轉(zhuǎn)Mz₂NHX₁基因擬南芥對鹽脅迫的生理響應

王璐平+張永利+孫婷梅+于夢楠+秦家慧+李愛+彭立新

摘 要：為了探討珠美海棠Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因Mz2NHX1在植物耐鹽中的作用，以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥為材料，研究不同鹽濃度對轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥種子萌發(fā)、植株耐鹽性相關(guān)生理指標的影響。結(jié)果表明：在不同鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽率明顯高于野生型。隨著鹽濃度的增加，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的電導率呈上升趨勢；SOD活性呈先上升后下降趨勢；POD活性、可溶性糖含量、脯氨酸含量在野生型植株中呈先上升后下降趨勢，在轉(zhuǎn)基因植株中呈不斷升高的趨勢。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的各項生理指標均優(yōu)于野生型，表明Mz2NHX1基因的過量表達，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

關(guān)鍵詞：Mz2NHX1基因；擬南芥；鹽脅迫；生理響應

中圖分類號：Q945 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.001

Abstract： To study the role of Na+/H+ antiporter gene Mz2NHX1 of Malus zumi in plant salt resistance， wild type Arabidopsis thaliana and transgenic Mz2NHX1 Arabidopsis thaliana were used to study the effects of different salt concentrations on seed germination of transgenic and wild type Arabidopsis thaliana and the physiological characteristics of plant salt resistance. The results showed that the seed germination rate of transgenic Arabidopsis thaliana was significantly higher than that of wild type under different salt stress. With the increase of salt concentration， the conductivity of wild-type and transgenic plants showed an increasing trend； SOD activity increased first and then decreased； POD activity， soluble sugar content and proline content increased first and then decreased in wild-type plants ， while they were in increasing trend in transgenic plants. The physiological characteristics of transgenic plants were better than that of wild type under salt stress， which indicated that over-expression of Mz2NHX1 gene enhanced the salt tolerance of transgenic Arabidopsis thaliana.

Key words： Mz2NHX1； Arabidopsis thaliana； salt stress； physiological response

土地鹽漬化是一個世界性的環(huán)境問題，隨著城市化的發(fā)展，可耕種土地在減少，設(shè)施農(nóng)業(yè)的推廣，使土壤鹽漬化加重，嚴重地影響了農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量[1]。研究植物對鹽脅迫的生理響應，對于分析植物耐鹽機理，培育新的耐鹽植物具有重要意義。

大多數(shù)雙子葉植物對鹽堿環(huán)境的適應通常有三種方式，即Na+的外排、Na+在細胞內(nèi)的區(qū)隔化及拒絕對Na+的吸收，而前兩種方式是由細胞內(nèi)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白完成的。在植物細胞內(nèi)有兩類Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因，一類位于液泡膜，編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，另一類位于質(zhì)膜，編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白[2]。

2009年，孟曉燁[3]克隆得到了珠美海棠Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的cDNA全序列，并將該基因命名為Mz2NHX1，序列分析初步表明其屬于液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因，證明了Mz2NHX1基因與珠美海棠的耐鹽性有關(guān)。

擬南芥是研究有花植物遺傳、發(fā)育、分子生物學的模式植物。將外源基因在擬南芥中過表達，是分析基因功能的手段之一。為了進一步分析Mz2NHX1基因的功能，張永利等[4]首次構(gòu)建了珠美海棠的表達載體pRI201-AN-GUS-Mz2NHX1，并利用農(nóng)桿菌介導法，將Mz2NHX1基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中，得到了轉(zhuǎn)基因植株。

