基于重組MTFP基因蛋白的犬心絲蟲抗體Dot—ELISA檢測方法的建立

姜鑫 李新 侯洪烈 高珺珊 宮鵬濤 李建華 楊舉 張西臣

摘 要：以建立Dot-ELISA檢測犬心絲蟲血清抗體的方法，用純化的犬心絲蟲MTFP基因蛋白為包被抗原，進(jìn)行條件優(yōu)化，篩選最佳反應(yīng)條件，并進(jìn)行敏感性、重復(fù)性和特異性等試驗。結(jié)果表明，建立的犬心絲蟲Dot-ELISA檢測方法最佳抗原包被濃度為0.5 μg·片-1；待檢樣品血清最佳稀釋比例為1∶50；HRP標(biāo)記兔抗犬抗體最佳稀釋比例為1∶4 000；建立的Dot-ELISA方法敏感性為1∶200；批間重復(fù)試驗證明，該方法具有良好的重復(fù)性，且與犬等孢球蟲陽性血清和犬蛔蟲陽性血清沒有交叉反應(yīng)；利用建立的方法對吉林省某地的62份待檢血清進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性率為4.8%。研究成功建立了基于重組MTFP基因蛋白的犬心絲蟲Dot-ELISA檢測血清抗體方法，為犬心絲蟲病流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷提供了新技術(shù)。

關(guān)鍵詞：犬心絲蟲；Dot-ELISA；MTFP蛋白

中圖分類號：R383.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.11.023

Abstract：To establish Dot-ELISA for detection infection by Dirofilaria immitis in dogs， the optimum reaction conditions was optimized with purified MTFP protein of Dirofilaria immitis as coating antigen， and the sensitivity， repetition and specificity were tested. The results showed that the optimum reaction conditions of established Dot-ELISA was 0.5 μg·tablet-1 for coated concentration， 1∶50 for the serum samples and 1∶4 000 for rabbit anti canine antibody labeled by HRP. The sensitivity of Dot-ELISA was 1∶200. The repeat test showed that the method had a good repeatability. There were no cross reaction with positive serum of Isospora spp and Toxocara canis. The detected results of 62 samples came from Jilin province showed the positive rate was 4.8% by the established method. The Dot-ELISA for detection on infection by Dirofilaria immitis in dogs based on recombinant MTFP protein had successfully established. It provided a new technology for pidemiological survey and clinical diagnosis of canine dirofilariasis.

Key words： Dirofilaria immitis；Dot-ELISA；MTFP

犬心絲蟲（Dirofilaria immitis）是一種通過蚊子傳播的線蟲，成蟲寄生在犬的右心室及肺動脈內(nèi)，會造成犬心臟的機械性栓塞，導(dǎo)致心肺機能下降及全身各系統(tǒng)的功能衰竭，最終導(dǎo)致患犬死亡[1-5]。目前對犬心絲蟲病的臨床檢查主要有：胸透攝影檢查法、心臟彩超檢查法等。實驗室檢查方法主要有血液蟲檢法、凝集試驗法、免疫印跡法等。但這些方法在實際應(yīng)用過程中存在的問題是檢測的靈敏度低，尤其是對尚未發(fā)病的隱性感染患犬檢出率低[6-10]。因此，建立切實可行的檢測犬心絲蟲的方法顯得尤為重要。

本研究利用吉林大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實驗室制備的犬心絲蟲pet-28a-MTFP表達(dá)菌純化得到犬心絲蟲MTFP蛋白，以其作為包被抗原，建立一種Dot-ELISA檢測犬心絲蟲血清抗體的方法，旨在為犬心絲蟲病的流行病學(xué)調(diào)查和臨床診斷提供一種新的方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 血清 自然感染犬心絲蟲病犬陽性血清及健康犬的陰性血清、犬等孢球蟲陽性血清和犬蛔蟲陽性血清、犬心絲蟲pet-28a-MTFP表達(dá)菌均由吉林大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實驗室提供。

