10種中藥提取物體外抗傳染性支氣管炎病毒效果的研究

谷 穎 李 麗 王玉堃 （山東迅達康獸藥有限公司 山東 濟南 250300）

10種中藥提取物體外抗傳染性支氣管炎病毒效果的研究

谷 穎 李 麗 王玉堃 （山東迅達康獸藥有限公司 山東 濟南 250300）

采用體外細胞培養(yǎng)法，研究板藍根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當歸10種中藥提取物在雞胚成纖維細胞體外培養(yǎng)中的最大安全濃度，借助光學倒置顯微鏡，肉眼觀察提取物對細胞形態(tài)的影響。在安全濃度范圍內分別考察各味中藥對傳染性支氣管炎病毒標準株M41型（IBV-M41）的防治效果，確定4種抗病毒力最強的4種中藥進行后續(xù)的試驗。結果表明，板藍根、大青葉、黃連和淫羊藿對IBV-M41的抗病毒效果最好。

中藥提取物 雞胚成纖維細胞 安全濃度 傳染性支氣管炎病毒

病毒感染是一大類嚴重威脅畜禽健康的疾病，且由于疫苗和抗病毒西藥的大規(guī)模使用，很多病毒的毒力和抗原性發(fā)生了抗藥性，使得防治病毒性疾病的難度增大。近年來，由于多種中草藥及其成分有很好的抗病毒作用，且具有調節(jié)機體免疫功能、抗病毒譜廣、很少產生抗藥性、療效顯著等優(yōu)點，正日益成為抗病毒新藥的研究熱點。將抗病毒中藥應用到動物身上具有很大的市場前景。

雞傳染性支氣管炎(IB)是由傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病，其特征是病雞咳嗽、噴嚏以及氣管發(fā)出啰音[1]。IBV變異性強，血清型多，各血清型間沒有或僅有部分交互免疫，這給該病的防治帶來很大的困難，而中草藥抗病毒優(yōu)勢眾多，因此中草藥防治IBV成為很好的選擇。對于備選的板藍根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當歸這10種中藥材，分別篩選確定了提取工藝并得到各單味中藥的提取物。為了研究它們的抗病毒效果，必須首先排除這些藥物對細胞的直接損傷。因此，本試驗將單味中藥提取物稀釋成一系列的濃度，然后將其和雞胚成纖維細胞(CEF)共同培養(yǎng)，篩選出各自作用于雞胚成纖維細胞的最大安全濃度。本研究針對的是由IBV-M41引起的腎型傳染性支氣管炎[2]，在最大安全濃度范圍內探討各個中藥提取物對此病毒的防治效果，為治療IB提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥品 （1）板藍根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當歸購自濟南中藥批發(fā)市場。（2）雞胚(11日齡，SPF胚)，購自山東家禽研究所。（3）強毒IBV-M41株由中國農業(yè)大學提供，經本實驗室SPF雞胚傳代，收獲尿囊液，于-70℃冰箱中保存，用前經CEF傳代3次。按Reed-Muench法[3]測定IBV-M41對CEF半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為10-6/0.1ml，用細胞維持液配成100TCID50濃度備用。

1.1.2 試驗試劑 （1）小牛血清購自杭州四季青，56℃30min滅活，分裝后于-20℃保存；胰蛋白酶(購自碧云天)消化液、D-Hanks'均自己配制。（2）MEM培養(yǎng)液：按照說明書，將9.4g MEM(Hyclone，SH40012-6)溶于1000ml雙蒸水中，分裝，高壓滅菌。臨用前，用10% NaHCO3調節(jié)pH至7.2～7.4，并加入5%滅活小牛血清和1%谷氨酰胺；（3）細胞維持液：同MEM培養(yǎng)液，但不加小牛血清。