本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，對野生型和轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥進行鹽脅迫處理，觀察其表型變化，并測定其耐鹽相關(guān)生理生化指標，旨在進一步分析Mz2NHX1基因的功能，為培育耐鹽果樹砧木提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）種子由天津農(nóng)學院林學實驗饋贈；轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥種子由天津農(nóng)學院果樹重點實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1 點種與發(fā)芽培養(yǎng) 滅菌前分別將NaCl添加至配制好的MS培養(yǎng)基中，使NaCl終濃度分別為0 （CK）， 50， 100， 150， 200， 250 mmol·L-1 ，高壓蒸汽滅菌（ 121 ℃，20 min） 后分裝到培養(yǎng)皿中。將擬南芥種子用1 mL的5%次氯酸鈉溶液與1 μL TritonX-100混合，消毒10 min，期間不斷振蕩，5 000 r·min-1，離心1 min，吸除上清液，用超純水清洗4次。于超凈工作臺上將種子均勻地點種在每個培養(yǎng)皿中，每皿點種野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子各30粒，重復3皿，封口。4 ℃春化3 d后，將點好種的培養(yǎng)皿置于人工氣候室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：16 h·d-1光照、8 h·d-1 黑暗，空氣相對濕度保持在60%～70%、溫度控制在22 ℃、光照為3 000 lx。記錄并計算擬南芥種子在不同鹽濃度培養(yǎng)基中的發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽率。endprint

發(fā)芽率（GP）=發(fā)芽終期（萌發(fā)第15天）正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子數(shù)×100%[5]

1.2.2 土壤培養(yǎng) 培養(yǎng)土按大漢土、蛭石2∶1混合，加超純水攪拌均勻，在0.1 MPa，121 ℃條件下滅菌30 min。選擇口徑為7 cm的塑料花盆，裝入等量培養(yǎng)土，將4 ℃春化3 d的野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別點播到培養(yǎng)土中，每盆3～5粒。3周后，選擇生長發(fā)育程度基本一致的植株分別用濃度為 0 （CK），100，150，200，250，300 mmol·L-1的NaCl溶液澆灌擬南芥幼苗，每盆澆100 mL NaCl溶液，共6個處理，每個處理5盆，重復3次。7 d后取各處理下生長的擬南芥葉片放入-20 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3 生理指標測定 采用浸泡法測定相對電導率[6]；蒽酮法測定可溶性糖含量；氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（POD）的活性；酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[7]。

利用SPSS統(tǒng)計軟件（17.0版），平均值比較以LSD0. 05為標準，對獲得的試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥種子發(fā)芽率的影響

野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度培養(yǎng)基上的發(fā)芽率見圖1。從圖1可以看出，在低鹽濃度下，兩種類型擬南芥發(fā)芽率與對照差異均不顯著。當鹽濃度為100 mmol·L-1時，野生型擬南芥種子發(fā)芽率為63.82%，轉(zhuǎn)基因種子發(fā)芽率為100%。鹽濃度為150 mmol·L-1時，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽率為87.7%，而野生型僅9.6%。鹽濃度達到250～300 mmol·L-1時，野生型擬南芥種子不再萌發(fā)，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子發(fā)芽率較對照也顯著下降。結(jié)果表明，在一定的鹽濃度下，Mz2NHX1基因的轉(zhuǎn)入提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的發(fā)芽率。

2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥電導率的變化

細胞膜透性的大小可以用相對電導率來表示，它可以反映植物細胞膜在逆境條件下的透性變化和細胞膜受損傷的程度[8]。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度處理下電導率變化見圖2。從圖2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，二者葉片的電導率均呈現(xiàn)升高趨勢，與對照差異顯著。在所有鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因植株的電導率均低于野生型，反映了野生型擬南芥電解質(zhì)外滲大于轉(zhuǎn)基因擬南芥，質(zhì)膜受損較重。表明轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性在一定程度上優(yōu)于野生型。

2.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥可溶性糖含量的變化

可溶性糖是逆境脅迫誘導產(chǎn)生量增加的小分子溶質(zhì)之一。在鹽脅迫下，可溶性糖含量發(fā)生一定變化，使植物能夠保持正常生長[9]。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度處理下可溶性糖含量變化見圖3。如圖3所示，二者在100～150 mmol·L-1鹽濃度下，可溶性糖含量均與對照差異不顯著；在200～300 mmol·L-1鹽濃度下，可溶性糖含量較對照顯著升高。在不同鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的可溶性糖含量均高于野生型，表明其滲透調(diào)節(jié)能力提高，轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性高于野生型。