1.1.2 包被抗原 犬心絲蟲pet-28a-MTFP表達(dá)菌經(jīng)表達(dá)純化得到犬心絲蟲MTFP蛋白，作為包被抗原。

1.1.3 Dot-ELISA所用試劑 包被液CBS（碳酸鹽緩沖液），用氫氧化鈉調(diào)pH值至9.6，4 ℃冰箱保存；洗滌液PBST（1 LPBS+0.5 mL Tween20）；封閉液（PBST稀釋的5%的脫脂奶粉溶液）。DAB顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG，購自北京博奧森公司；硝酸纖維素膜（NC膜），購自美國Millipore公司。

1.2 方 法

1.2.1 Dot-ELISA操作步驟 取適當(dāng)大小的NC膜，在盛有雙蒸水的平皿中浸泡20 min，使膜活化后取出至室溫干燥。將干燥好的膜片用4 mm直徑的打孔器打成圓形的小膜片，用鑷子將其放于96孔ELISA板內(nèi)。將稀釋好的抗原取2 μL點于除空白對照的每一個膜片的正中央，室溫晾干。膜片干燥后，將封閉液用排槍加于96孔板中，37 ℃封閉60 min，棄孔液，用PBST洗滌3次。每孔加入50 μL稀釋的被檢血清，37 ℃反應(yīng)60 min，棄孔液，用PBST洗滌3次。每孔加入50 μL酶標(biāo)二抗稀釋液，37 ℃反應(yīng)60 min。棄孔液，用PBST洗滌3次。每孔加入50 μL DAB顯色液，置于避光處反應(yīng)10～15 min，待顯色后每孔加入100 μL雙蒸水終止反應(yīng)。

1.2.2 結(jié)果判定 根據(jù)是否發(fā)生顯色以及顯色深淺來判定：膜片呈深褐色為強陽性（++++）膜片呈棕色判定為較強陽性 （+++）；膜片呈淺棕色判定為陽性 （++）；著色淡，與背景反差小者為弱陽性 （+）；未顯色者為陰性（-）。

1.2.3 最適包被抗原稀釋濃度的確定 將純化的MTFP蛋白用緩沖液對抗原按照1，0.5，0.25， 0.125，0 μg·片-1稀釋，放置在室溫使其干燥，從而確定Dot-ELISA的最佳抗原包被濃度。

1.2.4 最佳待檢血清稀釋濃度的確定 將2 μL MTFP蛋白稀釋液包被在NC膜上，用洗滌液PBST將自然感染的犬心絲蟲陽性血清按照1∶10，1∶50， 1∶100， 1∶200， 1∶400的比例稀釋，加入NC膜所在孔內(nèi)50 μL·孔-1，分別進(jìn)行Dot-ELISA，觀察顯色，從而確定Dot-ELISA待檢血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.5 最適酶標(biāo)二抗稀釋濃度的確定 將HRP標(biāo)記的兔抗犬抗體用洗滌液PBST按照1∶1 000， 1∶2 000，1∶4 000， 1∶8 000，1∶16 000比例稀釋，分別進(jìn)行Dot-ELISA，觀察顯色變化，從而確定Dot-ELISA酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.6 敏感性試驗 取犬心絲蟲陽性血清，按照1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600的比例稀釋，確定其敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗 選取3份犬心絲蟲陽性血清，使用不同批次的抗原片進(jìn)行Dot-ELISA試驗，每個批次做3次重復(fù)，確定其重復(fù)性。

1.2.8 特異性試驗 將犬心絲蟲陽性血清、犬等孢球蟲陽性血清以及犬蛔蟲陽性血清按1∶50比例稀釋，按照上面已建立的Dot-ELISA檢測方法進(jìn)行試驗，觀察血清交叉反應(yīng)情況，確定其特異性。

1.2.9 陽性樣品的檢測 按照以上方法對11份犬心絲蟲陽性血清進(jìn)行Dot-ELISA檢驗，從而評價該方法檢測結(jié)果與實際陽性血清的符合率。

1.2.10 初步應(yīng)用 應(yīng)用以上所建立的Dot-ELISA檢測方法對62份犬血清樣品進(jìn)行檢測，確定陽性樣品數(shù)與陰性樣品數(shù)，從而計算其陽性率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳包被抗原稀釋濃度的確定

