕、不吸煙或少量吸煙的患者［13］。臨床上多用特異性激酶抑制劑治療EML4?ALK融合患者，能顯著延長(zhǎng)生存期，中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Adm inis?tration，CFDA）已批準(zhǔn)克唑替尼用于治療ALK融合基因陽(yáng)性患者。

ROS1是一種原癌基因，位于6號(hào)染色體上，屬于胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，其細(xì)胞外區(qū)域由6個(gè)重復(fù)序列組成，與纖維連接蛋白具有高度同源性，而纖維連接蛋白在細(xì)胞黏附中伴有重要作用。在NSCLC中ROS1基因與SLC34A2、CD74發(fā)生融合占了50％［14］，主要是由于6號(hào)染色體易位造成的，常見(jiàn)融合見(jiàn)表2。ROS1基因發(fā)生重排時(shí)丟失細(xì)胞外區(qū)域，保留跨膜和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，主要發(fā)生在ROS1基因的32～36外顯子。ROS1融合基因在NSCLC中發(fā)生率約為1％～2％［15］，和ALK相似，常見(jiàn)于年輕、不吸煙或少量吸煙的腺癌患者中［16］。

RET是一種酪氨酸激酶受體，由半胱氨酸組成的細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)、催化酪氨酸激酶作用的細(xì)胞內(nèi)區(qū)組成，位于10號(hào)染色體，DNA全長(zhǎng)為60 kb，含有21個(gè)外顯子，RET參與細(xì)胞增殖、神經(jīng)傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移和細(xì)胞分化。由于10號(hào)染色體發(fā)生臂間倒位［17］，導(dǎo)致和KIF5B發(fā)生基因融合，常見(jiàn)與RET融合基因見(jiàn)表3。KIF5B?RET融合蛋白包含馬達(dá)結(jié)構(gòu)域和KIF5B的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，通過(guò)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的二聚化作用，該融合蛋白的RET酪氨酸激酶活性可異?；罨瑥亩龠M(jìn)肺癌的發(fā)生。KIF5B?RET融合基因在NSCLC中發(fā)生率約為1％～2％［17］，同樣常見(jiàn)于不吸煙的肺腺癌患者中［18］。臨床上常用小分子酪氨酸激酶抑制劑進(jìn)行治療，有臨床報(bào)告顯示肺癌中攜帶RET融合的患者使用卡博替尼、vandetanib（凡德他尼）有一定療效。

2 檢測(cè)ALK、ROS1、RET基因融合的方法及比較

針對(duì)ALK、ROS1、RET基因融合的患者，臨床常用的檢測(cè)方法有熒光原位雜交（fuorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、免疫組織化學(xué)（immuno?histochem istry，IHC）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（re?verse transcription?polymerase chain reaction，RT?PCR）以及新興起的下一代測(cè)序（next?generation sequencing，NGS）。

2.1 熒光原位雜交（FISH）

FISH的基本原理是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記，然后將探針按照堿基互補(bǔ)原則特異性結(jié)合待檢測(cè)的單鏈核苷酸，從而使探針雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針?lè)肿犹禺愋越Y(jié)合來(lái)檢測(cè)DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對(duì)定量分析。針對(duì)檢測(cè)基因是否融合，可以通過(guò)在斷裂位置兩端設(shè)置不同顏色的

探針，在發(fā)生斷裂融合的細(xì)胞中，2種顏色的探針相互分離，而在沒(méi)有發(fā)生斷裂融合的細(xì)胞則表現(xiàn)為2種顏色相互重疊或靠近。

表1 常見(jiàn)與ALK融合的基因及外顯子位置Table 1 Common genes fusew ith ALK and the location of the exons

表2 常見(jiàn)與ROS1融合的基因及外顯子位置Table 2 Common genes fusew ith ROS1 and the location of the exons

表3 常見(jiàn)與RET融合的基因及外顯子位置Table 3 Common genes fusew ith RET and the location of the exons

