微乳液毛細管電動色譜法測定大鼠滑膜細胞中雷公藤甲素的含量

林詩瑤 叢日琳 李 琦 孫照霞 徐 偉 沙 玫 余麗雙

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122)

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微乳液毛細管電動色譜法測定大鼠滑膜細胞中雷公藤甲素的含量

林詩瑤 叢日琳 李 琦 孫照霞 徐 偉 沙 玫 余麗雙*

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122)

建立微乳液毛細管電動色譜法快速測定大鼠滑膜細胞內(nèi)外液中雷公藤甲素含量的方法。在雷公藤甲素不同給藥時間孵育條件下，將滑膜細胞分為空白對照組和給藥組，測定滑膜細胞內(nèi)外液中雷公藤甲素含量，并比較了細胞外液中雷公藤甲素在不同給藥時間的含量變化。毛細管電泳運行緩沖液組成：1%(w/V)SDS，3%(V/V)正丁醇，1%(V/V)乙酸乙酯，96%(V/V)5 mmol/L硼砂-10 mmol/L磷酸鹽溶液, pH 9.0； 運行電壓：25 kV； 壓力進樣：0.5 psi×6 s；電泳操作溫度：25℃；檢測波長：214 nm。結(jié)果表明，細胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素所呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9995和 0.9991。當給藥24 h時，細胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素濃度分別為0.736和20.745 μg/mL。本方法簡單準確、靈敏度高、精密度好，可用于滑膜細胞內(nèi)外液中雷公藤甲素濃度的動態(tài)變化規(guī)律研究，為進一步研究中藥有效成分對滑膜細胞功能和活性的影響提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

微乳液毛細管電動色譜；滑膜細胞；雷公藤甲素

1 引 言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，以多關(guān)節(jié)炎癥、滑膜增生和骨侵蝕為基本特征在我國的患病率高，是造成人群喪失勞動力和致殘的主要疾病之一[1]。滑膜炎是發(fā)生在關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織的一種炎性病變，滑膜炎伴大量血管翳形成是導(dǎo)致RA骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞的主要原因[2]。

現(xiàn)代臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要采用非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、腎上腺皮質(zhì)激素類藥等。已有文獻報道，衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)對治療免疫性炎癥反應(yīng)性疾病具有一定療效[3]。雷公藤甲素(Triptolide，TP，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)是從雷公藤中分離出來的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤治療RA的主要有效成分之一，其具有抗炎免疫功效。目前，以雷公藤甲素為主要活性成分的多種雷公藤提取物在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效確切，已得到廣泛認可[4]。對TP在RA治療研究主要集中在其作用機理上，而文獻報道中，大多是在中藥材[5]、動物血液和尿液等體液中對TP的檢測，尚未見細胞液中TP含量測定的報道。細胞內(nèi)、外液中TP的含量直觀反映了其在生物體內(nèi)的代謝情況，為藥代動力學(xué)的研究提供更為有利的依據(jù)，因此對雷公藤甲素在生物細胞中的含量測定具有重要的實際應(yīng)用價值。

1991年，Watarai首次應(yīng)用微乳液作為毛細管電泳的分離介質(zhì)，從而形成了一種新的毛細管電泳技術(shù)-微乳液毛細管電動色譜法(Microemulsion eletrokinetic chromatography，MEEKC)[6～8]。MEEKC是在電滲流的驅(qū)動下，對陰離子、陽離子和中性物質(zhì)同時進行分離的一種CE模式[9]，多用于藥物分析[10,11]、生物樣品或代謝產(chǎn)物分析[12]等方面。相比于HPLC，MEEKC具有分析速度快、試劑消耗少、分析成本低等優(yōu)勢。

目前，MEEKC在滑膜細胞液中藥物含量測定未見報道，因此本研究以大鼠滑膜細胞為研究對象，利用微乳液毛細管電動色譜法，測定大鼠滑膜細胞內(nèi)、外液中雷公藤甲素的含量，為雷公藤甲素在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究提供一種快速可行的含量檢測新方法，亦進一步拓寬MEEKC的應(yīng)用范圍，為細胞中藥物代謝研究提供新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試藥

