G6P［5］型牛輪狀病毒的分離鑒定

聞曉波，張玲玲，倪宏波，劉陽陽，曹思，冉旭華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院/動物醫(yī)學省重點實驗室，大慶163319）

G6P［5］型牛輪狀病毒的分離鑒定

聞曉波，張玲玲，倪宏波，劉陽陽，曹思，冉旭華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院/動物醫(yī)學省重點實驗室，大慶163319）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是全世界范圍內(nèi)引發(fā)多種幼齡動物及嬰幼兒病毒性腹瀉的最主要病原之一，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康造成嚴重危害。通過RT-PCR對來自寧夏犢牛腹瀉糞樣進行檢測，選取陽性樣品經(jīng)MA104細胞進行病毒分離。細胞盲傳4代后出現(xiàn)CPE，至7代后細胞CPE現(xiàn)象明顯，獲得1株牛輪狀病毒，擴增VP7、VP4基因并測序分析，結(jié)果表明該分離株屬于G6P［5］型輪狀病毒，命名為NX28。研究明確了G6P［5］型在國內(nèi)牛群中的存在及流行，并為下一步的牛輪狀病毒的分子流行病學研究奠定基礎(chǔ)。

牛；輪狀病毒；基因型；G基因型；P基因型

輪狀病毒（Rotavirus，RV）是全世界范圍內(nèi)引發(fā)多種幼齡動物及嬰幼兒腹瀉的最主要病原之一，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康造成嚴重危害［1-2］。牛輪狀病毒（bovine rotavirus，BRV）性腹瀉是由牛輪狀病毒病毒引起的主要以腹瀉、精神沉郁、厭食、脫水為特征，其中7日齡以內(nèi)犢牛最易感染，發(fā)病率高達90%～100%，病死率達10%～50%。以英國為例，犢牛輪狀病毒性腹瀉的發(fā)病率為60%～80%，死亡率最高可達50%［3］。

RV為呼腸孤病毒科成員，呈二十面體結(jié)構(gòu)，三層蛋白衣殼包繞著11節(jié)段的dsRNA，其基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和6種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中外層衣殼由VP7和VP4蛋白組成，兩者在病毒侵入、致病性以及RV感染組織嗜性上均起到重要作用，且均能夠獨立誘導中和抗體。VP7和VP4分別決定了RV的G基因型和P基因型。

1969 年美國Mebus等［4-5］首次通過電鏡從犢牛腹瀉糞便中鑒定出BRV，目前BRV呈全球性分布，給養(yǎng)牛業(yè)造成加大的經(jīng)濟損失。1981年我國首次于水牛、黃牛的腹瀉樣品中鑒定出BRV。哈爾濱獸醫(yī)研究所于力課題組對2005～2006年期間在對來自國內(nèi)12個地區(qū)收集的1 760份牛血清進行血清流行病學調(diào)查，總體陽性率高達99%，只是不同地區(qū)強陽性、中等陽性及弱陽性血清所占比例有所不同。數(shù)據(jù)表明BRV在國內(nèi)牛群中的感染和流行不但非常廣泛，而且極為嚴重［6］。近年來，隨著我國養(yǎng)牛業(yè)的大力發(fā)展及進口牛只的增多，BRV流行株的基因型也呈多樣化。例如，黑龍江八一農(nóng)墾大學侯喜林課題組于2008年12月至次年6月在大慶地區(qū)分離出G10P［11］型RV［7］。常繼濤等在新疆和內(nèi)蒙古地區(qū)分離出G10（G10P［11］）和G6（P基因型未知）型BRV［6］。因RNA病毒易通過點突變完成抗原變異或者抗原漂移，更重要的是RV為分節(jié)段的雙鏈RNA病毒，又可以通過基因重配機制來實現(xiàn)抗原變異，甚至擴大宿主范圍。例如從牛群中分離到一株禽源的G17P［17］基因型輪狀病毒（Bo/993/83），推測其為種間傳播的結(jié)果［8］。所以，掌握流行毒株的基因型不但為疾病的防控提供依據(jù)，而且更為評估疫苗免疫效力及新疫苗的研發(fā)提供指導。

研究中，利用RT-PCR方法鑒定來源于寧夏銀川犢牛腹瀉糞樣，陽性樣品經(jīng)細胞分離，成功的分離到一株犢牛輪狀病毒。選取VP4、VP7基因上相對保守區(qū)設(shè)計引物，擴增片段經(jīng)測序驗證，與GenBank所公布的牛輪狀病毒經(jīng)典參考毒株構(gòu)建進化樹，證實所分離的BRV為G6P型［5］，為我國牛輪狀病毒的鑒定、診斷及防治提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及主要試劑

E.coli TOP 10感受態(tài)細胞、pMD-19T Simple克隆載體、DNA Marker（TaKaRa）、TRIzo（lInvitrgon）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific），質(zhì)粒小提試劑盒（Axygen），GoTaqGreen Master Mix（Promega），DMEM（Gibco BRL），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上公布的BRV參考序列設(shè)計鑒定引物RV Up/Low（VP6基因）及VP4、VP7擴增引物，委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成，序列如下：

