高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物肌肉組織中的糖皮質(zhì)激素

龔 蘭 陳 明 魏 嫻 鄒 春 王 冉

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

?

高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定動(dòng)物肌肉組織中的糖皮質(zhì)激素

龔 蘭 陳 明 魏 嫻 鄒 春 王 冉*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，

省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014)

本實(shí)驗(yàn)建立了肌肉組織中氫化可的松、可的松、潑尼松和地塞米松含量的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)檢測方法。樣品經(jīng)酶水解、乙酸乙酯提取、HLB固相萃取凈化，C8色譜柱分離，在多反應(yīng)選擇性監(jiān)測模式(MRM)下采用負(fù)離子模式進(jìn)行信號(hào)采集和測定。4種糖皮質(zhì)激素的檢出限為0.13～0.25 μg/kg，定量限為0.25～0.5 μg/kg。在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2>0.99)。在0.5, 5.0和10.0 μg/kg基質(zhì)加標(biāo)水平下，4種物質(zhì)的平均回收率為74.0%～101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.7%～8.6%。

糖皮質(zhì)激素； 高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜； 固相萃取； 肌肉組織

1 引 言

糖皮質(zhì)激素是一種固醇類激素，在臨床上對(duì)人體有明顯的消炎作用，也可起到免疫抑制和抗過敏作用[1,2]。最早被人們所認(rèn)知的糖皮質(zhì)激素有可的松和氫化可的松，屬于內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素，之后又合成了療效更好的人工糖皮質(zhì)激素，臨床常用的合成糖皮質(zhì)激素有地塞米松、潑尼松和潑尼松龍等，圖1為常見4種糖皮質(zhì)激素結(jié)構(gòu)圖[3～6]。

在動(dòng)物飼養(yǎng)過程中，糖皮質(zhì)激素還可起到生長促進(jìn)作用，因此部分飼養(yǎng)者違規(guī)使用糖皮質(zhì)激素類藥物[7,8]。不恰當(dāng)?shù)氖褂每蓪?dǎo)致動(dòng)物源性食品中藥物殘留，影響食用者健康，如內(nèi)分泌紊亂和消化系統(tǒng)疾病等[9]。因此，許多國家已經(jīng)對(duì)動(dòng)物源食品中合成糖皮質(zhì)激素殘留量進(jìn)行明確、嚴(yán)格的管理和規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部在235號(hào)公告明確指出地塞米松在豬、牛、馬的肌肉和腎臟中不得超過0.75 μg/kg，肝臟中不得高于2 μg/kg，奶中含量不得超過0.3 μg/kg[10]，但沒有對(duì)可的松和氫化可的松進(jìn)行限量規(guī)定。

目前，有許多分析技術(shù)應(yīng)用于檢測分析糖皮質(zhì)激素含量。放射免疫技術(shù)具有迅速、靈敏和高通量的特點(diǎn)，但在常規(guī)篩查中缺乏選擇性[11]。高效液相色譜和氣相色譜無法對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，靈敏度和特異性都無法滿足痕量獸藥殘留分析[12]。氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)雖然靈敏度高，選擇性和特異性好，但是衍生過程繁瑣，不易操作[13]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)是分析動(dòng)物源性食品中痕量獸藥殘留的重要方法，能夠滿足對(duì)低濃度樣品的準(zhǔn)確分析[14,15]。

由于肌肉樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，國內(nèi)對(duì)不同肌肉組織中糖皮質(zhì)激素含量測定的相關(guān)報(bào)道較少。文獻(xiàn)[4]指出部分糖皮質(zhì)激素可與組織蛋白形成共軛化合物，影響提取效率。因此，提取樣品中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的目標(biāo)物，去除雜質(zhì)，減少基質(zhì)干擾是本實(shí)驗(yàn)的主要目的。本研究將對(duì)不同的肌肉組織進(jìn)行酶解處理結(jié)合態(tài)目標(biāo)物，固相萃取法凈化濃縮樣品，經(jīng)LC-MS/MS檢測，建立肌肉組織中氫化可的松、可的松、潑尼松和地塞米松4種糖皮質(zhì)激素含量的檢測方法，為肌肉中測定糖皮質(zhì)激素含量提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)由Agilent 1200和Agilent 6410三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜構(gòu)成，配有電噴霧離子源(ESI)； 氮?dú)獯蹈蓛x(美國Organomation)，MilliQ去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)； 24位固相萃取裝置(美國Supleco公司)； 高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)； 恒溫振蕩培養(yǎng)箱(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