FISH是目前檢測(cè)肺癌融合基因的“金標(biāo)準(zhǔn)”，確定適合的抗體快速檢測(cè)ALK表達(dá)蛋白是否發(fā)生融合是初步篩查ALK重排的關(guān)鍵［19］。目前常見(jiàn)的商品化試劑盒有Cytocell的ROS1 Dual Color Break Apart Probe，德國(guó)ZytoVision的產(chǎn)品Zyto?Light?SPEC RET Dual Color Break Apart Probe。經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的試劑盒有益善生物技術(shù)股份有限公司的ALK基因重排檢測(cè)試劑盒。雖然FISH專業(yè)性強(qiáng)，但在一次實(shí)驗(yàn)中不能區(qū)分不同類(lèi)型的融合配體，且無(wú)法檢測(cè)RNA編碼和內(nèi)含子異常的情況。在結(jié)果方面需資深人員進(jìn)行判斷，有不少患者用FISH檢測(cè)結(jié)果為陰性，但在藥物治療方面獲得良好的療效［20］。由于FISH是在細(xì)胞層面上進(jìn)行病理學(xué)的分析，但晚期NSCLC患者只能提供極小塊的活檢組織，這導(dǎo)致難以保證有足夠細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性結(jié)果的判讀。

2.2 免疫組織化學(xué)（IHC）

免疫組織化學(xué)根據(jù)抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性特征，將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。目前商品化的ALK IHC染色的抗體主要有D5F3、5A4［21］，常規(guī)的判斷方法如下：腫瘤細(xì)胞無(wú)任何染色，陰性；腫瘤細(xì)胞呈淺棕色，且沒(méi)有任何背景染色，弱陽(yáng)性；腫瘤細(xì)胞呈棕色，陽(yáng)性；腫瘤細(xì)胞呈深棕色，強(qiáng)

陽(yáng)性［22］。經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Adm inistration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市的試劑盒VENTANA ALK（D5F3）CDx Assay采用了兔單克隆抗體檢測(cè)ALK基因融合。IHC簡(jiǎn)便易行，價(jià)格比FISH便宜，操作方法成熟［23］，因而成為臨床診斷常用的篩查方法，推薦條件缺乏的實(shí)驗(yàn)室可采用此方法進(jìn)行小樣本活檢組織的檢測(cè)，但由于IHC陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，不能敏感檢測(cè)出基因蛋白，此方法的準(zhǔn)確性等因素仍在評(píng)價(jià)中［19］，所以對(duì)于陽(yáng)性的樣本必須經(jīng)過(guò)FISH、RT?PCR或NGS中的至少其中一種方法進(jìn)行確認(rèn)。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)是先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板擴(kuò)增合成目的片段，結(jié)合熒光標(biāo)記的方法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，即每循環(huán)一次收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，得到Ct值，從而確定起始模板的拷貝數(shù)。CFDA已認(rèn)證廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司的人類(lèi)EML4?ALK融合基因檢測(cè)試劑盒，但此試劑盒用熒光PCR法只能檢測(cè)少數(shù)幾種已知與ALK融合的基因類(lèi)型，這嚴(yán)重影響了RT?PCR法在臨床上檢測(cè)的應(yīng)用。RT?PCR方法是比FISH、IHC更為敏感的一種檢測(cè)方法［24］，但此方法對(duì)組織RNA質(zhì)量要求高，需要足夠大的引物組以涵蓋所潛在的所有融合基因，而且可能存在大量潛在的基因亞型無(wú)法檢測(cè)［25］。由于PCR可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增造成假陰性的結(jié)果，建議陽(yáng)性樣本再通過(guò)直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證［26］。

2.4 下一代測(cè)序（NGS）

NGS是一種能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序的技術(shù)。傳統(tǒng)獲取生物核苷酸序列的方法主要依靠直接測(cè)序法，即Sanger測(cè)序法，其利用雙脫氧核苷酸末端終止法的原理完成了對(duì)人類(lèi)基因組序列的測(cè)定，但Sanger測(cè)序法無(wú)法檢測(cè)移位或基因拷貝數(shù)變化等基因突變類(lèi)型，難以完成沒(méi)有明確致病基因位點(diǎn)及大樣本突變位點(diǎn)的篩查，且存在高成本的問(wèn)題。隨著千元測(cè)序人類(lèi)基因組的提出，催生了以高通量、信息量大、靈敏度高、低成本著稱的NGS技術(shù)［27］。

