細胞分裂素合成關鍵基因ipt應用研究進展

皮照興+廉玉利+李依娜+孟德勇

【摘 要】本文介紹了細胞分裂素的種類和生物合成過程，闡述了異戊烯基轉移酶是細胞分裂素生物合成過程中的重要限速酶，其編碼基因ipt已被克隆并在植物基因工程得到廣泛應用。重點綜述了轉化ipt基因可增加植物內源細胞分裂素的含量，在延緩葉片衰老、提高作物產量、誘導單性結實、抗旱、抗病蟲害、抗寒等方面起到了顯著作用，并分析了ipt基因在植物基因工程中應用研究方向。

【關鍵詞】細胞分裂素 異戊烯基轉移酶 基因工程

【Abstract】In this paper， the species and biosynthetic process of cytokinins are introduced. Isopentenyl-transferases catalyze the rate-limiting step of cytokinin biosynthesis， and its coding genes have been cloned and used widely in plant genetic engineering .The overview of the ipt gene transformation can be increased endogenous cytokinin content which has significant effect in retard leaf senescence， increase crop yield， induced parthenocarpy， drought resistance， disease resistance and insect resistance， cold resistance and other aspects.At the same time， the paper analyzed the application and research direction of the ipt gene in plant gene engineering.

【Key words】Cytokinin； Isopentenyl-transferase gene （ipt）； genetic engineering

細胞分裂素是植物生長發(fā)育過程中五大類植物生長調節(jié)劑之一，在促進細胞分裂和擴大、誘導器官分化、延緩葉片衰老進程以及在種子萌發(fā)和逆境應答等重要生理生化反應方面均發(fā)揮著重要的作用。異戊烯基轉移酶是催化細胞分裂素生物合成的關鍵酶，也是最重要的限速酶。本文就細胞分裂素的合成、異戊烯基轉移酶基因（簡稱ipt基因）以及其在植物基因工程上應用進行了綜述，旨在為探索細胞分裂素生理作用機理及異戊烯基轉移酶基因在植物基因工程上應用奠定理論基礎，同時也為通過調整植物激素進行作物遺傳育種展示了廣闊的應用前景。

1 細胞分裂素的生物合成與 ipt基因

細胞分裂素在植物種子萌發(fā)、去黃化現象、葉綠體分化、頂端優(yōu)勢、植物抗逆反應、花和果實的發(fā)育和葉片衰老等生長發(fā)育都具有十分重要作用。Lethan在1963年報道的從未成熟玉米種子中分離出的反式玉米素是發(fā)現最早并純化的細胞分裂素（t-Zeatin）[1]。細胞分裂素主要包括嘌呤型和苯基脲型兩種類型，至今尚未在植物體內發(fā)現天然存在的苯基脲型細胞分裂素或有活性代謝物。

1.1 細胞分裂素的生物合成

細胞分裂素的生物合成包括tRNA合成途徑與從頭合成途徑。其中tRNA合成途徑是以tRNA分解釋放出來的順式玉米素為底物，在順反異構酶的催化下合成高活性的反式玉米素[2，3]，該途徑是細胞分裂素合成的次要途徑。從頭合成途徑是細胞分裂素生物合成的主要途徑，包括ATP/ADP途徑、AMP途徑和旁路途徑如圖1所示。

1.2 ipt基因

Taya等[4]和Akiyoshi等[5]分別從黏菌（Dictyostelium discoideum）和致癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）中鑒定出一種酶，該酶可催化AMP和IPP合成有活性的細胞分裂素iPMP，該酶稱之為IPT酶，它是細胞分裂素從頭生物合成限速酶，編碼該酶的基因稱為ipt基因。隨后在其它細菌和植物中也發(fā)現有ipt基因，2001年，Takei等[6]和 Kakimoto等[7]從擬南芥中鑒定出9個ipt同系物，命名為AtIPT1～AtIPT9。經系統(tǒng)發(fā)育分析表明AtIPT2和AtIPT9編碼準tRNA-異戊烯基轉移酶（tRNA合成途徑），而其它的7個基因在大腸桿菌中的表達可導致異戊烯基腺嘌呤和玉米素的分泌，表明這7個基因在擬南芥中是編碼細胞分裂素生物合成的基因且具有組織特異性。Sakamoto等在水稻中鑒定出8個ipt基因（OsIPT1～OsIPT8）編碼異戊二烯基轉移酶并參與到細胞分裂素生物合成的過程中[8]。