圖1 4種糖皮質(zhì)激素類藥物結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structural formulas of the investigated glucocorticoids

甲醇、甲酸(色譜純，美國Honeywell公司)； 乙酸乙酯、乙酸銨、(分析純，國藥公司)； 超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(>100000 units/mL，上海安譜公司)； Oasis HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL，美國Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品可的松(Cortisone，COR)、氫化可的松(Hydrocortisone，HCOR)、地塞米松(Dexamethasone，DXM)(德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司，純度>97%)； 潑尼松(Predisone，PNS，加拿大TRC公司，純度98%)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，-20℃避光儲(chǔ)存。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以初始流動(dòng)相稀釋得到所需標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品前處理

(1)提取 肌肉組織均質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)組織試樣于50 mL離心管中，加入40 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶和8 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液(pH 5.2)，渦旋混勻，于40℃下避光振蕩6 h。酶解后放置至室溫，渦旋后10000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相，移入另一離心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻，5000 r/min離心5 min； 再將上層有機(jī)相移入另一離心管，下層加入10 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩，5000 r/min離心5 min，合并上層有機(jī)相，50℃氮吹盡干，以5 mL 30%(V/V)甲醇復(fù)溶樣品。

(2)凈化 Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL水、5 mL甲醇活化，樣液全部過柱，再依次加入5 mL水、5 mL甲醇(2∶8，V/V)和5 mL正己烷淋洗、抽干，5 mL甲醇洗脫、收集并抽干，50℃氮?dú)獯蹈桑?.0 mL 30%乙腈-水(V/V)復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測定。

2.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C8(150 mm×2.1 mm，5 μm)進(jìn)行分離，流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.3 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL； 分離梯度洗脫程序?yàn)椋?0～2 min，30%～40% B； 2～7 min，30%～59% B； 7.01 min，30% B。

2.5 質(zhì)譜條件

ESI電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式(ESI)，選擇監(jiān)測掃描模式(MRM)，噴霧器壓力為15 Psi，干燥氣體流速10 L/min、離子源溫度300℃，毛細(xì)管電壓4000 V。各物質(zhì)離子對(duì)優(yōu)化后參數(shù)見表1。

2.6 方法驗(yàn)證

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成0.5, 1.0, 2.0, 5.0，10.0, 20.0和50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取2 g空白樣品,經(jīng)過2.3(1)節(jié)提取后，加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液復(fù)溶，配成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量與定性分析，獲得4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性相關(guān)系數(shù)、方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

取空白樣品，添加3種不同濃度(0.5, 5.0和10 μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平平行測定6次，按照2.3(2)節(jié)進(jìn)行提取凈化，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，確定和計(jì)算方法的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測及質(zhì)譜參數(shù)

Table 1 Mass spectrometric parameters for the target compounds in MRM transition

藥物Substances保留時(shí)間Retentiontime(min)母離子Precursor(m/z)子離子Production(m/z)碎裂電壓Fragmentorationvoltage(V)碰撞能量Collisionenergy(eV)地塞米松Dexamethasone(DXM)9.1437.4391.51154361.4*11512氫化可的松Hydrocordisone(HCOR)7.8407.3361.31105331.2*11010可的松Cortisone(COR)7.5405.4301.11108329.3*11017潑尼松Prednisone(PNS)7.9403.4357.3952327.3*957“*”:定量離子(thequantitativeion)。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正負(fù)離子掃描模式下對(duì)糖皮質(zhì)激素進(jìn)行掃描，結(jié)果表明, ESI-掃描模式下的電噴霧離子化能夠提供更多的碎片信息，同時(shí)靈敏度大幅提高。本實(shí)驗(yàn)以甲酸水作為流動(dòng)相，在ESI-模式下通過全掃描模式發(fā)現(xiàn), [M+HCOO]-豐度含量最高，這是由于目標(biāo)物與甲酸形成共軛離子[M+HCOO]-，鑒于此選擇[M+HCOO]-作為母離子，與文獻(xiàn)[16]一致。在碰撞誘導(dǎo)解離過程中, 母離子在C21羥甲基的位置發(fā)生斷裂，形成特征碎片離子[M-H-CH2O]-，進(jìn)一步誘導(dǎo)解離可以失去H2O, CH4, HF和HCl等分子，產(chǎn)生特征子離子，可進(jìn)行定量分析[17](圖2)。

圖2 4種糖皮質(zhì)激素的[M+HCOO]-精確質(zhì)量數(shù)提取質(zhì)譜圖Fig.2 Exaction product ion spectra of 4 glucocorticoidsHCOR: Hydrocortisone; COR: Cortisone; PNS: Predisione; DXM: Dexamethasone.