1.1.3 試驗儀器 分光光度計、超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、離心機、光學倒置顯微鏡等；鑷子、紗布塊、小燒杯、96孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板、0.22μm微孔濾器、100ml細胞培養(yǎng)瓶等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗準備 （1）中藥提取液的制備：采用常規(guī)水煎煮法制備10種中藥的提取液，最終使提取液濃縮成1g/ml的藥液(1ml溶液相當于1g生藥)，3000r/ml離心20min，得上清液，藥液用0.22μm微孔濾膜過濾。分裝，高壓蒸汽滅菌，4℃冷藏備用。（2）中藥提取液的稀釋：分別吸取10種中藥提取物1ml至24孔細胞培養(yǎng)板第1孔中，然后各用等體積的細胞維持液做連續(xù)的2倍倍比稀釋，從第1孔直到15孔，藥物的稀釋倍數(shù)分別為21～215。（3）雞胚成纖維細胞(CEF)制備：參考文獻[4-7]中方法制備CEF。取11日齡雞胚一個于滅菌的超凈工作臺中，用碘酒棉球消毒蛋殼的氣室部分，用鑷子打開氣室。取出雞胚，剪去頭，爪和內臟，將其置于培養(yǎng)皿中，用Hanks,液洗去血污。將組織塊置于小燒杯中剪成碎塊(越碎越好)，再用Hanks,液清洗2～3次。加入10ml 胰蛋白酶液在37℃水浴中消化，每隔幾分鐘取出搖勻，共處理30min(組織塊變松散，沉降較慢時表示消化足夠)。加入5ml Hanks液終止消化，混勻，靜置，待沉降后倒出上清。加入5ml MEM培養(yǎng)液，混勻靜置，待沉降后倒出上清，用8層紗布過濾。用MEM培養(yǎng)液將細胞懸浮計數(shù)后調整細胞密度為5×105個/ml，再分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。（4）單層CEF細胞的培養(yǎng)。將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，待細胞均勻鋪滿單層后取出，把MEM培養(yǎng)液析出，用D-Hanks'液洗1遍，吸去D- Hanks'。

1.2.2 中藥提取物在CEF上的安全濃度測試 （1）中藥提取物對單層CEF細胞的影響：試驗組各孔分別加入各濃度中藥提取物100μl和細胞維持液100μl，每種藥各濃度各重復4孔，同時設不加藥物的對照孔4孔。用透明膠帶密封，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)，于72h時觀察細胞單層完好程度，以四孔都不發(fā)生病變的濃度為最大安全濃度。（2）單層CEF細胞形態(tài)記錄方法：參考文獻，“+++++”表示細胞生長最好，細胞折光性好，全部行成完整單層，無空隙；“++++”表示細胞生長較好，形成單層，基本無空隙；“+++”表示細胞生長一般，未形成單層，有較多空隙和極少圓細胞；“++”表示細胞生長較差，有大量圓細胞和空隙；“+”表示細胞很差，基本為圓細胞，極少貼壁細胞；“-”表示細胞極差，全部為未貼壁圓細胞或細胞破碎不完整或輪廓不清。

1.2.3 中藥提取物對IBV的預防和治療作用 （1）中藥提取物濃度處理：以10種中藥提取物最大安全濃度為起始濃度，用細胞維持液分別2倍倍比稀釋成4個稀釋度(21、22、23、24)。（2）先加中藥提取物再加病毒：在長滿單層CEF細胞的96孔板的各孔中加入中藥提取物100μl，每個稀釋度重復4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去各孔藥液，再每孔加入100TCID50病毒液100μl。同時設病毒對照組、細胞對照組和空白對照組(沒有細胞，僅在培養(yǎng)細胞時加100μl MEM培養(yǎng)液，后加細胞維持液100μl)各4孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12h觀察致細胞病變效應(CPE)變化，當病毒對照組CPE達到百分之七八十時，病變記錄為終點，用MTT法[8]測定570nm下的吸光度(A570)，作為中藥提取物抵抗IBV感染的指標。A570值與活細胞的生長呈正比，A570值越大，表明細胞生長越旺盛，抗感染效果越好。（3）先加病毒提取物再加中藥：在含有單層CEF細胞的96孔板的每孔加入100TCID50病毒液100μl，同時設病毒對照組、細胞對照組和空白對照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，棄去各孔病毒液，每個中藥提取物稀釋度重復4孔，100μl/孔。（4）數(shù)據(jù)處理：取4孔的平均值，數(shù)據(jù)以“Means±SD”表示，并用SPSS軟件進行多重分析。

