高效液相色譜法測定秸稈浸提液或腐解液中12種酚酸

于建光，常志州，王 寧，石祖梁，盧 信，張傳輝

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部江蘇耕地保育科學(xué)觀測實(shí)驗站，南京 210014）

高效液相色譜法測定秸稈浸提液或腐解液中12種酚酸

于建光1，2，常志州1，王 寧1，石祖梁1，盧 信1，張傳輝1

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，南京 210014；2.農(nóng)業(yè)部江蘇耕地保育科學(xué)觀測實(shí)驗站，南京 210014）

建立了同時測定秸稈浸提液或腐解液中12種酚酸物質(zhì)（沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸）的反相高效液相色譜測定方法。采用Waters HLB（500 mg、60 μm、6 mL）固相萃取小柱對水溶液中的酚酸物質(zhì)進(jìn)行濃縮，以含0.5%乙酸的乙腈和0.5%乙酸的水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，選用二極管陣列檢測器，30 min內(nèi)可對12種酚酸物質(zhì)同時檢測，各種酚酸均可達(dá)到基線分離。加標(biāo)回收試驗表明，樣品中12種酚酸類化合物的加標(biāo)回收率為79.41%～101.92%，12種酚酸保留時間和峰面積的RSD分別在0.02%～0.1%和0.25%～2.26%之間。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于同時測定秸稈浸提液、腐解液、土壤溶液及水溶液中12種酚酸物質(zhì)含量。

高效液相色譜；秸稈浸提液；秸稈腐解液；酚酸

秸稈還田作為一項有效的秸稈處置措施被廣泛采用，報道中大多肯定其良好的環(huán)境與生態(tài)效應(yīng)[1]，但其所產(chǎn)生的負(fù)面效應(yīng)如化感效應(yīng)等也不容忽視[2]。由秸稈還田所產(chǎn)生的化感效應(yīng)主要表現(xiàn)為秸稈分解釋放的化感物質(zhì)酚、酸、醛、酮等化合物對作物發(fā)芽、出苗及根產(chǎn)生抑制[3-4]，尤其是酚酸類物質(zhì)在農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在[5-7]，且大多數(shù)均有化感效應(yīng)。本課題組的研究結(jié)果表明，小麥秸稈浸提液和腐解液對水稻種子的萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，其作用與秸稈含有或腐解產(chǎn)生的酚酸有關(guān)[8]，并在隨后的酚酸純品模擬試驗中得以確認(rèn)[9]。

準(zhǔn)確鑒定不同還田條件下土壤和秸稈中的酚酸物質(zhì)種類并確定其含量有助于正確評估酚酸物質(zhì)在秸稈化感效應(yīng)中的作用，進(jìn)而可有針對性地研發(fā)秸稈還田技術(shù)和指導(dǎo)秸稈還田工作。不同植物殘體化感效應(yīng)中的酚酸種類不同，如大豆根系分泌物和植株水浸液中有香草酸、香草醛和對羥基苯甲酸等[10]，柑橘園主要為高香草酸[11]，向日葵秸稈中主要為綠原酸[12]，稻草、鋸木屑、豬糞腐解釋放對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸、阿魏酸[13]，小麥秸稈中有阿魏酸、對羥基苯甲酸和苯甲酸[14-15]。上述報道中涉及的酚酸物質(zhì)多為1種或幾種酚酸，而多種酚酸物質(zhì)含量測定的報道主要集中于食品和藥品[16-17]，如咖啡豆中的6種酚酸類化合物[18]，大麥籽粒中的13種酚酸[19]，向日葵籽中的2種酚酸[20]等。