2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥脯氨酸含量的變化

植物在逆境下一般會積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持滲透平衡。脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它的積累可以穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)，降低氧化損傷[10]。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度處理下脯氨酸含量變化見圖4。從圖4可以看出，在100～250 mmol·L-1鹽濃度下，野生型擬南芥脯氨酸含量高于轉(zhuǎn)基因植株。在300 mmol·L-1鹽濃度下，野生型擬南芥脯氨酸含量稍有下降，而轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量隨著鹽濃度增加而升高，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透調(diào)節(jié)能力有所提高，其耐鹽性高于野生型。

2.5 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥SOD活性的變化

SOD的作用是清除O2- 等活性氧，減輕其對膜的過氧化損傷。在鹽脅迫下SOD活性增強，有助于清除過多的活性氧，保證植物正常的生理代謝活動[11]。野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度處理下SOD活性變化見圖5。如圖5所示，鹽濃度為100 mmol·L-1時，二者的SOD活性均達到最大值，轉(zhuǎn)基因擬南芥SOD活性顯著高于其他處理濃度。當鹽濃度為150～300 mmol·L-1時，SOD活性均顯著低于對照。不同鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因擬南芥SOD活性均高于野生型擬南芥，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥抗氧化能力更強些。

2.6 鹽脅迫下轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥POD活性的變化

野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同鹽濃度處理下POD活性變化見圖6。如圖6所示，低鹽脅迫對二者POD活性影響不大，與對照間均沒有顯著差異。當鹽濃度為200～300 mmol·L-1時，POD活性較對照均顯著增強。鹽脅迫為300 mmol·L-1時，野生型擬南芥POD活性下降，而轉(zhuǎn)基因擬南芥POD活性顯著上升，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥在一定程度上可以減輕活性氧對細胞膜的傷害，從而保護植物體不受傷害。

3 討 論

過量表達液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)μ岣咧参锏哪望}性起著非常重要的作用。植物通過液泡膜 Na+/ H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白實現(xiàn)Na+的區(qū)隔化入液泡， 維持了胞質(zhì)內(nèi)較低的Na+水平， 既減少其對細胞器的毒害，又降低了細胞的滲透勢， 實現(xiàn)植物在鹽脅迫環(huán)境下正常生長[12]。

鹽脅迫會破壞種子內(nèi)細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，致使代謝紊亂，活力下降甚至不能萌發(fā)[13]。游朝等獲得轉(zhuǎn)MvNHX1基因的棉花，通過種子發(fā)芽率試驗證實轉(zhuǎn)MvNHX1基因棉花種子的發(fā)芽率較對照顯著提高，顯示出較強的耐鹽性[14]。本研究中，轉(zhuǎn)基因Mz2NHX1擬南芥種子發(fā)芽率在不同鹽濃度下均明顯高于野生型，可能是由于轉(zhuǎn)入Mz2NHX1基因增加了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白含量，將Na+區(qū)隔化入液泡中，降低了細胞質(zhì)內(nèi)Na+含量[15]。endprint

在鹽脅迫條件下，細胞質(zhì)膜首先受到鹽離子脅迫影響而產(chǎn)生脅變，導致質(zhì)膜受傷。質(zhì)膜脅變最明顯的表現(xiàn)是質(zhì)膜透性增加。電導率的大小能直接反映質(zhì)膜受傷害的程度，即數(shù)值越大，質(zhì)膜受到的傷害也越大[16]。本研究中，隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥的電導率均升高，但在不同鹽濃度下轉(zhuǎn)基因擬南芥的電導率均低于野生型，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥質(zhì)膜受傷害的程度較小。