表1 輪狀病毒引物序列信息Table 1The sequence of primers

1.2.2 病料處理

來自寧夏回族自治區(qū)某規(guī)?；鰻倥８篂a糞便，以0.01 mol·L-1PBS（pH 7.4）制成20%糞便懸液，2 000 rpm 4℃離心10 min，取上清（1 mL）經(jīng)濾過除菌，300 μL用于RNA提取，剩余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 BRV鑒定

取糞樣上清300 μL，TRIzol提取總RNA，參照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，體系如下：RNA 3 μL，隨機引物1 μL，Nuclease-free water 8.5 μL，65℃5 min，冰浴2 min；加入5×Reaction buffer 4 μL，dNTP（10 mmol·L-1）2 μL，RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL，RiboLock RNase Inhibitor 0.5 μL，42℃2 h，70℃10 min。PCR反應體系如下：GoTaq○RGreen Master Mix 12.5 μL，cDNA3 μL， Up/Low引物各1 μL，ddH2O補至25 μL；PCR參數(shù)：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.4 病毒擴增

取過濾的BRV陽性樣品糞便上清以胰酶（終濃度5 μg·mL-1）于37℃處理30 min，PBS洗滌MA104單層細胞（25 cm2）3遍。處理后樣品接種細胞，37℃吸附1 h后，補加5 mL DMEM（含0.5 μg·mL-1胰酶），37℃于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，盲傳3-5代，直至產(chǎn)生細胞病變（CPE），所分離的病毒命名為NX28。

1.2.5 VP4、VP7基因的擴增

取600 μL病毒液，提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，取cDNA以VP4 Up/Low、VP7 Up/Low分別進行擴增，體系如下：GoTaqGreen Master Mix 25 μL，cDNA 8 μL，Up/Low引物各2 μL，補加滅菌純水至50 μL。PCR參數(shù)：95℃3 min；95℃30 s，47℃（VP4）/53℃（VP7）30 s，72℃1 min，35個循環(huán)；72℃10 min。

1.2.6 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Wizard○R SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒回收純化后，與pMD19-T載體16℃連接5 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP 10感受態(tài)細胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 μg mL-1），37℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基過夜震蕩培養(yǎng)。堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)通用引物M13R/F進行PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pMD19-T-RV-VP4及pMD19-T-RVVP7，并進行序列測定。

1.2.7 進化樹分析

利用分子生物學軟件對BRV分離株VP4、VP7部分編碼序列測序結(jié)果進行分析，并參照GenBank已收錄的BRV序列，采用Mega 6.0（鄰近法）構(gòu)建VP4、VP7部分基因系統(tǒng)進化樹，系統(tǒng)發(fā)生統(tǒng)計學方法利用1 000 bootstrap進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR鑒定結(jié)果

提取腹瀉樣品總RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄cDNA，經(jīng)RV鑒定引物擴增到約183 bp的片段，與預期相符（圖1）。

圖1 牛輪狀病毒的RT-PCR鑒定Fig.1Identification of bovine rotavirus with RT-PCR

2.2 VP4、VP7基因的擴增

分離毒株在MA104細胞傳至4代，細胞出現(xiàn)CPE，傳至7代細胞CPE明顯，提取接毒細胞上清的總RNA，以VP4引物擴增到約874 bp的條帶，VP7引物擴增出約901 bp的條帶，與預期相符（圖2）。

圖2 輪狀病毒分離株VP4、VP7基因片段的RT-PCR擴增Fig.2RT-PCR amplification of VP4 and VP7 segments of isolated rotavirus P4 and VP7 fragments

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定

以重組質(zhì)粒為模板，以通用引物M13-R/F進行PCR鑒定，所得片段大小與預期相符。

圖3 pMD19T-VP4和pMD19T-VP7重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3Identification of pMD19T-VP4 and pMD19T-VP7 recombinant plasmids by PCR

2.4 進化樹分析

進化樹分析結(jié)果表明，NX28-VP7與G6型牛輪狀病毒處于同一進化分支（圖4）。NX28-VP7與JF693067（G6型）的核苷酸同源性為97%，與EF554120（G6型）的核苷酸同源性為92.4%，而與其他G基因型（G1、G8或G10）的同源性為75.4%～83.1%。NX28-VP4與P［5］型輪狀病毒處于同一進化分支（圖5）。NX28-VP4與KC815661（P［5］型）的核苷酸同源性為93.8%，與GU565088（P［5］型）的核苷酸同源性為93.4%，與AY050271（P［5］型）的核苷酸同源性為90.1%，而與其它P基因型（P［1］、P［11］或P［6］）的同源性為68.9%～74.5%。

