紅芪多糖對HLA-B27相關前葡萄膜炎TNF-α和IL-10的影響

許卓再，于晉懿，毛毳，王　婧，余　爍，盧　弘

紅芪多糖對HLA-B27相關前葡萄膜炎TNF-α和IL-10的影響

許卓再1，于晉懿2，毛毳1，王婧1，余爍1，盧弘1

目的探討紅芪多糖（HPS）對HLA-B27相關前葡萄膜炎患者外周血單個核細胞分泌細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-10（IL-10）的影響。方法選擇10名處于急性炎癥期的HLA-B27相關前葡萄膜炎患者，常規(guī)藥物治療4周，在炎癥緩解期，抽取他們的外周血，經(jīng)過分離和培養(yǎng)得到單個核細胞。將單個核細胞平均分為4組，分別用磷酸鹽緩沖液（PBS）、細菌脂多糖（LPS）、LPS+HPS、HPS處理各組單個核細胞，PBS處理組為對照組，LPS的終末濃度為1 mg·L-1，HPS的終末濃度為200 mg·L-1。在各組單個核細胞接受處理4 h、8 h、12 h、24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測其中TNF-α和IL-10的含量。結(jié)果患者單個核細胞受LPS處理后細胞培養(yǎng)上清液中各時點的TNF-α和IL-10含量均明顯高于PBS處理組（P＜0.05）；HPS+LPS處理組細胞培養(yǎng)上清液中各時點的TNF-α含量以及前2個時點的IL-10含量高于LPS處理組（P＜0.05）；HPS處理組細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10的含量與PBS處理組比較無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論HLA-B27相關前葡萄膜炎炎癥緩解期患者外周血單個核細胞進行的體外實驗中，紅芪多糖促進LPS刺激后的單個核細胞分泌TNF-α和IL-10，提示紅芪多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑參與炎癥反應的過程。

紅芪多糖；HLA-B27相關前葡萄膜炎；外周血單個核細胞；TNF-α；IL-10

前葡萄膜炎是臨床上最常見的葡萄膜炎類型，HLA-B27（人類白細胞抗原B27）相關前葡萄膜炎是前葡萄膜炎中病因最明確的一類，HLA-B27陽性的急性前葡萄膜炎占急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AAU）的18%～32%〔1〕。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是治療葡萄膜炎的常規(guī)藥物，兩者的長期應用均會帶來嚴重的副作用。近年來，尋找作用較強、副作用小的新型中藥制劑成為研究熱點〔2〕。

紅芪是豆科植物多序巖黃芪干燥根，紅芪具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效，是一種應用較為廣泛的傳統(tǒng)中藥。紅芪多糖（radix hedysari polysaccharide，HPS）是紅芪的主要活性成分，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護內(nèi)皮細胞、減輕糖尿病并發(fā)癥等作用〔3〕。

細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素的毒性成分，是目前較常用的免疫炎癥反應誘導劑，本實驗將選用LPS誘導的單個核細胞作為體外實驗中HLA-B27相關前葡萄膜炎的模型。急性前葡萄膜炎的發(fā)病過程中，有大量的炎癥相關細胞和分子參與。單個核細胞來源的巨噬細胞是一種重要的參與炎癥反應細胞，能分泌多種可溶性炎癥細胞因子，這些細胞因子在炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用〔4〕。

在本課題的前期研究中，利用動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)HPS可通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）和它下游的信號轉(zhuǎn)導通路來抑制內(nèi)毒素誘導產(chǎn)生的大鼠急性前葡萄膜炎〔5〕。本次實驗，我們通過監(jiān)測體外單個核細胞的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的含量，研究HPS對LPS誘導的HLA-B27相關急性前葡萄膜炎緩解期離體單個核細胞炎癥反應的作用，以進一步明確HPS參與炎癥反應的機制。

1　材料和方法

1.1實驗材料

HPS（蘭州大學藥學院）。LPS（18001株，古典生物型，小川血清型），蘭州生物制品研究所。磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Thermo Scientific公司），外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Thermo Scientific公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），谷氨酰胺（美國Hyclone公司），青霉素、鏈霉素（中國華北制藥集團有限責任公司），TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）。SCB-1520型超凈臺（中國哈東聯(lián)公司），MicroCL17R型微量冷凍高速離心機（美國Thermo公司），F(xiàn)orma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Venticell系列精密強制對流干燥箱（德國MMM公司），TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2臨床資料