3.2 液相條件的優(yōu)化

為了確定最優(yōu)的液相分離條件，選取不同規(guī)格的色譜柱(Agilent SB-C18，150 mm ×2.1 mm，3.5 μm； Agilent XDB-C18，150 mm ×2.1 mm，3.5 μm； Agilent Rx-C8，150 mm ×2.1 mm，5.0 μm和Agilent SB-C18，150 mm ×4.6 mm，5.0 μm)，反相色譜柱C18和C8均可以分離目標(biāo)物，其中Agilent Rx-C8(150 mm ×2.1 mm，5.0 μm)色譜柱分離效果良好，出峰時(shí)間較為合適。

糖皮質(zhì)激素類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此在分離上存在一定的難度。采用甲醇體系時(shí)，各化合物無法完全分離，此時(shí)共流出的雜質(zhì)較多，對(duì)信號(hào)干擾增強(qiáng)，響應(yīng)值較低[13]。乙腈不僅能將二者分離，響應(yīng)值較高，而且可以得到較完美的峰形。甲酸是糖皮質(zhì)激素電離誘導(dǎo)過程不可缺少的物質(zhì),實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲酸含量過低，會(huì)影響目標(biāo)物與甲酸離子的結(jié)合； 甲酸濃度較高，影響目標(biāo)物離子化效率，選擇0.1%甲酸較為合適(圖3)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH值和溫度對(duì)液相分離沒有明顯影響，與文獻(xiàn)[18]一致。

圖3 50 ng/mL的4種糖皮質(zhì)激素類藥物的分離色譜圖(A)和MRM質(zhì)譜圖(B)Fig.3 Separated chromatograms (A) and mutiple reaction monitoring (MRM ) chromatograms (B) of 4 glucocorticoids at 50 ng/mL

3.3 樣品提取

從文獻(xiàn)[2,19]中得知糖皮質(zhì)激素在動(dòng)物體內(nèi)的存在方式有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的共軛態(tài)化合物，因此提高提取效率和獲得較準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)首先需要將這類結(jié)合態(tài)的激素從動(dòng)物組織中釋放出來，通常采用水解方式進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)中堿水解采用1 mol/mL NaOH 8 mL，時(shí)間6 h、溫度40℃； 酸水解8 mL 1 mol/mL HCl，時(shí)間6 h、溫度40℃； 酶水解選取β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，溫度40℃、pH 5.2，時(shí)間6 h。取2 g陽性肉樣，按照上述方案進(jìn)行水解，得出酸水解和酶解的提取率明顯高于堿水解，但酸水解不利于后續(xù)藥物的提取操作，因此選擇酶水解，這與文獻(xiàn)[16]一致。

糖皮質(zhì)激素屬弱極性化合物，易溶于有機(jī)試劑，實(shí)驗(yàn)考察了3種提取試劑：甲醇、乙酸乙酯和叔丁基甲醚。3種物質(zhì)提取效率見表2，甲醇提取后溶液渾濁，樣液不利于后續(xù)SPE凈化，且提取雜質(zhì)較多； 乙酸乙酯萃取效率為86.0%～92.3%，經(jīng)質(zhì)譜測定，目標(biāo)峰無其它基質(zhì)干擾，靈敏度高； 叔丁基甲醚作提取溶劑時(shí)，4種化合物的回收率均低于50%。本研究選乙酸乙酯作為提取劑。

