龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌修復(fù)Cd 污染石墨尾礦試驗(yàn)研究①

柳曉光 張亮 劉暢 王雨晨 楊紅霞 宗寶超

中國煤炭地質(zhì)總局地球物理勘探研究院，河北 涿州 072750

廢棄礦山的生態(tài)修復(fù)是我國近年來生態(tài)環(huán)境保護(hù)工作的重點(diǎn)之一，開展礦山生態(tài)修復(fù)也是近年來的熱點(diǎn)工作之一。廢棄礦山通常存在比較嚴(yán)重的土壤污染，尤其是重金屬污染，以石墨礦為例，由于淋濾、滲透作用，尾礦堆及周邊普遍存在明顯的重金屬污染，對植物的生長產(chǎn)生不利影響，并通過食物鏈進(jìn)入人體危害健康。Cd 是石墨尾礦庫的主要重金屬污染元素[1]，是重金屬元素中生物毒性最大的元素之一，對人的腎臟、肺、肝、大腦、骨骼和血液等各系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，具有致癌、致畸、致突變的嚴(yán)重危害[2]。

在對土壤重金屬污染治理的諸多方法中，使用超富集植物對重金屬進(jìn)行吸收是一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法，適合大面積的土地修復(fù)，但存在修復(fù)效率較低的缺陷[3]。土壤中只有一部分活化的離子態(tài)Cd 可以被植物吸收、利用，固化的絡(luò)合態(tài)的Cd 不能被直接吸收活化態(tài)的Cd 稱為有效Cd，有效Cd 在污染土壤Cd 中所占的比例通常是穩(wěn)定的，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)以芽孢桿菌為代表的微生物可以一定程度的提高有效Cd 的比例，提高植物的修復(fù)效率，形成微生物-植物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)。

龍葵（Solanum nigrum L.）是Cd 的超富集植物，具有生物量大、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在修復(fù)Cd 污染中具有較大的潛力，但吸收效率較低[4]。龍葵對重金屬Cd 的積累隨著土壤中該重金屬濃度的增加而增加，提高土壤中有效Cd 的濃度，可有效提高修復(fù)效率[5]。

膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)又稱硅酸鹽細(xì)菌，廣泛存在于自然界中，無毒無害，對環(huán)境比較友好，抗逆性強(qiáng)，可以提高土壤中有效態(tài)Cd 的含量，從而有利于植物對Cd 的吸收[6]。同時，膠質(zhì)芽孢桿菌可以將土壤中的K、P 轉(zhuǎn)換成可溶態(tài)供植物吸收，促進(jìn)植物生長，進(jìn)一步提升超富集植物吸收重金屬的效率[7]。本次通過盆栽試驗(yàn)研究龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌的植物-微生物組合在修復(fù)石墨尾礦砂Cd 污染中的效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤：采自山東平度興強(qiáng)石墨礦尾礦庫，取樣深度為表層30～50cm，對試驗(yàn)用尾礦砂進(jìn)行3mm 過篩處理，篩去大顆粒的石渣、雜草等，分散風(fēng)干，保持干燥，靜置后檢測備用。供試土壤中Cd 含量為0.75mg/kg，有效Cd 的含量為0.065mg/kg，PH 值為7.44。

供試植物：龍葵種子由河北農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所提供。

供試菌劑：膠質(zhì)芽孢桿菌由天津環(huán)微生物技術(shù)有限公司提供，有效菌種數(shù)量為1×109cfu/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)在無菌溫室環(huán)境下進(jìn)行，室內(nèi)環(huán)境溫度控制在25℃左右，濕度保持在50%～60%。每個試驗(yàn)盆裝試驗(yàn)土壤4kg。

試驗(yàn)分為2 組，分別為接種膠質(zhì)芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組和不接種膠質(zhì)芽孢桿菌的對照組，每組包括3 個試驗(yàn)盆栽。

試驗(yàn)組將膠質(zhì)芽孢桿菌干劑添加到海藻有機(jī)肥中，微生物濃度為5×107cfu/g，菌劑與有機(jī)肥充分混合后在20～30℃的環(huán)境下發(fā)酵48h，制備微生物有機(jī)肥，經(jīng)檢測海藻有機(jī)肥中的重金屬含量在檢出限以下，對試驗(yàn)結(jié)果不產(chǎn)生影響。在每盆實(shí)驗(yàn)土壤中添加50g 制備好的微生物有機(jī)肥，作為底肥混拌均勻。對照組添加同等質(zhì)量未接種膠質(zhì)芽孢桿菌的海藻有機(jī)肥。

選取龍葵種子經(jīng)消毒處理后，在30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，發(fā)芽后移至育苗盤，置于溫度25℃左右、濕度50%～60%的環(huán)境下培養(yǎng)。