圖5 NX28-VP4基因進化樹分析Fig.5Phylogenic tree of VP4 of NX28

3 結(jié)論與討論

早期的研究結(jié)果認為VP7與病毒的黏附有關(guān)，但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明VP7具有穩(wěn)定VP4結(jié)構(gòu)的作用。在病毒侵入細胞的過程中，VP4起到關(guān)鍵作用。VP4能被胰蛋白酶（Trypsin）裂解為VP5*（60 kDa）和VP8*（26 kDa）。VP5*蛋白含有一個與有囊膜病毒，如流感病毒類似的區(qū)域，它能夠增加細胞膜的通透性，提高病毒侵入細胞的能力，可以極大地提高RV的感染性。研究中，在接種MA104細胞前，使用終濃度為5 μg·mL-1的胰蛋白酶于37℃處理病毒接種物30 min，并在維持液中加入胰蛋白酶（終濃度為0.5 μg·mL-1）以此提高病毒的感染力。國內(nèi)某些實驗室在進行輪狀病毒的分離過程中，使用20 μg·mL-1的胰蛋白酶處理病毒接種物，并在細胞維持液中添加5 μg·mL-1的胰蛋白酶。高濃度的胰蛋白酶將會對RV和細胞造成一定程度的傷害，降低病毒的感染性，易造成病毒丟失。試驗中，病毒接種物在接種MA104細胞后并盲傳幾代，在盲傳至第4代起，細胞開始表現(xiàn)出輕微的CPE現(xiàn)象。當傳代至第7代后，CPE現(xiàn)象逐漸明顯，細胞表現(xiàn)為圓縮、脫落。由于RV存在宿主范圍限制現(xiàn)象，病毒分離需要逐漸適應細胞培養(yǎng)，才能表現(xiàn)出CPE。除了MA104細胞外，Marc145細胞（MA104細胞的克隆株）也可以用于BRV的分離，如蘇小康等［9］通過Marc145細胞從犢牛腹瀉糞便中成功分離到BRV。

全世界范圍內(nèi)，目前BRV至少已經(jīng)鑒定出12個G基因型（G1～G3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21和G24）和11個P基因型（P［1］、P［3］、P［5～7］、P［11］、P［14］、P［17］、P［21］、P［29］和P［33］）［10-11］。在G基因型中，以G6、G8和G10型最為常見，通常與P［1］、P［5］或P［11］型組合，較為常見的G-P基因型組合為G10P［11］、G6P［5］或G6P［1］［12-13］。2007年姜向陽于陜西省分離了G10型BRV［14］；2008年常繼濤等人報道于新疆、內(nèi)蒙古分離了G10P［11］型BRV，并于黑龍江分離到G6型BRV（P基因型未知）［6，15］；2010年謝金鑫等［7，16］于黑龍江省大慶地區(qū)分離了一株G10型BRV（P基因型未知）。在全世界范圍內(nèi)，G6、G8和G10型BRV為主要的流行毒株，而我國流行的BRV為G6和G10型，尚未有G8型BRV的報道。

研究中，所分離的病毒證實為G6P［5］型BRV，雖然此前國內(nèi)曾有G6型BRV的分離報道，但是確切的P基因型尚不清楚。對NX28分離株所擴增的部分VP4基因序列與KC815661（P［5］型）VP4（P［5］型）基因同源性較高，核苷酸同源性大于93%。另外，需要指出的是，Ghosh等［17］報道了從馬體內(nèi)分離到一株輪狀病毒（OH-4），其全基因組序列分析表明，其VP7、VP4、VP3、NSP1、NSP3和NSP5基因均來自于牛輪狀病毒，再一次證實了基因重配在RV進化和種間傳播上的作用，BRV可以作為其他動物輪狀病毒的潛在來源。下一步將對NX28分離株進行全基因組序列測定，分析其與經(jīng)典病毒株及疫苗株的親緣關(guān)系，為BRV分子流行病學和疫苗效力評價奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and Characterization of Bovine Rotavirus with G6P［5］Specificity

Wen Xiaobo，Zhang Lingling，Ni Hongbo，Liu Yangyang，Cao Si，Ran Xuhua
（Provincial Key Laboratory，College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Rotavirus was the infectious agents leading to the viral diarrhea among numerous species of young animals or infants and children worldwide，which created great impact on the animal industry or human health.The diarrhea samples from Ningxia Hui Autonomous Region were tested by RT-PCR，followed by inoculation of positive samples onto MA104 monolayer cells.The CPE was not observed until the fourth blind inoculation was carried on.The typical CPE was showed after seventh passage.An isolate was identified as G6P［5］genotype by amplification of VP4 and VP7 fragment and phylogenic analysis，which was designated as the NX28.It demonstrated that bovine rotavirus with G6P［5］specificity was circulating in cattle herds in China and would contribute to the analysis of molecular epidemiology of bovine rotaviruses.

bovine；rotavirus；genotype；G genotype；P genotype

S8

A

1002-2090（2016）04-0036-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.009

2015-12-10

國家自然科學青年項基金目（31201909）；黑龍江博士后科研啟動資助項目（LBH-Q13134）；黑龍江省自然科學基金（QC2013C028，C2015042）。

聞曉波（1977-），男，副教授，中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所畢業(yè)，現(xiàn)主要從事牛病毒性傳染病的流行病學及致病機理研究。

冉旭華，女，副教授，碩士研究生導師，E-mail：ranxuhua@163.com。