參照國際葡萄膜炎研究組（International Uveitis Study Group）制定的診斷標準和分類〔6〕，2013年1月到2013年7月期間，選擇符合條件的HLA-B27相關前葡萄膜炎患者10例為研究對象，6名男性，4名女性，年齡18～45歲，平均年齡28歲。10位研究對象均為HLA-B27陽性的強直性脊柱炎患者，且沒有其他全身免疫性疾病。10位患者急性前葡萄膜炎經(jīng)過常規(guī)治療4周處于緩解期，所有參與試驗的實驗對象均簽署知情同意書，且本次臨床研究已獲得首都醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.3實驗方法

1.3.1外周血單個核細胞的分離與培養(yǎng)：靜脈穿刺抽取每位HLA-B27相關急性前葡萄膜炎緩解期患者靜脈血32 ml，并在室溫下用等量的PBS稀釋。采取Ficoll密度梯度法分離單個核細胞：（1）按2：1的比例，將稀釋后的靜脈血沿管壁緩慢注入淋巴細胞分離液中；（2）以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min；（3）小心吸取包含單個核細胞的云霧層，并用PBS洗滌（1 500 r/min×5 min）2次；（4）將清洗后的細胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中（含體積分數(shù)10%滅活胎牛血清、2mmol·L-1谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素各100000 U·L-1），臺盼藍拒染實驗示活細胞＞95%，調(diào)整細胞密度為1×109·L-1，然后將細胞懸浮液接種于12孔培養(yǎng)板中。37℃，5%CO2，95%相對濕度的條件下培養(yǎng)4 h使單個核細胞貼壁。然后用PBS充分洗滌12孔板除去未貼壁的細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁的細胞。

1.3.2分組和處理：將分離得到單個核細胞平均分為4組。（1）對照組：培養(yǎng)孔板中加入PBS；（2）LPS單獨處理組：培養(yǎng)孔板中加入LPS，終末濃度為1 mg·L-1；（3）LPS+HPS聯(lián)合處理組：加入LPS前30 min時向培養(yǎng)孔板中加入HPS，終末濃度為200 mg·L-1，LPS終末濃度為1 mg·L-1；（4）HPS單獨處理組：向培養(yǎng)孔板中加入HPS，終末濃度為200 mg·L-1。分別于加入LPS后4 h、8 h、12 h、24 h時，收集各組細胞培養(yǎng)上清液并在-80℃的條件下儲存。

1.3.3檢測TNF-α和IL-10：用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法測定收集的細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10的含量：（1）每孔中加入50 μl試劑盒內(nèi)稀釋液；（2）加入200 μl的標準品、樣本，錫紙遮蓋室溫孵育2 h；（3）每孔用洗滌緩沖液400 μl完全洗滌4次，最后1次洗滌后，將殘留液體倒置晾干；（4）在每孔中加入200 μl的TNF-α/IL-10共軛試劑，室溫孵育1 h。重復步驟（3）；（5）加入200 μl底物溶液，室溫下避光孵育20 min；（6）各孔加入50 μl終止液，用酶標儀在450nm處測定各孔的光密度。

1.4統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析比較單個核細胞不同處理組間TNF-α和IL-10的含量差異，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量。LPS刺激后單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10各時點的含量均較對照組明顯上升（P＜0.05），并分別在24 h和8 h時達到最大（TNF-α，221.57 ng·L-1；IL-10，22.41 ng·L-1）。HPS+LPS處理組各時點的TNF-α含量始終高于LPS處理組（P＜0.05），最大值出現(xiàn)在12 h時（586.61 ng·L-1）；IL-10含量的最大值出現(xiàn)在8 h（27.13 ng·L-1），其中4 h、8 h的數(shù)值高于LPS處理組（P＜0.05），12 h及24 h的數(shù)值與LPS處理組結(jié)果接近（P＞0.05）。HPS處理組與PBS對照組單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量在所有時間點均無統(tǒng)計學意義的差異（P＞0.05）（表1、表2，圖1）。

