固相萃取–氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中9種農(nóng)藥殘留量*

顏鴻飛，王美玲，陳練，呂小園，戴潔蕓

（湖南出入境檢驗檢疫局，國家食品安全檢測重點實驗室，長沙 410004）

固相萃取–氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中9種農(nóng)藥殘留量*

顏鴻飛，王美玲，陳練，呂小園，戴潔蕓

（湖南出入境檢驗檢疫局，國家食品安全檢測重點實驗室，長沙 410004）

建立固相萃取凈化–氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定茶葉中9種農(nóng)藥殘留量的方法。茶葉樣品用乙腈均質(zhì)提取，提取液經(jīng)固相萃取凈化處理后，采用DB–5MS毛細(xì)管色譜柱分離，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下測定，外標(biāo)法定量。9種農(nóng)藥組分的質(zhì)量濃度在0.01～0.50 mg／L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好線性，相關(guān)系數(shù)r2大于0.998，方法測定下限（10 S／N）為0.002～0.01 mg／kg。以空白綠茶、紅茶、普洱茶和烏龍茶為基體，在0.05，0.1，0.2 mg／kg 3個添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)回收率在73.6%～99.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.7%（n=6）。該法操作簡便、快速，適用于茶葉中多種農(nóng)藥殘留的測定。

固相萃?。粴庀嗌V–串聯(lián)質(zhì)譜法；茶葉；農(nóng)藥殘留

茶葉是我國主要的飲品之一，我國是茶葉生產(chǎn)、消費和出口大國。近年來，茶葉中農(nóng)藥殘留問題受到了人們的廣泛關(guān)注，主要茶葉進(jìn)口國家和地區(qū)紛紛制定和實施越來越嚴(yán)格的茶葉農(nóng)藥殘留新標(biāo)準(zhǔn)，給我國茶葉出口帶來了巨大的沖擊和考驗。香港《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》于2014年8月1日起正式實施，該技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)對茶葉中10余種除害劑進(jìn)行了重點監(jiān)控［1－2］。與此同時，冗長且繁瑣的農(nóng)殘檢測樣品前處理技術(shù)已難以適應(yīng)新形勢下茶葉農(nóng)殘日常檢測工作需求。因此建立茶葉中多種農(nóng)藥殘留的快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法具有重要的實際意義。常見茶葉中農(nóng)藥殘留的分析方法有氣相色譜法(GC)［3–6］、氣相色譜–質(zhì)譜法(GC–MS)［7–9］、氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(GC–MS–MS)［10］、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(LC–MS–MS)［11–16］等。其中GC–MS–MS分離性能高，可同時對上百種農(nóng)藥進(jìn)行快速定性、定量檢測，比單級四級桿有更高的靈敏度和抗干擾能力，在農(nóng)殘檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。固相萃取法(SPE)作為新型樣品處理技術(shù)，具有簡單、快速、試劑消耗小、成本低等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留分析［5–8］。筆者針對香港《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》中茶葉重點監(jiān)控的農(nóng)殘檢測項目，用乙腈均質(zhì)提取茶葉樣品，經(jīng)石墨化碳固相萃取小柱凈化，采用GC–MS–MS法測定，實現(xiàn)了茶葉中9種農(nóng)藥殘留量的快速測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜／質(zhì)譜聯(lián)用儀：Varian 300型，美國瓦里安公司；

真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：LABOROTA 4003型，德國海道夫公司；

全自動均質(zhì)儀：Autogizer 1型，美國Tomtec公司；

乙腈、丙酮、正己烷：色譜純，美國Tedia公司；

無水硫酸鈉：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙酰甲胺磷、莠滅凈、二嗪磷、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、殺撲磷、丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于90%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

石墨化碳黑固相萃取柱：0.5 g，6 mL，美國安捷倫公司；

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB–5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：100℃保持1 min，以20℃／min升溫至300℃，保持5 min；載氣：氦氣，純度不小于99.999 %，流量為1.0 mL／min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣體積：1 μL；不分流進(jìn)樣；GC–MS–MS接口溫度：280℃。

1.2.2 質(zhì)譜條件

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），每種化合物分別選擇一個母離子，2個子離子，每組所有需要檢測的離子按照出峰順序，分時段分別檢測；電離方式：電子轟擊離子源(EI)，70 eV；離子源溫度：250℃；循環(huán)時間：0.2 s；色譜過濾峰寬：3.0 s；碰撞氣：氬氣，純度不低于99.999%；碰撞氣壓力：0.2 Pa。

9種化合物的保留時間、定性離子對、定量離子對、碰撞能量見表1。

表1 9種農(nóng)藥的保留時間、定量離子、定性離子、碰撞能量

1.3 樣品預(yù)處理

取有代表性的茶葉樣品500 g，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過0.83 mm(20目)篩，混勻，均分成兩份作為試樣，分裝入潔凈的容器內(nèi)，密封并標(biāo)記。制存樣過程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。試樣于常溫下保存。