當(dāng)包被量小于或等于0.25 μg·片-1時，膜片中央幾乎看不到斑點；當(dāng)抗原包被量為1.0，0.5 μg·片-1時，膜片中央斑點顯示得較為明顯，且當(dāng)抗原包被量為0.5 μg·片-1時，斑點大小最為均勻明顯，故0.5 μg·片-1為該方法的最佳包被濃度（圖1）。

2.2 最佳待檢血清稀釋濃度的確定

將自然感染的犬心絲蟲陽性血清用洗滌液PBST按照1∶10，1∶50，1∶100， 1∶200， 1∶400的比例稀釋，加入NC膜所在孔內(nèi)50 μL·孔-1，分別進(jìn)行Dot-ELISA檢測，觀察顯色，稀釋倍數(shù)為1：10～1：50時，膜片均呈現(xiàn)顏色，故可判定為陽性。所以，本試驗選擇1∶50作為待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)（圖2）。

2.3 最佳酶標(biāo)二抗稀釋濃度的確定

將HRP標(biāo)記兔抗犬二抗用PBST按照1∶1 000， 1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000比例稀釋，加入NC膜所在孔內(nèi)50 μL·孔-1，分別進(jìn)行Dot-ELISA檢測。由圖3可知，稀釋倍數(shù)為1∶2 000和1∶4 000時，膜片均呈現(xiàn)顏色，而當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶4 000以上時，膜片顏色不明顯，基本無色。所以，本試驗選擇1∶4 000作為酶標(biāo)二抗的最佳稀釋倍數(shù)。

2.4 敏感性試驗

取犬心絲蟲陽性血清，按照1∶50，1∶100，1∶200， 1∶400，1∶800，1∶1 600稀釋，應(yīng)用建立的Dot-ELISA最佳反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，犬心絲蟲陽性血清稀釋為1∶200時，膜片呈現(xiàn)顏色；而當(dāng)犬心絲蟲陽性血清稀到1∶400時，顏色接近無色。所以，Dot-ELISA檢測方法的敏感性確定為1∶200（圖4）。

2.5 重復(fù)性試驗

按照建立的Dot-ELISA檢測方法，抗原包被濃度為0.5 μg·片-1，犬心絲蟲陽性血清1∶50，HRP標(biāo)記的兔抗犬二抗稀釋為1∶4 000，選取3份犬心絲蟲陽性血清，使用不同批次的抗原片進(jìn)行Dot-ELISA試驗，重復(fù)3次，觀察其顏色變化。結(jié)果顯示，其具有可重復(fù)性（圖5）。

2.6 特異性試驗

以犬等孢球蟲陽性血清和犬蛔蟲陽性血清為對照，按照建立的Dot-ELISA檢測方法進(jìn)行檢驗，犬心絲蟲陽性血清和犬等孢球蟲陽性血清、犬蛔蟲陽性血清沒有交叉反應(yīng)，說明該方法特異性較強（圖6）。

2.7 陽性樣品的檢測

通過對標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品的檢測，結(jié)果表明，本試驗建立的Dot-ELISA檢測方法對遼寧省丹東市11份已知的犬心絲蟲陽性血清檢測均表現(xiàn)為陽性，即檢測結(jié)果與實際陽性樣品的符合率為100%。

2.8 Dot-ELISA檢測方法的初步應(yīng)用

應(yīng)用已建立的Dot-ELISA方法對吉林省某地62份待檢血清進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出3份陽性樣本，陽性率為4.8%。

