羊傳染性膿皰病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

李海利,孫婷婷,辛?xí)粤?徐引弟,朱文豪,王克領(lǐng)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

羊傳染性膿皰病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

李海利1,孫婷婷2,辛?xí)粤?,徐引弟1,朱文豪1,王克領(lǐng)1

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002; 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

根據(jù)羊傳染性膿皰病毒GeneBank基因序列,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物。通過對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化,敏感性及特異性試驗(yàn),成功建立了用于檢測羊傳染性膿皰病毒DNA的PCR檢測方法。該方法成功擴(kuò)增出390 bp的目的基因片段,敏感性試驗(yàn)證明可以檢測出320×10-2ng/ L的DNA。特異性試驗(yàn)羊痘病毒、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒均未擴(kuò)增出相應(yīng)片段。重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)3份羊傳染性膿皰病毒陽性病料進(jìn)行檢測,結(jié)果均為陽性。臨床應(yīng)用對(duì)臨床送檢的16份疑似羊傳染性膿皰病毒感染病料用上述建立優(yōu)化的PCR方法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,9份為陽性,陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后進(jìn)行序列分析顯示均為羊傳染性膿皰病毒。證明該方法具有良好的敏感性和特異性,可以用于臨床診斷。

羊傳染性膿皰病毒;PCR;檢測

羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma,CE)是由羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma Virus)引起的一種山羊、綿羊的接觸性、病毒性、嗜上皮性人畜共患傳染病,本病也稱為羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎,俗稱羊口瘡(Or f)［1]。本病最早發(fā)現(xiàn)于歐洲,目前,世界各地所有養(yǎng)羊的地區(qū)都存在本病,我國新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、陜西、西藏、四川、云南等省區(qū)也有本病流行［2]。本病嚴(yán)重危害山羊和綿羊,綿羊、山羊可相互傳染,而且人、駱駝、貓和海豹也可感染本?。?]。本病呈地方流行,對(duì)于首次發(fā)病羊群,幼齡羊和成年羊均可感染,而常發(fā)地區(qū)的羊群,以3～6月齡羔羊發(fā)病最多［4]。本病的病原為痘病毒科副痘病毒屬,病毒核酸為雙股DNA,大小為130～150 kb,G+C含量約為64%［5-6]。本病的臨床癥狀表現(xiàn)為患羊嘴角及口腔出現(xiàn)紅斑、腫脹,繼而形成水皰、膿皰、潰瘍破裂,最后形成較厚的灰褐色痂皮,有時(shí)還表現(xiàn)為羔羊發(fā)育受阻,體溫正?；蛏杂猩?人可通過與病羊接觸引發(fā)感染［7-9]。敏感羊群發(fā)病率很高,通?？蛇_(dá)到90%,病死率達(dá)1%～25%,本病有化膿菌和壞死桿菌等繼發(fā)感染,死亡率達(dá)50%。同時(shí)近年來隨著全國各地肉羊產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展,該病呈暴發(fā)趨勢,給養(yǎng)羊業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前,可通過臨床癥狀、流行病學(xué)調(diào)查對(duì)本病作出初步診斷,并通過實(shí)驗(yàn)室檢查確診,通過采取病羊的水皰液,病死羊的口唇部、皮膚、內(nèi)臟制成病理組織切片。試驗(yàn)方法如電子顯微鏡檢查、病毒分離、動(dòng)物接種試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫電泳、P C R方法、核酸探針法等［10-11]。有國外學(xué)者采用P C R方法,特異性和敏感性較高［12]。常規(guī)的病原分離和血清學(xué)檢測方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長、敏感性低、易受不確定因素如病毒毒價(jià)的準(zhǔn)確性、細(xì)胞量的多少及生長情況、病毒血清孵育時(shí)間長短影響等缺點(diǎn)［13]。由于羊傳染性膿皰的臨床癥狀與羊痘、口蹄疫臨床癥狀相似,且易繼發(fā)化膿菌和壞死桿菌感染,增加了臨床診斷的難度,因此本試驗(yàn)建立了一種簡便快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、敏感度高的P C R檢測方法,對(duì)快速、有效檢測羊傳染性膿皰病毒具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 原材料試驗(yàn)所用的羊傳染性膿皰病毒(Contagious Ecthyma Virus,CEV)及對(duì)照所用的羊痘病毒(Capri Pox Virus,CPV)、山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(Caprine arthritis-encephalitis Virus, CAE)均由河南省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑主要試劑:Ex Taq(5 U/μL)購自TaKaRa公司,2×Taq Mix Maste r(含染料)購自上海萊楓科技有限公司,病毒基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)有限公司,引物Forward Primer(10μm),Reverse Primer(10μm)由上海生物工程有限公司合成,DL 2000 DNA Marker購自TaKaRa公司,瓊脂糖購自BIOWEST公司,1%瓊脂糖凝膠:稱取0.5 g瓊脂糖溶于50 mL 1×TAE電泳緩沖液,溶化后加入5μL染色劑,50×TAE(T r is-乙酸):24.2 g Tris堿,冰乙酸10 mL,0.5 MEDTA (p H 8.0),加三蒸水定容至100 mL,工作液為1× TAE。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GeneBank中CE (K X579064.1)全基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,引物序列為P1(上游引物):5、-CCTACTTCTCGGAGTTCAGC-3、;P2 (下游引物):5、-GCAGCACTTCTCCTCGTAG-3、;預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段390 bp,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA DNA的提取按照Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行操作,提取的DNA保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR 反應(yīng)