逆境脅迫下，植物細胞通過積累在滲透上有活性而對細胞無毒的有機物來進行滲透調(diào)節(jié)[17]?？扇苄蕴亲鳛橹参矬w內(nèi)積累的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對維持細胞的滲透平衡有重要作用。本研究中，隨著鹽濃度的增加，野生型擬南芥可溶性糖含量先升高，在鹽濃度達到300 mmol·L-1后，由于鹽脅迫超過其耐受極限，導致細胞受損嚴重，可溶性糖含量降低；轉(zhuǎn)基因擬南芥可溶性糖含量一直呈上升趨勢，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥滲透調(diào)節(jié)能力增強，從而提高了植株的耐鹽能力。

脯氨酸是衡量植物抗逆性強弱的一個重要指標，但對于脯氨酸在鹽脅迫中的作用，還一直存在爭議。有研究者認為脯氨酸的積累是由于滲透脅迫引起的損傷，是逆境脅迫下造成傷害的病理結(jié)果[18-19]。但更多的研究結(jié)果表明脯氨酸的積累量與植物耐滲透脅迫的程度呈正相關(guān)，脯氨酸的積累是植物為了對抗鹽脅迫而采取的一種保護性措施，可以平衡液泡中的高濃度鹽分 ，避免細胞質(zhì)脫水，保持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[20-21]。本研究中，100～250 mmol·L-1的鹽濃度下，野生型擬南芥脯氨酸含量均高于轉(zhuǎn)基因植株，在鹽濃度達到300 mmol·L-1時，轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量顯著上升，含量高于野生型。分析原因，可能是由于野生型擬南芥對鹽脅迫反應更為敏感，需要通過大量的脯氨酸積累來緩解因鹽脅迫引起的自由基和過氧化物對植株的傷害。高鹽濃度下野生型擬南芥脯氨酸含量下降，說明野生型擬南芥耐鹽能力相對較弱，脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)作用超過了閾值，滲透調(diào)節(jié)作用減弱。轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽濃度為250～300 mmol·L-1時，脯氨酸的鳥氨酸合成途徑被激活，脯氨酸含量顯著上升[22]。

鹽脅迫等逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡受到影響，產(chǎn)生較多的活性氧自由基，活性氧一方面攻擊細胞膜，另一方面攻擊核酸、蛋白質(zhì)，造成植物細胞損傷。SOD和POD是防御活性氧及其他自由基對細胞膜系統(tǒng)傷害的保護酶。有報道表明SOD、POD活性隨著鹽濃度的增加呈單峰曲線變化趨勢，活性先升高，后下降[23]。本研究中，SOD活性變化趨勢與前人結(jié)果基本一致。隨著鹽處理濃度的提高（150～300 mmol·L-1）SOD活性呈下降趨勢，這一現(xiàn)象可能與 H2O2積累過量反饋抑制SOD活性有關(guān)[24]。野生型擬南芥的POD活性先上升，在鹽濃度為300 mmol·L-1時有所下降；轉(zhuǎn)基因擬南芥則一直上升。探究原因，可能是由于逆境脅迫下，植物細胞所能承受的活性氧水平存在一個閾值，在此閾值內(nèi)，植物可以提高抗氧化酶活性，來消除活性氧帶來的傷害。超過這個閾值，抗氧化酶活性就會下降，過量的活性氧就會對植物細胞造成傷害。本研究中，野生型擬南芥SOD、POD活性變化趨勢與轉(zhuǎn)基因擬南芥基本相同，只是略低于后者，這可能是由于前者體內(nèi)也存在Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因，轉(zhuǎn)入Mz2NHX1基因后，該基因過量表達，使其保護酶活性提高。

綜合本研究的各項結(jié)果，轉(zhuǎn)Mz2NHX1基因擬南芥在種子發(fā)芽率以及幼苗生長中的各項生理指標均優(yōu)于野生型擬南芥，證明Mz2NHX1基因的轉(zhuǎn)入提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，對該基因轉(zhuǎn)入其他植物，完善植物耐鹽體系具有參考依據(jù)。

參考文獻：

[1]李建國，濮勵杰，朱明，等.土壤鹽漬化研究現(xiàn)狀及未來研究熱點[J].地理學報，2012，67（9）：1233-1245.