表2 3種有機(jī)試劑萃取效率對(duì)比表

Table 2 Extraction efficiency of 3 kinds of organic reagent

提取試劑Extractionreagent回收率Recovery(%)潑尼松Prednisone可的松Cortisone氫化可的松Hydrocortisone地塞米松Dexamethasone甲醇Methanol24.3±3.026.7±3.624.3±3.644.7±7.5乙酸乙酯Ethylacetate87.7±5.674.3±4.186.0±3.492.3±5.3叔丁基甲醚tert-Butylmethylether42.7±6.945.0±7.844.7±8.544.3±8.9

實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度甲醇溶液復(fù)溶提取后的干物質(zhì)，影響后續(xù)HLB固相萃取小柱凈化效率?？疾炝梭w積分?jǐn)?shù)為10%, 30%, 50%和70%甲醇對(duì)小柱回收率的影響(圖4)，其回收率最高為30%(V/V)甲醇，因?yàn)楦邼舛燃状寂cHLB載體競爭，將弱極性目標(biāo)藥物洗脫下來，而30%甲醇不僅使目標(biāo)物保留在柱體，而且能較好移除部分雜質(zhì)。

3.4 樣品凈化-固相萃取

SPE固相萃取可以減少直接提取帶來的基質(zhì)干擾，實(shí)驗(yàn)考察了4種小柱(Waters Oasis HLB 500 mg，6 mL； 月旭 C18500 mg，6 mL； SUPELCLEAN LC-18 500 mg，3 mL； Waters Silica 500 mg，6 mL)對(duì)回收率的影響，小柱裝載50 μg/L 目標(biāo)化合物，按照萃取柱推薦方法進(jìn)行，回收率結(jié)果(圖5)表明，潑尼松、可的松和氫化可的松回收率最高的是Oasis HLB，平均回收率為87.3%～90.0%，對(duì)4種物質(zhì)有較好的保留;其次是LC-18和Silica，并且發(fā)現(xiàn)C18小柱無法保全部藥物，Silica小柱也有部分藥物損失，導(dǎo)致3種糖皮質(zhì)激素回收率低。4種固相萃取小柱對(duì)地塞米松的提取凈化效率都高于80%，但最理想的是Oasis HLB，平均回收率達(dá)到105.6%。綜上所述，采用HLB可以實(shí)現(xiàn)4種物質(zhì)同時(shí)提取，并達(dá)到較高提取率。

圖4 不同濃度甲醇水復(fù)溶后提取效果對(duì)比圖Fig.4 Comparing of extraction efficienties in different concentrations of methanol-water(V/V)10%CH3OH-H2O; 30%CH3OH-H2O; 50%CH3OH-H2O; 70%CH3OH-H2O.

圖5 糖皮質(zhì)激素在4種固相萃取小柱中的回收率Fig.5 Recoveries of 4 glucocorticoids with different SPEC18; HLB; LC-18; Silica.

洗脫液選取甲醇、乙酸乙酯和正己烷-丙酮(6∶4，V/V)進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯和正己烷-丙酮無法將所有目標(biāo)物有效地從小柱上洗脫下來，回收率低于60%，甲醇洗脫回收率高于70%，鑒于此，選擇甲醇作為最佳的洗脫液。

3.5 線性范圍和檢出限、定量限

檢出限LOD定義為空白樣品3倍信噪比時(shí)的濃度； 定量限LOQ定義為空白樣品10倍信噪比時(shí)的濃度[18]。根據(jù)此要求得到4種物質(zhì)的LOD和LOQ(表3)。選取空白樣品配制成0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 20.0和50.0 μg/L 的7個(gè)系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以目標(biāo)物的峰面積Y對(duì)其含量X(μg/L)進(jìn)行回歸分析，其相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，表明各種糖皮質(zhì)激素在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(表3)。

表3 4種糖皮質(zhì)激素的線性回歸方程和線性范圍

Table 3 Linear ranges and regression equations of 4 glucocorticoids

化合物Substances相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient(R2)線性范圍Linearrange(μg/L)LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)潑尼松PNS0.99950.5～50.00.130.25可的松COR0.99920.5～50.00.130.25氫化可的松HCOR0.99651.0～50.00.250.50地塞米松DXM0.99830.5～50.00.130.25

3.6 方法回收率與精密度

選取豬肉、牛肉、雞肉樣品作為空白基質(zhì)，添加水平為0.5, 5.0和10.0 μg/kg?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)表明： 3種不同基質(zhì)的平均回收率為74.0%～101.8%，RSD低于8.6%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