NGS各大平臺(tái)在通量、測(cè)序長(zhǎng)度、覆蓋度、運(yùn)行時(shí)間和測(cè)序原理上各異。目前有illum ina的So?lexa、ABI的Solid和Life Technologies的Ion Tor? rent平臺(tái)。NGS技術(shù)主要用于3大方面：針對(duì)疾病的靶向基因測(cè)序，全外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序［28］。NGS技術(shù)主要流程包括患者樣本的采集，DNA/RNA的提取，基于多重PCR方法的文庫(kù)構(gòu)建，目的片段的擴(kuò)增及富集，上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。當(dāng)FISH和IHC結(jié)果異常時(shí)，NGS更被傾向用于進(jìn)行最終確認(rèn)［29］。隨著認(rèn)識(shí)到血液中存在循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），通過(guò)NGS進(jìn)行液體活檢［30］，無(wú)創(chuàng)篩查成為了熱門(mén)研究方向，此不僅有利于腫瘤的早期診斷，還可以動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展，及時(shí)調(diào)整治療方法。目前ThermoFisher的產(chǎn)品oncom ine fusion panel已獲得CE?IVD認(rèn)證，同時(shí)已商品化的試劑盒有ArcherDx的fusionplexTMALK、RET、ROS1 V2 panel。這2款試劑盒都可同時(shí)檢測(cè)ALK、ROS1、RET 3個(gè)融合基因。NGS在檢測(cè)方面所需RNA量少至10 ng，在一次實(shí)驗(yàn)中能靶向獲取目的片段進(jìn)行全部融合基因的分析，且準(zhǔn)確度高；在數(shù)據(jù)分析方面，NGS通量高，信息獲取量大，可以明確各融合基因的配體類(lèi)型［31］，分析自動(dòng)化，并可以通過(guò)優(yōu)化算法［32］，減少人為判斷錯(cuò)誤的情況，但是腫瘤異質(zhì)性的問(wèn)題會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。4種方法相比之下NGS更適合大規(guī)模普查NSCLC的融合基因。

3 展望

肺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到基因、環(huán)境，是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。所幸目前的小分子酪氨酸激酶抑制劑對(duì)有ALK、ROS1、RET融合基因的NSCLC患者存在較好的效果，但是為了更大程度延長(zhǎng)患者生存期，分子靶向治療如何結(jié)合手術(shù)，化療，放療等治療方法是一個(gè)需要臨床試驗(yàn)不斷驗(yàn)證的過(guò)程。在常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)突變基因EGFR、KRAS、BRAF等野生型的非小細(xì)胞肺癌患者中，尋找一種高敏感、高特異性檢測(cè)ALK、ROS1、RET融合基因的方法顯得十分必要。NGS作為一種新興起的檢測(cè)技術(shù)，可同時(shí)對(duì)相應(yīng)突變區(qū)域進(jìn)行高深度測(cè)序，利用生物信息學(xué)最終確認(rèn)融合變異類(lèi)型并不斷發(fā)現(xiàn)新的融合分子類(lèi)型，從而可以用于臨床在最佳治療時(shí)期選擇相應(yīng)的分子靶向藥物，同時(shí)規(guī)避容易耐受的藥物，但相對(duì)傳統(tǒng)在原位進(jìn)行檢測(cè)的方法，NGS仍需多中心、大規(guī)模的臨床驗(yàn)證。若研究成果能用于臨床檢測(cè)，這對(duì)NSCLC患者的早期診斷、治療及預(yù)后具有極其重要的價(jià)值。

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Com parison of detection methods of ALK/ROS1/RET fusion gene in non?small cell lung cancer tissue

GUOWenjing1，ZHU Anna1，WU Yingsong2★
(1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.,Ltd.,Guangzhou,Guangdong,China,510665;2.School of Labratory Medicine and Biotechnology,Southern MedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong,China,510515)

Themorbidity andmortality of non?small lung cancer is the top rate ofmalignant tumor. And it’s one of the important public health problems in China.In recent years,molecular targeted drugs can significantly improve the quality of life of patientsw ith non?small cell lung cancer.Therefore,it’s important to detect mutation accurately.Nowadays there are fluorescence in situ hybridization,immunohistochemistry, reverse transcription?polymerase chain reaction aswell as next?generation sequencing to detect non?small lung cancer.This article compares the commonmethodsused in clinical,in order to provide

for the choice of fusion gene detection.

Non?small cell lung cancer;ALK/ROS1/RET fusion gene;Fluorescence in situ hybridization;Nextgeneration sequencing

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用型專項(xiàng)資金（2015B020233009）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

★通訊作者：吳英松，E?mail：wg@smu.edu.cn