細(xì)胞工廠培養(yǎng)禽流感（H9亞型）病毒試驗(yàn)研究

高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

細(xì)胞工廠培養(yǎng)禽流感（H9亞型）病毒試驗(yàn)研究

高英

（遼寧省北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

禽流行性感冒（簡(jiǎn)稱禽流感，Avain Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)（包括家禽和野禽）的感染和或疾病綜合征，主要引起禽類(lèi)的全身性或呼吸系統(tǒng)性疾病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織確立為A類(lèi)傳染病。對(duì)各國(guó)養(yǎng)禽業(yè)危害很大。

我國(guó)通常用雞胚培養(yǎng)禽流感病毒（AIV）來(lái)生產(chǎn)AI疫苗，由于雞胚培養(yǎng)病毒存在諸多缺點(diǎn)，我們進(jìn)行了用細(xì)胞培養(yǎng)（AIV）的試驗(yàn)研究，主要用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)增殖培養(yǎng)（AIV）對(duì)比試驗(yàn)和細(xì)胞工廠培養(yǎng)（AIV）的工藝優(yōu)化試驗(yàn)，取得了很好的效果。

1 材料與方法

1.1 毒 株

H9N2亞型禽流感病毒，由本單位分離并鑒定。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，進(jìn)口胎牛血清由購(gòu)自Hyclone，胰酶購(gòu)自Washington公司，Nunc EasyFill細(xì)胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL）購(gòu)自Thermo Fisher。

1.3 細(xì)胞及傳代培養(yǎng)

細(xì)胞：MDCK細(xì)胞來(lái)自哈爾濱獸醫(yī)研究所，在本實(shí)驗(yàn)室已擴(kuò)增凍存，目前在本實(shí)驗(yàn)室傳至75代，已經(jīng)適應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

細(xì)胞傳代的方法：首先復(fù)蘇所選擇的種細(xì)胞MDCK到T75的細(xì)胞瓶中，生長(zhǎng)48h左右，按照1:4的比例進(jìn)行傳代；然后把6個(gè)長(zhǎng)滿細(xì)胞的T75細(xì)胞瓶中的細(xì)胞傳到1個(gè)10L轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行培養(yǎng)；48h左右按照1:3的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)；該過(guò)程中使用的培養(yǎng)基為DMEM，血清為胎牛血清，使用量為10%。

收獲轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞：將轉(zhuǎn)瓶中所得細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后加入濃度為0.25%胰酶-EDTA溶液125mL消化，收集細(xì)胞。

收獲得細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)后，采用Thermo Scientific Nunc細(xì)胞工廠（10層，培養(yǎng)面積6320cm2，工作容量2000mL)對(duì)MDCK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；所用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基。所用其它試劑包括牛血清、TPCK-胰酶等。細(xì)胞接種后在12h、24h、48h取樣觀察細(xì)胞在細(xì)胞工廠上的生長(zhǎng)狀況。

1.4 AIV在細(xì)胞工廠中增殖的條件優(yōu)化

為了闡明細(xì)胞密度、病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）和BSA濃度對(duì)AIV病毒增殖的影響，采用多因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考慮 MOI （0.1、1）、細(xì)胞密度（0.5×105細(xì)胞/mL，1.0×105細(xì)胞/mL）和BSA濃度（0.5%、1%）3個(gè)水平試驗(yàn)因素，在各水平條件下以組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）和血凝價(jià)（HA）作為觀測(cè)指標(biāo)，確認(rèn)AIV病毒滴度在不同增殖條件下的差異。

1.5 收 獲

培養(yǎng)至80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）時(shí)，收獲。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞面積比較結(jié)果

表1 細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)面積比較

2.2 AIV在細(xì)胞工廠中增殖條件優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)表2可以看出病毒繁殖效果最差的是4組，在該條件下最大的HA為128，而在1組合2組中，病毒HA最大達(dá)到了1024，效果相同，其中2組TCID50優(yōu)于1組，達(dá)到了4.78×107TCID50/mL。

因此，病毒繁殖的條件為：細(xì)胞密度優(yōu)選5～10萬(wàn)細(xì)胞/mL，H9N2亞型AIV種毒按MOI=1進(jìn)行接種，病毒維持液為不含血清的DMEM（1%BSA和2μg/mL的TPCK-胰酶），放入38℃溫室培養(yǎng)48～72h。

3 小結(jié)

通過(guò)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)的H9亞型（AIV）具有較高的免疫原性，批量生產(chǎn)大，降低生產(chǎn)成本，適合大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)AI疫苗。

表2 AIV在細(xì)胞工廠中增殖條件優(yōu)化結(jié)果

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.017