表1　各組不同時間單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量比較（，ng·L-1）

表1　各組不同時間單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量比較（，ng·L-1）

注：相同時間組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，①與對照組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05；③與對照組組比較，P＞0.05TNF-α：腫瘤壞死因子αLPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

組別樣本量4 h 8 h 1 2 h 2 4 h對照組1 0 6 . 3 3 ± 2 . 3 0 9 . 3 5 ± 1 . 5 7 1 0 . 2 9 ± 1 . 8 2 1 3 . 9 6 ± 2 . 6 9 L P S組1 0 4 9 . 0 5 ± 1 5 . 0 5①1 0 8 . 3 9 ± 3 0 . 0 3①1 9 1 . 9 9 ± 4 2 . 7 6①2 2 1 . 5 7 ± 3 7 . 1 2①L P S + H P S組1 0 3 5 2 . 3 5 ± 1 7 . 0 6②4 4 4 . 5 7 ± 1 6 . 6 7②5 8 6 . 6 1 ± 2 0 . 9 9②5 5 2 . 2 7 ± 2 3 . 8 6②H P S組1 0 6 . 6 8 ± 2 . 6 0③1 0 . 6 5 ± 1 . 7 1③1 1 . 5 1 ± 1 . 9 9③1 6 . 2 2 ± 3 . 3 3③F值2 1 0 7 . 5 2 1 4 3 4 . 9 8 1 2 9 4 . 7 0 1 3 0 8 . 9 9 P值＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1

表2　各組不同時間單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量比較（，ng·L-1）

表2　各組不同時間單個核細胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量比較（，ng·L-1）

注：相同時間組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，①與對照組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05；③與LPS組比較，P＞0.05；④與對照組組比較，P＞0.05IL-10：白細胞介素-10LPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

組別樣本量4 h 8 h 1 2 h 2 4 h對照組1 0 6 . 7 3 ± 0 . 8 3 1 3 . 5 9 ± 0 . 8 1 1 2 . 0 6 ± 0 . 8 3 1 0 . 2 6 ± 0 . 7 4 L P S組1 0 8 . 5 3 ± 1 . 1 4①2 2 . 4 1 ± 2 . 5 8①1 7 . 6 2 ± 1 . 4 5①1 1 . 7 0 ± 1 . 1 0 L P S + H P S組1 0 9 . 5 3 ± 0 . 8 3②2 7 . 1 3 ± 2 . 7 7②1 7 . 7 2 ± 1 . 7 1③1 1 . 0 0 ± 1 . 6 8 H P S組1 0 7 . 0 1 ± 1 . 0 9④1 4 . 4 2 ± 1 . 2 0④1 2 . 1 0 ± 0 . 8 1④1 0 . 0 3 ± 1 . 2 6 F值1 7 . 9 3 1 0 3 . 2 6 6 5 . 3 0 3 . 7 0 P值＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1 0 . 2 0 0

3　討論

HLA-B27相關急性前葡萄膜炎是一種急性起病、可反復發(fā)病的難治性致盲眼病〔7〕。糖皮質(zhì)激素是治療葡萄膜炎的一線用藥，長期大劑量應用會導致嚴重的系統(tǒng)性和眼部并發(fā)癥。具有免疫調(diào)節(jié)劑作用的中藥制劑，可以考慮用來治療葡萄膜炎。HPS是一種傳統(tǒng)中藥的提取物，能加強紅細胞的固有免疫和T淋巴細胞的免疫功能〔8〕。

圖1　ELISA法檢測各組單個核細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10含量的變化情況（）。1A.1B.顯示LPS組與對照組的比較結(jié)果，1C.1D.顯示所有四個組的比較結(jié)果。LPS刺激后單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量明顯上升，TNF-α含量在24 h內(nèi)持續(xù)上升；IL-10含量先升后降，8 h達到最大值，24 h接近初始含量。HPS預處理后的單個核細胞受LPS刺激后細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量也呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢，在12 h達到最大值；IL-10的含量也呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在8 h達到最大值ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗TNF-α：腫瘤壞死因子αIL-10：白細胞介素-10 LPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