稱取1.0 g (精確至0.01 g)試樣于50 mL具塞聚四氟乙烯離心試管中，加入10 mL乙腈，以15 000 r／min轉(zhuǎn)速均質(zhì)提取2 min，再以6 000 r／min離心3 min，將上層清液轉(zhuǎn)移至100 mL雞心瓶中。殘渣用10 mL乙腈重復(fù)均質(zhì)提取一次，離心后，取上層清液，合并兩次提取液于同一100 mL雞心瓶中，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL丙酮–正己烷溶液（體積比為1∶1，下同）溶解殘渣，待凈化。將石墨化碳黑固相萃取柱置于固相萃取裝置上，在柱中加入2 cm高的無水硫酸鈉，依次用3 mL丙酮、6 mL丙酮–正己烷溶液（1∶1）預(yù)淋洗，棄去淋洗液，當(dāng)液面到達(dá)無水硫酸鈉層頂部時，將以上得到的試樣提取液轉(zhuǎn)入石墨化碳黑固相萃取柱中，然后用12 mL丙酮–正己烷溶液（1∶1）洗滌雞心瓶，并將洗滌液全部加到石墨化碳黑固相萃取柱中，收集全部流出液于20 mL刻度離心管中，在40℃下用平緩氮氣流吹至近干，用丙酮溶解并定容至1.0 mL，供GC–MS–MS 測定。同樣做基質(zhì)空白溶液并測定。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.1 mg）乙酰甲胺磷、莠滅凈、二嗪磷、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、殺撲磷和丙溴磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為1 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在0～4℃避光保存。

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確吸取乙酰甲胺磷、莠滅凈、二嗪磷、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、殺撲磷和丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1.0 mL于100 mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解并定容至標(biāo)線，配制成質(zhì)量濃度均為10 μg／mL的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于0～4℃避光保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取一定體積的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用基質(zhì)空白溶液逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為10，20，50，100，200，500 μg／L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取溶劑的選擇

食品中農(nóng)殘分析需要在復(fù)雜基質(zhì)中對目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性提取、富集和分離，特別是在多組分殘留分析中，目標(biāo)農(nóng)藥品種不同，物理化學(xué)性質(zhì)存在差異，選擇合適的提取溶劑往往在分析中起著重要作用。在選擇萃取溶劑時，不僅要考慮目標(biāo)分析物在溶劑中的溶解度、溶劑與基質(zhì)的浸透效果，還需考慮不同萃取溶劑對萃取效率的影響。目前，提取溶劑主要有丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙腈和正己烷等及其混合溶劑［10］。實驗表明，用丙酮和甲醇對大多數(shù)農(nóng)殘的提取效果好，但同時提取的雜質(zhì)多，給后續(xù)凈化操作帶來難度；二氯甲烷和正己烷對茶葉組織滲透力不夠，難以將極性農(nóng)藥從植物組織中完全萃取出來，提取效率較低；用乙腈提取，組織滲透力強(qiáng)，極性大小較合適，對大多數(shù)農(nóng)藥有較高提取效率，同時色素和其它弱極性雜質(zhì)提取較少，已在食品多農(nóng)殘分析中被廣泛采用。因此本實驗采用乙腈作為提取溶劑。

2.2 萃取方式的選擇

常用的樣品提取方法有液液萃取法［11，13］、均質(zhì)提取法［4–5，14，16］、超聲提取法［15］和固相萃取法［8–9，12］等。試驗對比振蕩提取、超聲提取、均質(zhì)提取等3種提取方法的提取效率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，茶葉樣品采用振蕩和超聲提取對目標(biāo)農(nóng)藥中極性較大的農(nóng)藥的提取效率高，但是對于極性弱的六六六等農(nóng)藥提取效率較低，而采用高速均質(zhì)提取對絕大多數(shù)農(nóng)藥都可完全提取，故本實驗選擇均質(zhì)提取法。

圖1 不同提取方式下農(nóng)藥的提取回收率

2.3 固相萃取凈化條件的選擇

茶葉中含有大量的色素、生物堿、多酚類、氨基酸等雜質(zhì)，給樣品凈化操作帶來一定的難度。農(nóng)殘分析樣品凈化方法主要有液–液分配法［3，7］、滲透凝膠色譜［9］和固相萃取法［4–8］等。液–液分配凈化是最簡單的傳統(tǒng)凈化方式，基于被測農(nóng)藥具有相似溶解特性的前提條件，不適用于化學(xué)性質(zhì)差異較大的多種農(nóng)藥殘留的提?。怀Ｒ?guī)凝膠滲透色譜（GPC）凈化更適合富含油脂的樣品，但存在儀器昂貴、耗時長和試劑成本高等問題；固相萃取柱凈化是現(xiàn)代農(nóng)藥殘留分析中新型的凈化技術(shù)，在食品農(nóng)殘分析檢測領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用［4–5，7–8］。對幾種農(nóng)殘分析中常用的固相萃取柱如石墨化碳、中性氧化鋁、弗羅里硅土、石墨化碳／氨基等的凈化效果進(jìn)行比較，實驗發(fā)現(xiàn)，石墨化碳、石墨化碳／氨基固相萃取柱的凈化效果都較好，但考慮到石墨化碳／氨基固相萃取柱成本相對較高，且洗脫試劑較復(fù)雜。故本實驗采用石墨化碳固相萃取柱。