[2]彭立新，王明啟.滲透脅迫調(diào)節(jié)基因-Na+/H+Antiporter基因與植物耐鹽性[J].天津農(nóng)學院學報，2005，12（2）：45-47.

[3]孟曉燁.鹽脅迫下珠美海棠Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因（MzNHX1）的分離及表達特性研究[D].天津：天津農(nóng)學院， 2010.

[4]張永利，孟曉燁，孫婷梅，等.珠美海棠Mz2NHX1基因的克隆和序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（9）：20-25.

[5]魯紅俠，楊艷，朱小茜.NaCl脅迫對擬南芥種子萌發(fā)與幼苗生長的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2013，41（8）：3331-3333.

[6]陳愛葵，韓瑞宏，李東洋，等.植物葉片相對電導率測定方法比較研究[J].廣東教育學院學報，2010，30（5）：88-91.

[7]張治安，張美善，蔚榮海.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2004.

[8]孫海菁，王樹鳳，陳益泰.鹽脅迫對6個樹種的生長及生理指標的影響[J].林業(yè)科學研究，2009，22（3）：315-324.

[9]田曉艷，劉延吉，郭迎春.鹽脅迫對NHC牧草Na+、K+、Pro、可溶性糖及可溶性蛋白的影響[J].草業(yè)科學，2008，25（10）：34-38.

[10]張騰國，寇明剛，王圓圓，等.鹽脅迫對兩種油菜葉片生理指標的影響[J].西北師范大學學報（自然科學版），2014，50（5）：85-90.

[11]王娟，李德全.逆境條件下植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累與活性氧代謝[J].植物學通報，2001，18（4）：459-465.

[12]許祥明，葉和春，李國鳳.植物抗鹽機理的研究進展[J].應用與環(huán)境生物學報，2000，6（4）：379-387.

[13]賀軍民，佘小平，張鍵.番茄種子吸濕—回干處理對鹽脅迫傷害的緩解效應[J].園藝學報，2000，27（2）：123-126.

[14]游朝，晁朝霞，姚正培，等.轉(zhuǎn)MvNHX1和MvP5CS基因棉花耐鹽抗旱性比較與育種價值分析[J].棉花學報，2015，27（3）：198-207.endprint

[15]鄭琳琳，張慧榮，賀龍梅，等.唐古特白刺質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆與表達分析[J].草業(yè)學報，2013，22（4）：179-186.

[16]李彥，張英鵬，孫明，等.鹽分脅迫對植物的影響及植物耐鹽機理研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2008，24（1）：258-265.

[17]陳潔，林棲鳳.植物耐鹽生理及耐鹽機理研究進展[J].海南大學學報（自然科學版），2003，21（2）：177-182.

[18]HARO R， BANEULOS M A， QUINTERO F J， et al . Genetic basis of sodium exclusion and sodium tolerance in yeast. A model for plants[J].Physiologia plantarum，2006， 89（4）： 868-874

[19]DEMIRAL T， RKAN T. Comparative lipid peroxidation， antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance[J].Environmental and experimental botany，2005，53（3）：247-257.

[20]SANADA Y， KURIBAYASHI K， ANDOH T，et al .Novel light-dark change of proline levels in halophyte（Mesembryanthemum crystallinum L.）and glycophytes（Hordeum vulgare L.and Triticum aestivum L. ）leaves and roots under salt stress[J].Plant &cell physiology，1995， 36（6）： 965-970.

[21]SANTA-CRUZ A，ACOSTA M，RUS A，et al.Short-term salt tolerance mechanisms in differentially salt tolerant tomato species[J].Plant physiology & biochemistry，1999，37（1）：65-71.

[22]彭志紅，彭克勤，胡家金，等.滲透脅迫下植物脯氨酸積累的研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2002，18（4）：80-83.

[23]彭立新，周黎君，馮濤，等.鹽脅迫對沙棗幼苗抗氧化酶活性和膜脂過氧化的影響[J].天津農(nóng)學院學報，2009，16（4）：1-4.endprint