由于秸稈中酚酸或秸稈腐解產(chǎn)物中直接起作用的有效組分以水溶態(tài)為主[21]，已有報道中涉及酚酸測定的方法不適用于秸稈浸提液和腐解液中酚酸含量測定，如酚酸濃度較高且種類與秸稈中不同[22]，未考慮如何從水相中富集提純酚酸[23]，從水相中化學(xué)萃取但試劑消耗量過大[24]，而用于較全面測定秸稈中酚酸物質(zhì)尤其是水溶性酚酸含量的方法未有報道。本文擬對秸稈浸提液或腐解液中常見的12種酚酸的測定方法進(jìn)行開發(fā)，以期為正確評估酚酸類物質(zhì)在秸稈還田中的化感效應(yīng)和在還田技術(shù)中引入化感效應(yīng)調(diào)控措施提供方法參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀Agilent HPLC1200，真空在線脫氣機(jī)G1322A，四元泵G1311A，柱溫箱G1329A，安捷倫Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm、粒徑5 μm）色譜柱，保護(hù)柱為XDB C18小柱（4.6 mm×12.5 mm，粒徑5 μm），標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器G1329A，DAD檢測器G1315D，化學(xué)工作站為ChemStation B04.02。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi Corp.，R-210，真空泵V-700），固相萃取儀（天津恒奧科技公司，HSE-08），SQP型電子天平（Sartorius Corp.），0.45 μm有機(jī)相一次性針頭式濾器（天津津騰實(shí)驗設(shè)備有限公司）。Eppendorf移液器、25 mL棕色容量瓶（Schott Corp.），超純水由純水機(jī)制備（愛科譜公司）。甲醇、乙酸、乙腈均為色譜純試劑（Merck Corp.），流動相配制后均經(jīng)超聲處理方可使用。固相萃取小柱分別為Biotage ABN（200 mg、50 μm、6 mL）、Waters C18（500 mg、79 μm、3 mL）、Waters HLB（500 mg、60 μm、6 mL）。

沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、水楊酸等12種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品均購自Sigma公司，除原兒茶酸、綠原酸、香草酸和丁香酸純度為95%～97%外，其余酚酸純度均在99%以上。

1.2 色譜條件

流動相為含0.5%乙酸的乙腈和含0.5%乙酸的超純水，色譜柱：0～25 min乙腈5%～20%，25～26 min乙腈20%～5%，26～28 min乙腈5%，流速為1 mL· min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL；二極管陣列檢測器檢測260、270、310、325 nm波長的色譜圖，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取上述12種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，全部置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得1 mg· mL-1的12種酚酸溶液混合液，將其依次用甲醇溶液稀釋得500、250、100、50、20、10、5、1 μg·mL-1系列混合溶液。同時準(zhǔn)確稱取12種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg，分別置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得1 mg·mL-1的單一種酚酸溶液，用于液相色譜單峰的鑒別與定性。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加標(biāo)回收率測定

分別準(zhǔn)確稱取12種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg置于燒杯中，加兩滴甲醇溶解，隨后加超純水定容于2 L容量瓶中，得10 μg·mL-1的12種酚酸混合水溶液；吸取該酚酸混合水溶液100 mL過預(yù)先經(jīng)活化的固相萃取小柱，用10 mL甲醇溶液進(jìn)行樣品收集，將收集液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，40℃下進(jìn)行旋蒸，旋蒸至干后加2 mL甲醇定容收集并過0.45 μm濾器后上HPLC測定。通過測定數(shù)據(jù)計算3種不同固相萃取小柱萃取濃縮后各種酚酸的回收率，小柱均為一次性使用，每種固相萃取小柱回收試驗均重復(fù)3次。

1.5 秸稈浸提液、腐解液制備及酚酸含量測定

水稻秸稈浸提液和腐解液分別通過下述方法獲得：水稻秸稈浸提液E10，將成熟水稻秸稈與水以1∶10（質(zhì)量g∶體積mL，W/V）在20℃下浸提24 h后靜置，上清液先經(jīng)4層紗布過濾、后經(jīng)Whatman濾紙過濾，即為10%溶液（E10）；水稻秸稈腐解液D10，將水稻秸稈、土壤和純水以1∶1∶10（質(zhì)量g∶質(zhì)量g∶體積mL，W/W/ V）20℃振蕩混合淹水培養(yǎng)7 d后靜置，上清液先經(jīng)4層紗布過濾、后經(jīng)Whatman濾紙過濾，即為10%腐解液（D10）。上述E10和D10溶液的獲得均重復(fù)3次。