3.7 實(shí)際樣品分析

利用本方法測定了15份市售肉樣(牛肉、豬肉和雞肉各5份)，部分牛肉、豬肉檢出可的松和氫化可的松，但目前相關(guān)公告沒有界定不同組織中內(nèi)源和外源氫化可的松和可的松的含量。1份牛肉樣品檢出地塞米松超標(biāo)，含量為5.44 μg/kg(表5)。5份雞肉樣品中均未檢出糖皮質(zhì)激素藥物。

4 結(jié) 論

糖皮質(zhì)激素類藥物經(jīng)過酶解作用，將結(jié)合態(tài)藥物從肌肉中解離，乙酸乙酯提取樣液，經(jīng)HLB小柱凈化去除雜質(zhì)，通過LC-MS/MS分離檢測，樣品基質(zhì)干擾小。本方法的靈敏度高，穩(wěn)定性好，能夠同時(shí)檢測肌肉組織中內(nèi)源和外源糖皮質(zhì)激素。

表4 牛肉、豬肉和雞肉中4種糖皮質(zhì)激素的加標(biāo)回收率及精密度(n=6)

Table 4 Spike recoveries and precision for 4 glucocorticoids in beef，pork and chicken(n=6)

基質(zhì)Material化合物Substance0.5μg/kg回收率Recovery(%)RSD(%)5.0μg/kg回收率Recovery(%)RSD(%)10.0μg/kg回收率Recovery(%)RSD(%)牛肉Beef豬肉Pork雞肉Chicken潑尼松PNS87.24.980.08.583.01.4可的松COR92.85.189.98.683.33.7氫化可的松HCOR88.63.997.75.498.47.0地塞米松DXM101.86.895.44.888.52.1潑尼松PNS79.24.374.03.576.50.7可的松COR85.13.991.94.097.12.7氫化可的松HCOR88.22.898.24.9101.72.1地塞米松DXM98.46.277.78.377.74.0潑尼松PNS81.95.984.53.582.35.9可的松COR87.94.896.97.276.24.4氫化可的松HCOR93.85.296.21.879.77.1地塞米松DXM100.82.675.04.084.56.3

表5 樣品的測定結(jié)果

Table 5 Detection results of real samples

樣品Sample樣品編號(hào)Samplecode檢測結(jié)果Found(μg/kg)地塞米松DXM潑尼松PNS可的松COR氫化可的松HCOR牛肉Beef豬肉Pork1NDNDND1.422NDNDND1.393NDND1.252.4945.44NDND1.805NDNDNDND1NDND1.002.882NDNDNDND3NDNDNDND4NDND0.3611.555NDNDND2.06ND:未檢出(Notdetected)。

1 CUI Xiao-Liang, SHAO Bing, ZHAO Rong, TU Xiao-Ming.ChineseJournalofChromatography, 2006, 24(3): 213-217

崔曉亮, 邵 兵, 趙 榕, 涂曉明. 色譜, 2006, 24(3): 213-217

2 Deceuninck Y, Bichon E, Monteau F, Dervilly G P, Antignac J P, Bizec B L.J.Chromatogr.A, 2013, 1294: 76-86

3 SUN Xue-Ting, SHANG Shao-Ming, CHEN Xiu-Ying, WANG Yun, LI Juan.ChineseJ.Anal.Chem., 2014, 42(1): 36-40

孫雪婷, 商少明 , 陳秀英, 汪 云, 李 娟. 分析化學(xué), 2014, 42(1): 36-40

4 Cuzzola A, Mazzini F, Petri A.J.Phar.Biomed.Anal., 2014, 94: 203-209

5 De Clercq N, Julie V B, Croubels S, Delahaut P, Vamhaecke L.J.Chromatogr.A, 2013, 1301(2): 111-121

6 LI Fei, GU Li-Li, ZHANG Yan, ZHAO Bao-Hua.FoodScience, 2010, 31(2): 154-156

李 飛, 谷麗麗, 張 巖, 趙寶華. 食品科學(xué), 2010, 31(2): 154-156

7 Cherlet M, de Baere S, de Backer P.J.Chromatogr.B, 2004, 805(1): 57-65

8 Courtheyn D, Le Bizec B, Brambilla G, De Brabander H F, Cobbaert E, van de Wiele M, Vercammen J, de Wasch K.Anal.Chim.Acta., 2002, 473(1): 71-82