龍葵育苗、移栽完成后，將膠質(zhì)芽孢桿菌菌劑以1∶500 的比例進(jìn)行稀釋，用專用噴壺均勻的噴灑在植物根部，每個試驗(yàn)盆噴灑30ml。共進(jìn)行2 次微生物的根灌接種，第1 次接種在幼苗移栽成活后的第2 天，第2 次接種在第一次接種的45天之后。

試驗(yàn)第一周行移栽龍葵幼苗定株，保持各試驗(yàn)盆中幼苗數(shù)量3 株，存活數(shù)量未達(dá)到3 株的進(jìn)行補(bǔ)種。為保障植物生長狀態(tài)良好，需每隔2 日對龍葵進(jìn)行灌溉，保持土壤濕潤，并及時調(diào)整綠植對光角度。第六周龍葵由開始的兩片細(xì)葉長出分葉，并且莖部維度增長較快，植物穩(wěn)定性較好。第八周試驗(yàn)組與對照組龍葵生長狀態(tài)出現(xiàn)差異，接種芽孢桿菌的龍葵生長狀態(tài)更好，葉片由細(xì)長變?yōu)闄E圓形。龍葵經(jīng)過15 周生長，完成了一個完整的生長周期，然后開展一系列樣品采集、樣品測試、結(jié)果分析。

2 樣品采集及分析

2.1 樣品采集及分析方法

15 周以后對龍葵植物進(jìn)行采樣。剪摘地上部分烘干稱重后裝袋。土壤樣品在試驗(yàn)盆栽內(nèi)分點(diǎn)采集，點(diǎn)位均勻布置，單個土壤樣品重量不小于200g。土壤中有效Cd 采用DTPA 浸提，植物及土壤中的Cd 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS法測定。

2.2 分析結(jié)果

本次試驗(yàn)對試驗(yàn)前供試土壤、龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌試驗(yàn)組、龍葵對照組進(jìn)行測試分析，分析項(xiàng)目包括土壤中Cd 含量、土壤中有效Cd 含量、土壤PH 值、植物吸收的Cd 含量（表1）。

表1 樣品分析結(jié)果表 Table 1 Analysis result of the samples

3 討論

3.1 龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌對試驗(yàn)土壤中PH的影響

pH 是影響土壤中重金屬生物有效性的重要因素之一[8]，土壤pH 值對植物生長也具有重要影響[9]。植物的生長過程中，根部會產(chǎn)生一系列分泌物，從而改變土壤的理化性質(zhì)。試驗(yàn)前土壤為弱堿性，PH 值為7.44；對照組種植龍葵后土壤樣品的PH 值7.43，二者沒有明顯的變化，龍葵在生長過程中的分泌物對土壤PH 值的影響較?。积埧?膠質(zhì)芽孢桿菌的試驗(yàn)組土壤的pH 值為7.25，有一定程度的降低。試驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)芽孢桿菌可以通過新陳代謝產(chǎn)生草酸、檸檬酸等有機(jī)酸，從而降低PH 值，使偏堿性的尾礦砂趨向酸堿適宜，促進(jìn)植物生長，提高土壤中重金屬的活性。

3.2 膠質(zhì)芽孢桿菌對土壤中Cd 的生物活性及龍葵吸收Cd 濃度的影響

污染土壤中Cd 離子與土壤粒子之間的結(jié)合十分緊密，形成狀態(tài)穩(wěn)定的絡(luò)合物，不容易被超富集植物提取和吸收。膠質(zhì)芽孢桿菌在繁殖、生長的過程中會產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物，楊卓等[10]利用反向高效液相色譜測定膠質(zhì)芽孢桿菌發(fā)酵液中的成分，發(fā)現(xiàn)這些代謝產(chǎn)物包括檸草酸、檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸，而這些有機(jī)酸能改變土壤Cd存在形態(tài)，將更多固化絡(luò)合物狀態(tài)的Cd 轉(zhuǎn)變?yōu)橛行d，提高重金屬的生物活性，促進(jìn)植物對于重金屬的提取和吸收[11]。

有效Cd 的含量決定了植物對Cd 吸收的效率，試驗(yàn)前土壤中的有效Cd 含量為0.065mg/kg，單一種植龍葵的對照組有效Cd 含量0.063mg/kg，單一種植龍葵對土壤中有效Cd 含量的影響極小。龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌的實(shí)驗(yàn)組土壤中有效Cd 含量為0.092mg/kg，與單一種植龍葵的對照組相比有效Cd 的含量提高了46.03%。

膠質(zhì)芽孢桿菌提高了土壤中有效Cd 的含量，可以大幅促進(jìn)龍葵對Cd 的吸收，從而提升龍葵修復(fù)土壤Cd 污染的效率。試驗(yàn)組龍葵在接種膠質(zhì)芽孢桿菌后，龍葵中Cd 的濃度達(dá)到0.84mg/kg，與單一種植龍葵的對照組0.68mg/kg的Cd 濃度相比，接種膠質(zhì)芽孢桿菌將龍葵吸收Cd 的濃度提高了23.53%，富集系數(shù)提高至1.31。