2 結果與分析

2.1 中藥提取物對單層CEF細胞的影響

由表1可以看出，黃芪提取物對單層CEF細胞的影響是最小的，最大安全濃度為26，即15.63mg/ml；其次是人參、山藥，它們的最大安全濃度都是29(即1.95mg/ml)。茯苓、當歸、板藍根、大青葉、黃連、菊花和淫羊藿的最大安全濃度分別是0.976、0.976、0.976、0.976、0.488、0.488、0.244mg/ml。

表1 72h觀察中藥提取物對單層CEF細胞的影響結果

2.2 中藥提取物對IBV的預防和治療作用

2.2.1 中藥提取物對IBV的預防作用 由表2可知，10種中藥提取物在高濃度區(qū)的A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)，表明在安全濃度范圍內中藥提取物濃度越高，細胞生長越旺盛，抗感染的效果越好。在高稀釋度下，中藥提取物抗感染的效果不明顯。結果表明，板藍根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥和當歸這10種中藥的提取物對IBV均有一定的抵抗病毒感染的作用。

2.2.2 中藥提取物對IBV的治療作用 由表3可知，板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿在高濃度區(qū)的A570值顯著大于病毒對照組(P＜0.05)，其它稀釋度的差異不顯著；其它中藥提取物的A570值與對照組相比差異并不顯著。結果表明板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿這4種中藥提取物對IBV感染的細胞有比較明顯的殺毒作用。

表2 中藥提取物各稀釋度的A570

表3 中藥提取物各稀釋度的A570

3 討論

（1）試驗結果表明，中藥并不是完全無毒無害的，以上十種中藥提取物在高濃度時能抑制細胞的生長，都對CEF細胞表現(xiàn)出一定的毒性，隨著加入的提取物濃度的下降，毒性作用逐漸減弱。黃芪對細胞毒性作用特別小，最大安全濃度為15.63mg/ml；王志潔[9]測得黃芪對Hep-2細胞的最大無毒濃度為82.43mg/ml，高于本實驗的結果，這可能是細胞種類不同，其耐受性不同所造成的。人參、山藥對細胞的毒性作用也很小。此試驗結果與之前劉家國[10]所得出的黃芪、當歸、人參對CEF細胞毒性小具有一致性，本試驗測定安全濃度時通過觀察細胞形態(tài)的方法，此方法簡單易行，但是劃分等級粗糙，在判斷細胞病變程度時不可避免的存在著主觀因素。（2）體外研究抗病毒中草藥的活性時，一般分三個步驟，首先利用敏感細胞進行毒種的傳代，連續(xù)傳代三代以上之后測定病毒對細胞的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）；然后測定中草藥本身對細胞的毒性；最后進行中草藥體外抗病毒試驗[11]。（3）先加中藥后加病毒，目的是觀察中藥能否阻止病毒的吸附和侵入，這種方式在臨床中相當于預防，可以阻止病毒吸附和進入細胞[12]，其作用機理可能是中藥提取物與細胞共同作用一段時間后提高了細胞膜的穩(wěn)定性，在加入病毒之后可以有效的阻止病毒的吸附和侵入。本試驗結果顯示，先加中藥后接種病毒時，板藍根、大青葉、黃連、菊花、淫羊藿、人參、茯苓、黃芪、山藥、當歸這10種中藥提取物對IBV感染在高濃度時均有顯著的阻斷作用，提示這些中藥提取物都能夠抑制病毒感染，可以應用于病毒性疾病的預防。（4）先加病毒后加中藥，相當于先感染細胞，然后研究中藥提取物對已經進入細胞的病毒是否起作用。只有板藍根、大青葉、黃連、淫羊藿這4種中藥提取物對IBV感染有顯著的治療作用，其它中藥提取物的抑制作用不明顯。任宇皓等之前的研究表明，黃芪多糖和淫羊藿多糖在病毒之后加入時對NDV無明顯的抑制作用[13]，可能原因是病毒不同。張素梅[14]等報道黃芪對偽狂犬病毒無抑制作用，高海匯[15]等研究表明，黃芪多糖具有較強的免疫促進作用，這些結果與本實驗結果一致，即黃芪本身對病毒無殺滅作用，但它具有較強的免疫促進作用。部分中藥治療效果不明顯可能是因為先接種的病毒已經侵入破壞了細胞，其抗病毒感染的能力無法恢復。

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