3 結(jié)論與討論

犬心絲蟲是一種能夠引起犬等心臟機械性栓塞并致死的人畜共患寄生蟲[1，12]。其檢測方法有多種，但傳統(tǒng)方法過于繁瑣，不適于大量檢測；分子生物學(xué)檢測技術(shù)又過于依賴試驗儀器[12-14]。而Dot-ELISA方法具有敏感性高、重復(fù)性好、特異性強等特點，并且不需要儀器就可以通過肉眼直接觀察結(jié)果，大大地方便了操作者對陽性樣品的判斷，易在基層檢疫工作中推廣[15]。

本研究所用的包被抗原為吉林大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實驗室先前篩選獲得的馬來絲蟲肌球蛋白尾家族蛋白同源蛋白MTFP，經(jīng)ELISA及Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)MTFP基因蛋白具有良好的反應(yīng)原性。侯洪烈等[16]利用MTFP蛋白建立了犬心絲蟲間接ELISA檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有敏感性高、特異性強等特點，并認(rèn)為其可作為候選診斷抗原建立檢測方法。本研究在吉林大學(xué)動物寄生蟲學(xué)實驗室建立的間接ELISA檢測方法基礎(chǔ)上，通過8 mol·L-1尿素的方法純化MTFP蛋白，通過梯度透析法將MTFP蛋白在體外進(jìn)行重折疊，得到了較高濃度的可溶性蛋白，用于本試驗的包被抗原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其具有較好的反應(yīng)原性。其結(jié)果為犬心絲蟲病的診斷提供了一種新的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊光友.動物寄生蟲病學(xué)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2004：185-187.

[2]TEZUKA H，IMAI S，HIDANO S，et al.Various types of Dirofilaria immitis polyproteins selectively induce a Th2-Type immune response[J].Infection and immunity，2003，71（7）：3802-3811.

[3]RISHNIW M，BARR S C，SIMPSON K W，et al.Discrimination between six species of canine microfilariae by a single polymerase chain reaction[J].Veterinary parasitology，2006，135（3/4）：303-314.

[4]汪明.獸醫(yī)寄生蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：385-386.

[5]陳紅英，林遠(yuǎn)青，歐海濤.犬心絲蟲病的診斷與治療[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2003，33（12）：43.

[6]朱培坤.免疫酶技術(shù)[M].濟南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1983：244.

[7]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2000：166-183.

[8]王力光，董君艷，溫海，等.新編犬臨床指南[M].長春：吉林省科學(xué)技術(shù)出版社，2000：120.

[9] RILEY S P，F(xiàn)OLEY J，CHOMEL B，et al. Exposure to feline and canine pathogens in bobcats an grey foxes in urban and rural zones of a National park in California[J].Journal of wildlife diseases，2004，40（1）：11-12.

[10]RUSNAK J，HADFIELD T L，RHODES M M，et al.Detection of cryptosporidium oocysts in human fecal specimens by an indirect immunofluorescence assay with monoclonal antibodies[J].Journal of clinical microbiology，1989，27（5）：1135-1136.

[11]沈杰，黃兵.中國家畜家禽寄生蟲名錄[M].北京：中國科學(xué)技術(shù)出版社，2004：110.

[12]MYLONAKIS M E，PAPADOPOULOS E，KOUTINAS A F.Comparative methodology for the detection and differentiation of circulating microfilariae of Dirofilaria immitis in the dog[J].Journal of helminthology，2004，78（2）：137-140.

[13]HAYASAKI M.Immunological analysis of agglutination in Dirofilaria immitis microfllariae[J].The journal of veterinary medical science / The Japanese society of veterinary science， 2001， 63（8）：903-907.

[14]WANG L C.Comparison of a whole-blood agglutination test and an ELISA for the detection of the antigens of Dirofilaria immitis in dogs[J].Annals of tropical medicine and parasitology，1998，92（1）：73-77.

[15]JAFAR POUR AZAMI S，KESHAVARZ H，REZAIAN M，et al.Rapid detection of toxoplasma gondii antigen in experimentally infected mice by Dot- ELISA[J].Iranian journal of parasitology，2011，6（1）：28-33.

[16]侯洪烈.犬惡絲蟲成蟲cDNA文庫的構(gòu)建及免疫相關(guān)蛋白的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2011.