2.4 氣相色譜–質(zhì)譜條件的選擇

通過反復(fù)調(diào)整進(jìn)樣口溫度、色譜柱溫度、載氣流速等氣相色譜關(guān)鍵參數(shù)，保證所有的樣品基質(zhì)中目標(biāo)農(nóng)藥有較好的分離度，盡量避免基質(zhì)干擾峰與目標(biāo)化合物保留時間的重疊，為提高分析效率，盡量縮短分析時間，最后得到合適的色譜柱程序升溫條件：于100 ℃保持1 min，然后以20℃／min程序升溫至300℃，保持5 min；色譜柱選用DB–5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25μm)進(jìn)行分離；載氣流速為1.0 mL／min。在優(yōu)化的氣相色譜條件下，采用Q3 SCAN全掃描方式得到各待測農(nóng)藥的質(zhì)譜圖，然后選取2～3個相對豐度較高、質(zhì)荷比較大及相同掃描時間段其它農(nóng)藥及無背景干擾的離子作為母離子、子離子對，再將各農(nóng)藥成分的掃描分時間段，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，以保證檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。9種農(nóng)藥的保留時間和MRM離子參數(shù)見表1，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的MRM總離子流圖見圖2。 2.5 方法的線性和檢出限

圖2 9種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM總離子流圖

茶葉成分較復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)較明顯，為補(bǔ)償樣品基質(zhì)對定量分析的影響，采用基質(zhì)匹配校準(zhǔn)混合溶液及建立基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。取1.4制備的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測定，以各自定量離子對的峰面積（y）對質(zhì)量濃度(x，μg／L)作基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和線性回歸分析，得到各農(nóng)藥的線性方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。由表2可知，在10～500 μg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，9種農(nóng)藥的基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)r2均大于0.998，線性關(guān)系良好。用茶葉空白基質(zhì)樣液逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比S／N=10確定各組分的測定下限，結(jié)果見表2。由表2可知，本方法的靈敏度滿足香港地區(qū)規(guī)例對茶葉中目標(biāo)農(nóng)藥的最新殘留限量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 9種農(nóng)藥的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)及測定下限

2.6 方法的回收率和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在不含檢測目標(biāo)物的空白茶葉樣品中分別添加0.05，0.1，0.2 mg／kg 3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，在添加溶液與樣品充分浸潤混勻，溶劑揮發(fā)完全后進(jìn)行測試，每個水平重復(fù)6次，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。紅茶空白樣品、紅茶加標(biāo)樣品的MRM總離子流色譜圖見圖3，實驗結(jié)果見表3。

圖3 樣品的MRM總離子流圖

表3 茶葉樣品加標(biāo)回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

由表3可知，9種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率為73.6%～99.7%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%～8.7% (n=6)，各技術(shù)指標(biāo)滿足多農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。

3 結(jié)語

通過對茶葉樣品進(jìn)行均質(zhì)萃取、固相萃取凈化等樣品前處理，建立了茶葉中9種農(nóng)藥殘留量的氣相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高，可滿足出口茶葉中多種農(nóng)藥殘留日常檢測工作需要。

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Determination of Nine Pesticides Residues in Tea by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

Yan Hongfei, Wang Meiling, Chen Lian, Lyu Xiaoyuan, Dai Jieyun
(Hunan Entry–Exit Inspection and Quarantine Bureau, State Key Laboratory of Food Safety Testing, Changsha 410004, China)

A gas chromatography–tandem mass spectrometry(GC–MS–MS) method was developed for simultaneous determination of nine pesticides residues in tea. The samples were extracted with acetonitrile and cleaned up using solid phase extraction. After separated on DB–5MS capillary column，the target analytes were detected by GC–MS–MS under the multi reaction monitoring mode and quantified by the external standard method. The correlation coefficents (r2) of nine pesticides were more than 0.998 obtained within the concentration range of 0.01 to 0.5 mg／L. The limits of quantitation varied from 0.002 to 0.01 mg／kg. At three spiked levels of 0.05, 0.1, 0.2 mg／kg in blank tea, the average recoveries ranged from 73.6% to 99.7% and the relative standard deviations were from 4.2% to 8.7% (n=6). The method is easy to operate and fast, and it is suitbale for determination of pesticides residues in tea.

solid phase extraction; gas chromatography–tandem mass spectrometry; tea; pesticides residues

O657.7

A

1008–6145(2016)06–0062–05

10.3969／j.issn.1008–6145.2016.06.015

*湖南省科技計劃項目(2015JC3128)

聯(lián)系人：顏鴻飛；E-mail: yanhf@hnciq.gov.cn

2016–10–17