1.5.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1.1 最適模板用量的確立分別取1、2、3、4、5、6μL DNA模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),以確定最適的模板用量。

1.5.1.2 最適引物用量的確立分別取不同用量的引物在50μL的反應(yīng)體系中,上、下游引物分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.2μL進(jìn)行P C R擴(kuò)增反應(yīng),以確定最適的引物用量。

1.5.1.3 最適變性溫度的確立分別在92、93、94、95、96℃下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以確定最適的變性溫度。

1.5.1.4 最適退火溫度的確立分別在51、53、55、57、59℃下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),以確定最適的退火溫度。

1.5.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR反應(yīng)在50μL反應(yīng)體系中進(jìn)行,引物Forward Primer 1μL,Reverse Primer 1μL,DNA模板各9 μL,2×Taq Mix Master(含染料)25μL,DEPC水14 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min,4℃保存。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳測定,以1×TAE配成50 mL 1%瓊脂糖凝膠,膠內(nèi)加入染色劑5μL,每份PCR樣品取5μL,在90～110 V電泳30 min,于G T-1凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.6 PCR PCR特異性試驗(yàn)分別取同體積的羊傳染性膿皰病毒、羊痘病毒的DNA、山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒、健康的羊皮組織及ddH2O,山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒先反轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR反應(yīng), ddH2O作為陰性對(duì)照,以確定建立的PCR反應(yīng)特異性。

1.7 PCR PCR敏感性試驗(yàn)將提取的羊傳染性膿皰病毒核酸用蛋白質(zhì)核酸測定儀測定核酸濃度為320 ng/ μL,將DNA進(jìn)行10倍系列稀釋第1～8孔,其濃度依次為320 ng/μL,320×10-1ng/μ L DNA,320× 10-2ng/μL DNA,320×10-3ng/μL DNA,320× 10-4ng/μL DNA,320×10-5ng/μL DNA,320× 10-6ng/μL DNA,320×10-7ng/μL DNA。以上述濃度體系為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測定其敏感性。

1.8 PCR PCR重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)用建立的PCR檢測方法,對(duì)羊傳染性膿皰病毒3份陽性病料和3份陰性病料,重復(fù)檢測3次,以驗(yàn)證建立的PCR檢測方法的穩(wěn)定性。

1.9 臨床應(yīng)用用建立優(yōu)化的PCR檢測方法,對(duì)臨床送檢的16份疑似羊傳染性膿皰病毒病料先提取DNA,應(yīng)用PCR優(yōu)化條件進(jìn)行檢測。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electro phoresis of the PCR products

圖2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specific test results of PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定在G I-1凝膠成像儀上觀察,結(jié)果顯示,該P(yáng)CR體系可以擴(kuò)增出一條約為390 b p的羊傳染性膿皰病毒的基因片段(圖1)。PCR產(chǎn)物應(yīng)經(jīng)切膠純化、克隆、測序,證明是該病毒的DNA。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果提取羊傳染性膿皰病毒、羊痘病毒核酸,應(yīng)用試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物,以他們的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,只有羊傳染性膿皰病毒能擴(kuò)增出約390 b p的條帶,而其他病毒、健康羊皮組織和ddH2O均未擴(kuò)增出目的條帶。說明建立的PCR檢測方法具有良好的特異性,設(shè)計(jì)的引物與羊痘病毒、山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒核酸不能發(fā)生特異性結(jié)合(圖2)。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將模板DNA經(jīng)10倍系列稀釋后濃度分別為320 ng/μL,320×10-1ng/μL DNA, 320×10-2ng/μL DNA,320×10-3ng/μL DNA, 320×10-4ng/μL DNA,320×10-5ng/μL DNA, 320×10-6ng/μL DNA,320×10-7ng/μL DNA。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在濃度3.2×10-3ng/μL時(shí)仍出現(xiàn)目的片段,而在濃度3.2×10-4ng/μL時(shí)不出現(xiàn)目的片段,可檢測出濃度320×10-2ng/μL的模板,結(jié)果見圖3。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用優(yōu)化的PCR方法檢測羊傳染性膿皰病毒3份陽性病料和3份陰性病料,并重復(fù)檢測3次DNA樣品,檢測結(jié)果均一致,證明建立優(yōu)化的PCR方法穩(wěn)定性良好。