3.3 膠質(zhì)芽孢桿菌對龍葵生物量的影響

龍葵在Cd 的脅迫下生物量有明顯的降低，提高龍葵生物量，尤其是地上可收割部分的生物量，是提高龍葵修復(fù)效率的重要途徑[12]。膠質(zhì)芽孢桿菌具有解磷、解鉀的作用[13]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種芽孢桿菌的龍葵單株平均干重量是對照組的112%，芽孢桿菌可以一定程度促進(jìn)龍葵生長，提高龍葵的生物量，進(jìn)一步提高龍葵對Cd 的吸收效率。

3.4 龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌對土壤的凈化能力

龍葵中的Cd 累積量是該種植物體內(nèi)所累積的某種重金屬濃度與其生物量的乘積[14]。膠質(zhì)芽孢桿菌對龍葵吸收Cd 的效率的提升主要體現(xiàn)在兩個方面：一是通過解磷、解鉀促進(jìn)龍葵生長，提高生物量；二是通過提高土壤中Cd 的生物活性，促進(jìn)龍葵對Cd 的吸收。試驗(yàn)前土壤中Cd 的含量為0.75mg/kg，通過對比試驗(yàn)前、后土壤中Cd 元素的含量，試驗(yàn)組和對照組在種植龍葵后土壤中Cd 含量都有一定程度的降低。在單一生長周期內(nèi)，僅種植龍葵的對照組的凈化率為8%，接種膠質(zhì)芽孢桿菌的試驗(yàn)組凈化率達(dá)到了14.7%，有顯著提高（表2）。使用龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌的植物-微生物組合可有效降低石墨尾礦砂中Cd 的含量，對修復(fù)石墨尾礦砂中重金屬污染有良好的效果，較單獨(dú)種植龍葵效率更高。

表2 試驗(yàn)組合的富集系數(shù)及凈化率 Table 2 Enrichment coefficient and purification rate of the test combination

4 石墨尾礦砂的龍葵種植技術(shù)

本次試驗(yàn)以石墨尾礦砂作為供試土壤，石墨尾礦砂質(zhì)地松散、保水性差、幾乎不含任何營養(yǎng)成分和有機(jī)物，堆積多年都是寸草不生，使用龍葵-膠質(zhì)芽孢桿菌的植物-微生物組合來治理尾礦砂的污染存在實(shí)際工程應(yīng)用難題。

筆者所在研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過多次失敗和方法改進(jìn)后，終于在盆栽試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了在石墨尾礦砂中種植龍葵，除了施肥、灌溉、保溫，保證足夠的養(yǎng)分、水分、空氣以及適宜的溫度外，總結(jié)出幾個關(guān)鍵的技術(shù)要點(diǎn)：

（1）育苗移栽

選擇在培養(yǎng)盒內(nèi)育苗，待幼苗根系生長到一定程度后再移栽的方法。

（2）加蓋遮陽布

幼苗根系十分脆弱，為保證成活率，除了保證足夠水分和適宜溫度外，還要對新移栽的幼苗做避陰處理，因此加蓋了遮陽布，之后枯萎現(xiàn)象逐漸得到恢復(fù)，大面積種植時也可以用薄膜遮陽。

（3）有機(jī)肥粉碎、旁施

由于石墨尾礦砂比較貧瘠，試驗(yàn)前需加入較多的有機(jī)肥，幼苗根系生長鉆進(jìn)這些有機(jī)肥顆粒，容易被過量的營養(yǎng)成分燒死。于是對表層的試驗(yàn)土壤進(jìn)行過篩，將大顆粒的有機(jī)肥進(jìn)行粉碎后，重新加入到試驗(yàn)土壤中，施肥的地點(diǎn)避開幼苗一段距離，幼苗成活率超過80%。

5 結(jié)論

（1）龍葵具有生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，是理想的修復(fù)Cd污染的超富集植物，采取合理的技術(shù)措施可以實(shí)現(xiàn)在石墨尾礦砂中種植。

（2）膠質(zhì)芽孢桿菌通過分泌有機(jī)酸可以有效降低土壤中的PH值，提升土壤中有效Cd的含量，從而促進(jìn)龍葵對Cd的吸收。

（3）膠質(zhì)芽孢桿菌可以通過解磷、解鉀促進(jìn)龍葵生長，提高龍葵的生物量，進(jìn)一步提高龍葵吸收Cd的效率。

（4）試驗(yàn)表明，使用龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌的植物-微生物組合比單獨(dú)種植龍葵在降低石墨尾礦砂中的Cd污染中有更高的效率。

綜上所述，龍葵+膠質(zhì)芽孢桿菌在治理石墨尾礦重金屬污染中有較大的潛力。