從圖1可以看出，細菌中純化到的IPT酶利用AMP為底物合成玉米素，而擬南芥中純化得到的AtIPT酶優(yōu)先利用ATP和ADP作為底物，推測該酶可能先合成iPTP和iPDP，再經羥基化合成嘌呤型的細胞分裂素[9]。近年來研究表明，在擬南芥中存在一個不依賴于iPTP/iPDP、iPMP的細胞分裂素合成途徑，該途徑可能是由ATP、ADP、AMP和萜類化合物前體（HMBDP）直接完成的[10]，在農桿菌、大腸桿菌和黃木樨根瘤菌也分離鑒定出了間接途徑合成異戊烯基轉移酶基因——miaA基因[11]。

2 IPT基因在植物基因工程上的應用

已有研究表明通過轉化ipt基因可增加植物內源的細胞分裂素含量，可以延緩植物葉片的衰老，增強植物對非生物逆境的抗性，使植株保持高水平的光合作用，以提升農作物的產量、改善品質。

2.1 延緩葉片衰老

植物葉片衰老的遺傳機制是通過細胞核基因表達調控和環(huán)境因子影響來啟動衰老程序發(fā)揮作用的，它已成為一個重要指標來增加作物遺傳改良的潛力。Huang[12]等認為植物葉片在衰老過程中，內源激素含量可能最先發(fā)生變化，由此導致葉綠體和蛋白質降解，光合速率下降。在20世紀30年代末就有科學家發(fā)現細胞分裂素延緩葉片衰老的效應，其主要通過轉錄因子調控途徑、信號轉導途徑和代謝途徑等提高細胞抗氧化酶的活性、減少膜脂類的過氧化作用、促進活性氧的清除、增加光合作用、降低對乙烯和脫落酸的敏感性延緩植物葉片的衰老[13，14]。王哲[15]用PSAG12-ipt融合基因轉化煙草，全株青葉片數明顯增多，植株下部葉片衰老得到明顯延緩。李秋慶[16]用PSAG12-IPT基因轉化辣椒，實驗結果表明陽性植物出現葉片衰老延緩及植株生命周期延長等現象，花的衰老也有所延緩。

2.2 提高作物產量

細胞分裂素對植物的生理功能和作用是多方面的，具有誘導營養(yǎng)物質向其含量高的部位運輸的能力，是提高灌漿效率的重要調控因子。在生產實踐中，施用外源細胞分裂素可有效增加籽粒的重量，提高座果率以及增大果實等[17]。ipt基因在水稻醇溶蛋白種子特異性表達啟動子驅動下的表達使得煙草種子的iPA含量提高了4.73 倍，種子的重量增加了12.8%[18]。毛自朝等[19]將果實專一性啟動子2A12驅動ipt基因在番茄中的表達，發(fā)現果實中的細胞分裂素增高，番茄的坐果率、產量以及果實中的干物質和粗蛋白均有不同程度的提高，且果實采摘后貯藏保鮮時間延長了1-2周。很多科學工作者已把這項技術應用于轉化水果、農作物、花卉和蔬菜等研究之中，這為提高農作物、果蔬的產量與品質提供了新的途徑。

2.3 誘導單性結實

外源細胞分裂素能夠促進黃瓜、西瓜、梨和蘋果的未授粉果實的發(fā)育，從而產生無籽果實。在番茄中利用果實特異性啟動子大量表達ipt基因能得到穩(wěn)定的單性結實株系[20]，這為細胞分裂素調控植物的單性結實提供了直接證據。毛自朝等[19]將果實專一性啟動子2A12驅動ipt基因在番茄中的表達，也得到了無籽番茄。黃瓜ipt基因CsIPT2在授粉后的黃瓜果實發(fā)育中表達量上調，且在黃瓜天然單性結實前期和人工誘導的單性結實后期表達量均有增加，推測其在黃瓜單性結實果實發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[21]。