P/ACETM MDQ型毛細管電泳儀，配備DAD檢測器和32 Karat 5.0工作站(美國Beckman公司)；彈性石英毛細管(內(nèi)徑75 μm，總長60.5 cm，有效長度50 cm)；Starter 3C型酸度計(上海奧豪斯儀器有限公司)；XS105電子分析天平(METTLER TOLEDO); KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); QL-861型渦旋儀(江蘇海門其林貝爾有限公司)。

RPM DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，美國Gibco公司)； 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液(HyClone公司)； 雷公藤甲素標準品(批號：111567-200502，中國藥品生物制品檢定所)； PBS液均按標準配制(pH 7.4); 二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司); 十二烷基硫酸鈉(SDS，合肥新恩源生物科技有限公司); 乙酸乙酯、正丁醇為色譜純試劑，硼砂、NaH2PO4(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。實驗用水為Milli-Q系統(tǒng)(Millipore公司)處理的超純水。

2.2 對照品溶液配制

稱取雷公藤甲素對照品適量，用甲醇溶解并制成1 mg/mL的樣品儲備液。

稱定雷公藤甲素對照品適量，用含有0.5% DMSO的培養(yǎng)基溶解并制成濃度為1 mg/mL 的溶液，細胞給藥時可用培養(yǎng)基稀釋。

2.3 細胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的大鼠滑膜細胞，將凍存管立即投入37℃水浴鍋中，迅速搖動，待凍存液完全溶解后(約1.5 min)，用酒精擦拭凍存管外壁，放于超凈工作臺。吸取細胞懸液至裝有5倍體積培養(yǎng)基的離心管中，低速(800 r/min) 離心5 min。棄掉上清液，加1 mL培養(yǎng)基，輕輕將細胞吹打混勻，傳代至25 cm2的培養(yǎng)瓶中。標記后，放到37℃、5% CO2飽和濃度的培養(yǎng)箱中孵育，待細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)基。每3天換一次培養(yǎng)基，至細胞生長狀態(tài)極佳融合時開始實驗。

2.4 雷公藤甲素對滑膜細胞的處理

在滑膜細胞生長狀態(tài)極佳融合時，棄去舊培養(yǎng)液，以PBS液沖洗細胞2次，用0.25%胰酶于室溫條件下消化細胞，3 min后，加入2倍體積的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細胞，使細胞脫離培養(yǎng)瓶內(nèi)壁，吸取出細胞懸液至離心管中，低速(800 r/min) 離心5 min。棄上清液，加入2 mL培養(yǎng)基吹打混勻，并進行細胞計數(shù)。以PBS液將細胞調(diào)整為終密度1×105cell/mL的細胞懸液，接種于24孔板中，置培養(yǎng)箱孵育24 h，使細胞貼壁。

實驗分為空白對照組與給藥處理組。待細胞完全貼壁后棄掉舊培養(yǎng)基，給藥處理組分為4組，分別用含25 μg/mL雷公藤甲素的培養(yǎng)液處理0, 6, 10和24 h?？瞻讓φ战M加入相同濃度配藥所用的DMSO和培養(yǎng)基。然后各實驗組均于37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)孵育。

2.5 樣品的處理方法

2.5.1 細胞外液中雷公藤甲素的處理 取各實驗組對數(shù)生長期細胞的培養(yǎng)液，以1∶2的體積比加入甲醇渦旋混勻后，離心10 min (14000 r/min ) 以除去蛋白，待上清液氮氣吹干后，用50%的甲醇渦旋1 min復(fù)溶，離心10 min (14000 r/min )，取上清液進行分析。

2.5.2 細胞內(nèi)液中雷公藤甲素的處理 吸掉培養(yǎng)液后，每孔加入300 μL裂解液，冰浴裂解1 h，取各實驗組裂解后的細胞液，參照“2.5.1項”中細胞外液的處理方法進行操作，然后分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 MEEKC分離及工作條件