9 NIU Jin-Yang, SHI Hong-Xia.FoodScience, 2010, 31: 212-214

牛晉陽, 時(shí)宏霞. 食品科學(xué), 2010, 31: 212-214

10 Ministry of Agriculture.No. 235BulletinoftheMinistryofAgricultureofthePeople′sRepublicofChina. [2008-06-29]

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào). [2008-06-29]

http://yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

11 Difrancesco R, Frerichs V, Donnelly J, Hagler C, Hochreiter J, Tornatore K M.J.Chromatogr.B., 2007, 859(1): 42-51

12 XU Jin-Zhong, ZHANG Xiao-Yan, DING Tao, WU Bin, SHEN Chong-Yu, JIANG Tuan, LIU Fei.ChineseJ.Anal.Chem., 2009, 37(3): 341-346

徐錦忠, 張曉燕, 丁 濤, 吳 斌, 沈崇鈺, 蔣 原, 劉 飛. 分析化學(xué), 2009, 37(3): 341-346

13 YAN Hua, YUN Huan, LIU Xin, CUI Feng-Yun, LI Jian-Hui, GAO Yang-Yang, ZHANG Bin, DING Shuang-Yang, ZHANG Chao-Hui.JournalofInstrumentalAnalysis, 2013, 32(8): 909-914

嚴(yán) 華, 云 環(huán), 劉 鑫, 崔鳳云, 李建輝, 高洋洋, 張 杉, 丁雙陽, 張朝輝. 分析測試學(xué)報(bào), 2013, 32(8): 909-914

14 Herrero P, Borrull F, Pocurull E, Marcé R M.J.Chromatogr.A, 2012, 1224: 19-26

15 Callejas S L, Biddlecombe R A, Jones A E, Joyce K B, Pereira A I, Pleasance S.J.Chromatogr.B, 1998, 718: 243-250

16 van den Hauwe O, Dumoulin F, Antignac J P, Bouche M P, Elliott C, van Peteghem C.Anal.Chim.Acta, 2002, 473: 127-134

17 Cherlet M, de Baere S, de Backer P, Marcé R M.J.Chromatogr.A, 2004, 805: 57-65

18 Herrero P, Borrull F, Pocurull E.J.Chromatogr.A, 2012, 1224: 19-26

19 van den Hauwe O, Dumoulin F, Elliott C, Peteghem C V.J.Chromatogr.B, 2005, 817: 215-223

(Received 15 July 2015; accepted 14 October 2015)

This work was support by the National Natural Science Foundation of China (No. 31302009)

Determination of Glucocorticoids in Muscle Tissues by Liquid Chromatography-Electrospray Tandem Mass Spectrometry

GONG Lan, CHEN Ming, WEI Xian, ZOU Chun, WANG Ran*

(InstituteofFoodQualityandSafety,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofControlTechnologyandStandardforAgro-productSafetyandQualityMinistryofAgriculture,JiangsuKeyLaboratoryofFoodQualityandSafety-StateKeyLaboratoryCultivationBaseofMOST,Nanjing210014,China)

A method was developed to determine cortisone, cortisol, prednisone and dexamethasone in muscle tissues by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Deconjugation of glucocorticoids was carried out by enzymatic hydrolysis. These preliminary steps were followed by ethyl acetate extraction and HLB solid phase extraction clean up step for all matrices. Chromatographic separation was achieved on C8column and MS/MS data were obtained in the multiple reaction monitoring mode using negative electrospray ionization. Calibration graphs were prepared in the 0.5-50.0 μg/L range and good linearity was achieved (R2≥0.99).The limits of detection (LOQ) and the limits of quantification (LOD) were 0.13-0.25 μg/kg and 0.25-0.50 μg/kg, respectively. Spiking at the levels of 0.5, 5.0 and 10.0 μg/L, the average recovery for glucocorticoids ranged from 74.0% to 101.8%. The relative standard deviations (RSD) were between 0.7%-8.6%.

Glucocorticoids； High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; Solid-phase extraction; Muscle tissues

10.11895/j.issn.0253-3820.150561

本文系國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31302009)

2015-07-15收稿； 2015-10-14接受

* E-mail: wangran2001@126.com