2.4 參與抗逆反應

編碼異戊烯基轉移酶基因在作物中表達，誘導植物體內產生活體酶和逆境脅迫蛋白等生理變化，促進光合作用，產生次生代謝物質，使細胞對環(huán)境脅迫因子、機械損傷或昆蟲咬傷等作出響應。

2.4.1 抗旱

在干旱條件下，細胞分裂素可誘導過氧化氫體生成過氧化氫酶，葉綠素含量增加，促進了光呼吸作用，提高了植物的抗旱能力，同時抑制了脫落酸的作用，延緩了葉片的衰老。張雷等[22]研究轉ipt基因四季海棠中發(fā)現，陽性植株細胞分裂素濃度增加，植株變矮，節(jié)間變短，葉片面積、氣孔密度和直徑均有不同程度的減小，主根發(fā)達且長度增加，在滲透脅迫條件下，植株體內脯氨酸含量和SOD活性較野生植株都明顯增加，抗旱能力增強。玉山江·麥麥提[23]研究也表明，在干旱脅迫條件下ipt轉基因水稻的細胞分裂素和葉綠素含量顯著升高、葉面溫度稍低、葉片衰老延緩、抗旱性增加、作物產量增加。

2.4.2 抗病蟲害

細胞分裂素在調控植物的超越補償反應調控系統(tǒng)中起著重要作用，遭受昆蟲取食的葉片，細胞分裂素含量增加，有效地促進氣孔開放，降低氣孔的擴散阻力而提高光合作用，促進傷口愈合；同時導致植株體內的次生代謝過程發(fā)生了變化，產生抗蟲效應的毒害或趨避作用的化合物，從而產生抗蟲效應。李海林等[24]研究表明轉CaMV35S-ipt基因的甘藍型油菜自交品種S65表現高抗蚜蟲，T1-3較野生型對蚜蟲的抑制率均為100%，而野生型植株表現高感蚜蟲，極易受到蚜蟲侵害。Smigocki等[25]將蛋白酶抑制劑II基因啟動子-ipt融合基因轉化煙草，發(fā)現轉基因植株能明顯抑制桃蚜的生長發(fā)育。這種方法與導入抗蟲基因相比更接近于植物的天然防御能力，這將為植物基因工程技術研制抗蟲新品種提供新的的基因和思路。

2.4.3 抗寒

外源ipt基因的表達，細胞分裂素含量增加，葉片葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及根系活力均增加，POD、SOD活性降低速率減慢，有利于植物抵抗低溫環(huán)境。張曉等[26]利用基因槍法將Leafy-ipt基因導入高羊茅草，轉基因株系植株的抗寒性明顯提高。王婷婷[27]研究表明轉ipt基因的草地早熟禾耐冷性顯著提高，隨著氣溫的降低，細胞膜受損傷程度低，出現凍害表型的時間晚，持綠期較長，具有很好的應用前景。李書欽[28]將ipt-bar雙元基因轉入水稻，也得到了強抗冷性植株，且千粒重和有效穗均有所增加。

2.5 其他作用

ipt基因轉化植物提高細胞分裂素的含量，除了具有延緩植物葉片衰老、誘導單性結實、提高農作物的產量與品質、參與抗逆反應外，還能提高轉化率和誘導率[29]、產生雄性不育后代、增強作物耐澇的能力[30]，還能作為選擇標記基因篩選轉化子[31]。但過量表達ipt基因將導致花不同程度的敗育和種子的萌發(fā)率降低[32]。

3 展望

分子生物學和基因工程技術的發(fā)展及應用大力推動了細胞分裂素和異戊烯基轉移酶基因在植物基因工程的研究與應用，但解析植物中細胞分裂素的合成代謝與器官發(fā)生發(fā)育過程的關系還需進一步探討，尤其是細胞分裂素表達量以及細胞分裂素與其他激素的相互作用對植物生理代謝的調控以及器官發(fā)生發(fā)育過程的作用關系還需進一步研究。我們期待今后利用特異啟動子與異戊烯基轉移酶基因融合培育出更多品質優(yōu)良的作物新品種。

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