將E10或D10通過冷凍離心機(jī)1800 r·min-1離心10 min后過濾，采用與酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液同樣的方法通過固相萃取小柱，然后在40℃下旋蒸濃縮為2 mL，采用與上述標(biāo)準(zhǔn)酚酸溶液完全相同的方法通過液相色譜儀，根據(jù)待測組分的信號，用回歸方程計算出樣品的實(shí)測濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然酚酸類化合物測定波長的選擇

通過將各酚酸單一組分溶液經(jīng)過高效液相色譜儀后進(jìn)行光譜掃描（DAD），確定各酚酸的最大吸收峰，與已有的文獻(xiàn)進(jìn)行對照，并綜合考慮各酚酸物質(zhì)最大吸收峰和溶劑的截止波長，然后分類選擇可共用的波長，選定結(jié)果如表1。

表1 12種酚酸經(jīng)HPLC-DAD測定時采用的紫外波長Table 1 UV wavelength of 12 kinds of phenolic acids measured by HPLC-DAD

2.2 流動相的選擇和優(yōu)化

結(jié)合文獻(xiàn)報道[23]，發(fā)現(xiàn)流動相為CH3CN-H2O系統(tǒng)時的峰形和選擇性比CH3OH-H2O有明顯改善，但峰形仍不理想，加入酸性抑制劑后，分離度明顯改善，且峰形變?yōu)殇J峰，符合分離要求。

采用等度洗脫時，各峰分離不理想，采用梯度洗脫后分離較好，經(jīng)多次梯度洗脫條件優(yōu)化，最理想的洗脫條件為：0～25 min乙腈5%～20%，25～26 min乙腈20%～5%，26～28 min乙腈5%，流速為1 mL·min-1。

2.3 峰的歸屬和純度檢查

分別將適量單一酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入混合標(biāo)樣中，隨即進(jìn)行分析，通過與加入前的譜圖進(jìn)行對比，將吸光度明顯增大的峰認(rèn)定為該酚酸的峰，并將其譜圖與相應(yīng)的已知標(biāo)準(zhǔn)品譜圖進(jìn)行比較加以印證，逐一確認(rèn)12種酚酸的相應(yīng)峰位和出峰時間。

2.4 12種酚酸的工作曲線及檢測限

將已逐級稀釋配制的12種酚酸混合甲醇溶液分別進(jìn)樣5 μL，記錄對應(yīng)峰面積；以濃度x（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積值y（mAU）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到12種酚酸物質(zhì)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。再分別配制0.5、0.25、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.001 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)酚酸混合溶液，分別獲得各溶液的色譜圖（圖1），以儀器信噪比確定12種酚酸的最低檢出限（S/N≥3，表2）。

方法精密度測定：將1 μg·mL-1的酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，獲得保留時間和相應(yīng)的峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），12種酚酸保留時間和峰面積的RSD分別在0.02%～0.10%和0.25%～2.26%之間，重現(xiàn)性良好（表2）。

2.5 12種酚酸固相萃取回收率測定

3種固相萃取小柱對12種酚酸水溶液的濃縮回收率差異較大，其中ABN和C18對6種酚酸的回收率均不到60%，而HLB對所有12種酚酸的回收率為79.41%～101.92%。這表明HLB適用于本研究中所選12種酚酸的濃縮回收（表3）。究其原因認(rèn)為，不同于傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)固相萃取小柱，HLB為水浸潤型聚合物固相萃取小柱，其所含的HLB聚合物表面有親水性和疏水性基團(tuán)，非常適合于含水樣品中極性與非極性有機(jī)化合物的同時提取，因而對水溶液中酚酸進(jìn)行富集可獲得較高的回收率，同時其使用成本也高于另外兩種小柱。