未涂層毛細管： 60.5 cm×75 μm (有效長度為50 cm)；電泳運行緩沖液組成： 1%(w/V)SDS，3%(V/V)正丁醇，1%(V/V)乙酸乙酯，96%(V/V)5 mmol/L硼砂-10 mmol/L磷酸鹽溶液, pH 9.0, 超聲30 min得到的透明、穩(wěn)定的微乳液(使用前需過0.22 μm微孔濾膜)；運行電壓：25 kV；電泳實驗操作溫度：25℃；檢測波長：214 nm，壓力進樣0.5 psi× 6 s。新的毛細管使用前需要活化，即分別用水、0.1 mol/L HCl、水、0.1 mol/L NaOH、水各沖洗20 min；每次進樣前，需用分離緩沖溶液沖洗2 min，每次更換樣品時需同時更換新鮮分離緩沖溶液，以保證遷移時間和峰面積的重現(xiàn)性。

在上述條件下，雷公藤甲素標準品的電泳色譜圖如圖1所示。

圖1 雷公藤甲素結(jié)構(gòu)及其對照品的電泳譜圖Fig.1 Structure and electropherogram of standard triptolide

3.2 MEEKC方法特性

3.2.1 線性關(guān)系實驗 取適量雷公藤甲素對照品溶液用超純水依次稀釋成25, 20, 15, 10, 5和1 μg/mL 的雷公藤甲素標準溶液。按“3.1項”電泳工作條件進行MEEKC分析，以雷公藤甲素濃度為橫坐標(x)，雷公藤甲素的峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸。細胞內(nèi)液在1.0～15.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其標準曲線為y=420.95x-156.14(r=0.9995)；細胞外液在5.0～25.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其標準曲線為y=282.83x+261.5(r=0.9991)。

3.2.2 專屬性試驗 取給藥處理組的細胞內(nèi)液和外液，分別加入適量濃度的雷公藤甲素對照品溶液，按照“2.5項”的樣品處理方法操作，并進行MEEKC分析，并與空白對照組樣品和給藥處理組樣品進行比較，結(jié)果如圖2和圖3所示。實驗表明，細胞內(nèi)、外液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標成分的測定，專屬性良好。

圖2 細胞內(nèi)液樣品的電泳譜圖(1為雷公藤甲素峰)Fig.2 Electropherogram of intracellular samples (Peak 1 was assigned as triptolide)a： 細胞內(nèi)液空白樣品； b： 細胞內(nèi)液樣品； c： 細胞內(nèi)液加標樣品。a: Control sample; b. Intracellular sample; c. Sample spiked with standard solution.

圖3 細胞外液樣品的電泳譜圖(1為雷公藤甲素峰)Fig.3 Electropherogram of extracellular samples (Peak 1 was assigned as triptolide)d. 細胞外液空白樣品；e. 細胞內(nèi)液樣品；f. 細胞內(nèi)液加標樣品。d. Control sample, e. Intracellular sample, f. Sample spiked with standard solutions

3.2.3 精密度實驗 取一定濃度的雷公藤甲素標準品溶液，連續(xù)進樣測定5次，記錄峰面積和遷移時間。結(jié)果表明，雷公藤甲素峰面積的RSD為3.4%，遷移時間的RSD為1.0%，RSD均小于5%，說明方法的精密度良好。

3.3 細胞內(nèi)/外液中雷公藤甲素含量的測定

采用MEEKC法分別測定空白對照組和給藥處理0, 6, 10和24 h細胞內(nèi)液、外液樣品，以標準加入法定性，其譜圖(給藥處理24 h)如圖2和3所示，細胞內(nèi)液、外液樣品中的雷公藤甲素均可進行定性分析。通過外標法測定細胞內(nèi)液、外液樣品中雷公藤甲素的含量，不同給藥時間的細胞外液中雷公藤甲素的含量如表1所示，其濃度與給藥時間的關(guān)系如圖4所示；給藥處理24 h細胞內(nèi)外液樣品中雷公藤甲素的含量見表2。

3.4 回收率實驗

準確吸取一定濃度的給藥處理24 h細胞內(nèi)、外液樣品，分別加入適量的雷公藤甲素標準品溶液，利用已建立的MEEKC方法測定細胞內(nèi)、外液中雷公藤甲素的峰面積，平行測定3次，根據(jù)當天所建立的標準曲線，計算平均回收率，結(jié)果如表2所示。