IL-10是由Th細胞、巨噬細胞、單核細胞和B細胞產(chǎn)生的一種具有免疫抑制活性的內(nèi)源性細胞因子，通過下調(diào)TLR4的表達來減輕炎癥反應〔9〕。有研究表明IL-10家族基因中部分與非感染性葡萄膜炎相關〔10〕。TNF-α是由單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞分泌的促炎細胞因子，是一種參與葡萄膜炎的發(fā)病機制的細胞因子〔11〕。葡萄膜炎患者血清中的TNF-α和TNF-α受體含量升高〔12〕，升高的TNF-α可能與葡萄膜炎的復發(fā)性有關〔13〕。

本實驗對HLA-B27相關急性前葡萄膜炎緩解期患者的離體單個核細胞，采用不同的處理方式，來測定單個核細胞分泌的TNF-α和IL-10的水平，研究HPS的免疫功能。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激單個核細胞分泌的TNF-α和IL-10明顯高于對照組，模擬了HLA-B27相關急性前葡萄膜炎的炎癥反應過程。

經(jīng)HPS預處理的單個核細胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-10的水平高于未經(jīng)紅芪多糖預處理組，HPS預處理促進了單個核細胞分泌TNF-α和IL-10。而單獨用HPS處理的單個核細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量并不升高，與對照組比較無統(tǒng)計學意義的差異。提示，單獨用HPS處理單個核細胞，并不引起炎性改變；HPS只在LPS誘發(fā)單個核細胞的炎癥條件下，促進TNF-α和IL-10的分泌，參與炎癥調(diào)控反應。

體外細胞試驗，可以清晰地考察某種成分對于某種細胞因子的影響，但是離體環(huán)境有別于機體正常的內(nèi)環(huán)境，脫離了綜合的細胞因子網(wǎng)絡及神經(jīng)體液的調(diào)控作用，也缺失了體內(nèi)各種組織細胞之間相互的生物學關系。因此所獲得的研究結(jié)果，不能簡單地進行體內(nèi)的推論，我們也將通過后續(xù)的整體實驗做進一步研究。

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Role of radix hedysari polysaccharide on TNF-α and IL-10 in HLA-B27 associated acute anterior uveitis

XU Zhuozai，YU Jingyi，MAO Cui，et al.
Department of Ophthalmology，Beijing Chao-Yang Hospital，Capital Medical University，Beijing 100020，China

OBJECTIVE To observe the effect of radix hedysari polysaccharide（HPS）on the production of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and interleukin-10（IL-10）by peripheral blood mononuclear cells from patients with HLA-B27 associate acute anterior uveitis（AAU）.METHODS Mononuclear cells samples were isolated from 10 patients with HLA-B27 associate AAU during recovery course in its acute period of onset after 4 weeks medical treatment.Mononuclear cells isolated and cultured from the patients were divided into 4 groups，and were treated by phosphate buffered saline（PBS，as control group），lipopolysaccharide（LPS），HPS+LPS and HPS respectively.The final concentration of LPS is 1 mg·L-1.HPS was added 30 minutes before the adding of LPS in final concentration of 200 mg·L-1.Samples of culture supernatants were harvested at different times（4 h，8 h，12 h and 24 h）after stimulation.Concentration of TNF-α and IL-10 in cell culture supernatant samples were measured with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.RESULTS After stimulated by LPS，the concentrations of TNF-α and IL-10 in culture supernatants of the patients are significantly higher than control group（P＜0.05）.The production of TNF-α and IL-10 of the LPS+HPS treatment group was higher than the LPS treatment group（P＜0.05）.The production of TNF-α and IL-10 of the HPS treatment group shown no difference comparing with the control group. CONCLUSIONS In the in-vitro test of isolated peripheral blood mononuclear cells from the patients with HLA-B27 associate AAU after recovering，HPS promote the secretion of IL-10 and TNF-α produced by mononuclear cells stimulated with LPS.Test indicatedsthat HPS as immune modulators involveds in the process of inflammatory reaction.

radix hedysari polysaccharide（HPS）；HLA-B27 associate acute anterior uveitis（AAU）；peripheral blood mononuclear cells；tumor necrosis factor alpha（TNF-α）；interleukin-10（IL-10）

R773

A

1002-4379（2016）03-0154-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.004

國家自然科學基金面上項目（81471575；81273246）

1首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院眼科，北京100020 2青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院眼科，煙臺264000

盧弘，E-mail：honglucmu@outlook.com