2.6 水稻秸稈浸提液和腐解液中12種酚酸物質(zhì)的含量

水稻秸稈在20℃下經(jīng)24 h浸提后，采用上述測定方法可檢測到浸提液中含有10種酚酸物質(zhì)，其含量介于0.59～28.59 ng·mL-1間（表4）。水稻秸稈在20℃下經(jīng)7 d腐解后，采用上述同樣方法可檢測到腐解液中含有5種酚酸物質(zhì)，其含量介于1.18～349.48 ng· mL-1間（表4）。水稻秸稈浸提液中酚酸主要來源于秸稈自身攜帶的次生代謝產(chǎn)物，而水稻秸稈經(jīng)7 d分解后，秸稈中纖維素和木質(zhì)素均可降解產(chǎn)生酚酸，因而它們的酚酸種類與含量均不同。

圖1 12種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品HPLC-DAD色譜分析圖Figure 1 HPLC-DAD chromatogram of a mixture of 12 phenolic acid standards

3 結(jié)論

（1）采用Waters HLB固相萃取小柱對秸稈浸提液或腐解液中的酚酸物質(zhì)進(jìn)行富集，經(jīng)梯度洗脫、二極管陣列檢測器4個波長檢測，30 min內(nèi)12種酚酸所對應(yīng)的吸收峰均可達(dá)到基線分離。

（2）該方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地富集并測定秸稈浸提液、腐解液和土壤溶液中常見12種酚酸物質(zhì)的含量，可為正確評估酚酸類物質(zhì)在農(nóng)林地及水體中的化感效應(yīng)提供技術(shù)支持。

表2 12種酚酸的保留時間、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢測限Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r），linear ranges and limits of detection of 12 phenolic acids

表3 12種酚酸樣品經(jīng)SPE后HPLC測定回收率（%）Table 3 Spiked recoveries and precisions（RSD）of 12 phenolic acids

表4 稻秸浸提液和腐解液中12種酚酸含量Table 4 Content of 12 kinds of phenolic acid in rice straw extract and decomposed liquid

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Determination of 12 phenolic acids in straw extract or straw decomposed liquid through high performance liquid chromatography

YU Jian-guang1,2,CHANG Zhi-zhou1,WANG Ning1,SHI Zu-liang1,LU Xin1,ZHANG Chuan-hui1
（1.Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;2.Scientific Ob-Serving and Experimental Station of Arable Land Conservation（Jiangsu）,Ministry of Agriculture,Nanjing 210014,China）

A method of reversed phase high performance liquid chromatography was established,which could be used to determine the contents of 12 phenolic acids（gallic acid,protocatechuic acid,gentisic acid,p-hydroxybenzoic acid,chlorogenic acid,vanilla acid,coffee acid, syringic acid,p-coumaric acid,ferulic acid,sinapic acid,salicylic acid）simultaneously in straw extract or decomposed liquid.Waters HLB（500 mg,60 μm,6 mL）solid-phase extraction cartridges were used to concentrate phenolic acids in aqueous solution.The gradient elution was carried out using acetonitrile solution containing 0.5%acetic acid and 0.5%acetic acid solution as the mobile phase.The diode array detector was used for detection,and the determination of 12 kinds of phenolic acids could be completed simultaneously in 30 minutes.All of phenolic acids could reach the baseline separation.The recovery rate of 12 phenolic acids were between 79.41%～101.92%,and the RSD of retention time and peak area of 12 phenolic acids were between 0.02%～0.1%and 0.25%～2.26%,respectively.This method is rapid,sensitive and accurate,suitable for the simultaneous determination of 12 phenolic acids existed in straw extract,straw decomposed liquid,soil solution and aqueous solution.

high performance liquid chromatography;straw extract;straw decomposed liquid;phenolic acids

S153.6

A

1672-2043（2016）11-2231-06

10.11654/jaes.2016-0591

2016-04-27

國家自然科學(xué)基金項目（41271308）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503136）；江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2011672）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX（12）1002]

于建光（1975—），男，山西忻州人，博士，副研究員，研究方向為農(nóng)田土壤退化與修復(fù)。E-mail：yujg@jaas.ac.cn

于建光，常志州，王寧，等.高效液相色譜法測定秸稈浸提液或腐解液中12種酚酸[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2016,35（11）：2231-2236.

YU Jian-guang,CHANG Zhi-zhou,WANG Ning,et al.Determination of 12 phenolic acids in straw extract or straw decomposed liquid through high performance liquid chromatography[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35（11）：2231-2236.