表1 不同給藥時間的細胞外液中雷公藤甲素對應(yīng)的峰面積和含量

Table 1 Peak area and concentration of triptolide of various delivery time in extracellular samples

給藥時間Deliverytime(h)峰面積Peakarea濃度Concentration(μg/mL)0247125.006233923.5010231223.2024209520.74

表2 細胞內(nèi)外液樣品中雷公藤甲素含量的測定結(jié)果

Table 2 Results of triptolide determination in synoviocyte samples

樣品Samples(24h)峰面積Peakarea濃度Concentration(μg/mL)回收率Recovery(%,n=3)細胞內(nèi)液Intracellularsamples3080.736119.0細胞外液Extracellularsamples209520.74103.8

圖4 細胞外液中雷公藤甲素濃度與給藥時間的關(guān)系Fig.4 Relationship of triptolide concentration and delivery time inextracellular samples

3.5 甲醇用量對雷公藤甲素分離的影響討論

實驗發(fā)現(xiàn)，復(fù)溶雷公藤甲素的甲醇含量直接影響毛細管電泳的檢測效果。甲醇百分比含量過高，易造成電泳進樣時堵管，基線不穩(wěn)定，影響測定；甲醇含量太低，則易造成復(fù)溶時雷公藤甲素?zé)o法全部溶到甲醇溶液中，導(dǎo)致檢測成分喪失，影響檢測結(jié)果。綜合上述因素及檢測效果，本實驗選擇50%甲醇溶液復(fù)溶雷公藤甲素。

4 結(jié) 論

利用微乳液毛細管電動色譜法對大鼠滑膜細胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素進行了定性定量分析。在所建立的分離檢測條件下，雷公藤甲素在6 min內(nèi)出峰，并且出峰穩(wěn)定。方法學(xué)考察表明，本方法重現(xiàn)性好，精密度高，能快速有效地實現(xiàn)目標成分的分離，避免了其它內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，樣品含量測定和回收率結(jié)果令人滿意，可用于滑膜細胞中雷公藤甲素的藥物濃度測定。本方法為測定滑膜細胞中藥物代謝過程的殘留含量提供方法學(xué)基礎(chǔ)，其可與其它藥理研究方法相互補充，為雷公藤甲素在臨床上治療滑膜炎奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。

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(Received 13 June 2015; accepted 12 September 2015)

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81202913)

Determination of Triptolide in Rat Synoviocytes by Microemulsion Electrokinetic Chromatography

LIN Shi-Yao, CONG Ri-Lin, LI Qi, SUN Zhao-Xia, XU Wei, SHA Mei, YU Li-Shuang*

(CollegeofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

A method was established for the determination of triptolide in rat synoviocytes by microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC). Synoviocytes were divided into control groups and treatment groups by the different administration time of triptolide, and the concentrations of triptolide in intercellular and extracellular fluid were determined. The determination of triptolide by MEEKC was performed at 25℃ under the conditions including running buffer of 5 mmol/L borate-10 mmol/L phosphate (96%,V/V, pH 9.0) with 1% SDS (w/V), 3% 1-butanol (V/V) and 1% ethyl acetate (V/V), 25 kV of running voltage, 3.45 kPa×6 s of inject pressure and 214 nm of test wavelength. The results showed that triptolide was baseline separation, and there was a good linearity for triptolide in intercellular and extracellular of synoviocytes and the correlation coefficients were 0.9995 and 0.9991, respectively. The concentrations of triptolide in intercellular and extracellular of synoviocytes were 0.736 μg/mL and 20.745 μg/mL, respectively. The present method is simple, accurate, sensitive and precise, and can be used to study dynamic change of the triptolide concentration in rat synoviocytes and provide methodology basis for further study the influence of effective compounds of TCM on synoviocytes' function and activity.

Microemulsion electrokinetic chromatography; Synoviocytes; Triptolide

10.11895/j.issn.0253-3820.150393

本文系由國家自然科學(xué)基金項目(No.81202913)；福建省科技廳社會發(fā)展重點項目(No.2013Y0057)、福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(No.2014-ZQN-JC-27)、福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題-重點學(xué)科專項(No.X2014133-學(xué)科)資助

2015-06-13收稿; 2015-09-12接受

* E-mail: sly2018@126.com