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

2.5 臨床應(yīng)用對(duì)臨床送檢的16份疑似感染羊傳染性膿皰病毒的動(dòng)物取干痂加P BS緩沖液研磨10 min,用建立優(yōu)化的PCR檢測方法檢測,發(fā)現(xiàn)有9份陽性、7份陰性。對(duì)陽性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列分析,顯示均為羊傳染性膿皰病毒,如圖4。

3 討論

羊傳染性膿皰病毒是發(fā)生在綿羊、山羊身上的一種常見病,雖然發(fā)病率高,但病死率低,然而反復(fù)發(fā)作,給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本病的防控與羊場的管理關(guān)系較大,做好羊場的衛(wèi)生消毒工作,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,提高動(dòng)物的抗病力,將健康羊與病羊隔離飼養(yǎng),在養(yǎng)殖場具體實(shí)施免疫接種、藥物預(yù)防、消毒、隔離等綜合措施［14],可降低本病的發(fā)病率。由于本病的臨床癥狀輕微,患羊口唇起水皰、膿皰、結(jié)痂,最后脫落,不易引起飼養(yǎng)人員的重視,采取的治療措施只是在患病處涂抹2%紫藥水,沒有真正消滅病原,幾天后雖然癥狀消失,但過一段時(shí)間會(huì)復(fù)發(fā)本病。

羊傳染性膿皰病毒與羊痘病毒、口蹄疫病毒在臨床上癥狀相似,且本病易繼發(fā)化膿菌和壞死桿菌感染,在臨床診斷上難以鑒別,易導(dǎo)致誤診,選錯(cuò)治療方法,耗時(shí)耗力。羊傳染性膿皰病,綿羊、山羊均可發(fā)病,發(fā)病后無體溫升高等全身癥狀。本試驗(yàn)采用PCR檢測方法,引物的選擇是影響PCR成功的一個(gè)關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)根據(jù)GeneBank公布CEV基因序列,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,以CEV的DNA能擴(kuò)增出390 bp的目的基因片段,而羊痘病毒、山羊病毒性關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒DNA均不能擴(kuò)增出目的條帶,該P(yáng)CR檢測方法具有良好的特異性和敏感性,敏感性試驗(yàn)表明可檢測出320×10-2ng/μL的病毒液。

圖4 臨床樣品的PCR檢測結(jié)果Fig.4 The result of clinical samples detected by PCR

該P(yáng)CR檢測方法與病毒分離和血清中和試驗(yàn)相比,具有良好的優(yōu)越性,血凝、補(bǔ)反、凝集等常規(guī)試驗(yàn)方法均無法檢測羊傳染性膿皰病毒,可能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)或交叉反應(yīng)［15]。與中和試驗(yàn)相比, ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))快速、簡便、敏感,易于標(biāo)準(zhǔn)化［16-17],對(duì)流免疫電泳具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)［18]。應(yīng)用DNA雜交技術(shù)檢測CEV DNA的方法,用放射性同位素32P標(biāo)記CEV DNA探針,對(duì)CEV DNA片段進(jìn)行診斷和檢測［19-20]。由于電子顯微鏡價(jià)格昂貴,病原分離培養(yǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力,血清中和試驗(yàn)易受不確定因素的影響。應(yīng)用PCR檢測方法診斷羊傳染性膿皰,操作簡便,只需2.5 h。應(yīng)用PCR檢測方法對(duì)臨床病料檢測的檢出率可達(dá)到56%,檢出率高,不僅節(jié)省了開支,而且大大縮短了檢測時(shí)間,可保證臨床病料的及時(shí)確診。

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Establishment and Application of PCR Detection Method to Contagious Ecthyma Virus

Li Haili1,Sun Tingting 2,Xin Xiaoling1,Xu Yindi1,Zhu Wenhao1,Wang Keling1
(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Henan Zheng zhou 450002; 2.College of animal husbandry and medical engineering,Henan Agricultural University,Henan Zheng zhou 450002)

According to the gene sequence of Gene Bank of contagious ecthyma virus(CEV),a pair of primers were designed.The PCR test to detect CEV was successfully established.By the optimization of PCR reaction conditions,a 390 bp fragments was amplified.The sensitivity of the assay can be up to 320×10-2ng/μL.This method is specific,it can distinguish contagious ecthyma virus from sheep pox virus and caprine arthritis encephalitis virus.Repeatability test in three suspicious-positive diseases of sheep contagious ecthyma for testing,the results were positive. Clinical application of the 16 suspected contagious ecthyma disease samples which were infected, showed 9 positive results.After cloning and analyzing sequence of the positive samples' PCR amplification product,it showed that all infected with CEV.The method has good sensitivity,specificity,and it can be used for clinical diagnosis.

Contagious Ecthyma Virus(CEV);P C R;Detection

S852.65

B

1672-9692(2016)10-0001-06

2016-07-17

李海利(1982-),男,河南省開封人,助理研究員,博士,主要從事獸醫(yī)傳染病防控研究工作。

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金。