羊肚菌A1菌株菌絲體的培養(yǎng)特性*

周潔，譚偉**，曹雪蓮，2，苗人云，2，彭衛(wèi)紅，黃忠乾，甘炳成

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌類有限責任公司，四川成都610066）

羊肚菌A1菌株菌絲體的培養(yǎng)特性*

周潔1，譚偉1**，曹雪蓮1，2，苗人云1，2，彭衛(wèi)紅1，黃忠乾1，甘炳成1

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌類有限責任公司，四川成都610066）

設(shè)計8種碳源、8種氮源、6個梯度溫度和8個梯度pH值的試驗，對羊肚菌（Morchella importuna）A1菌株進行培養(yǎng)，觀察其菌落菌絲體生長勢和測定菌絲生長速度，比較分析其菌絲體最適培養(yǎng)特性。試驗結(jié)果表明，羊肚菌A1菌株菌絲體培養(yǎng)的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，最適氮源為蛋白胨和(NH4)2SO4，最適溫度為15℃～25℃，最適pH值為4.5～5.5。

羊肚菌；菌絲體；碳源；氮源；溫度；pH值；生長勢；生長速度

羊肚菌（Morchella spp.）又名陽雀菌、羊肚菜等，是羊肚菌科羊肚菌屬所有種類的總稱，隸屬于菌物界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌亞綱（Pezizomycetidae）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella）。羊肚菌營養(yǎng)豐富，味道鮮美，歐洲人認為是僅次于塊菌的美味食用菌，美國人視為“陸地之魚”[1]。羊肚菌又是重要的藥用菌，傳統(tǒng)中醫(yī)學認為，羊肚菌能益腸胃，化痰理氣，治療消化不良、痰多氣短[2]。

國內(nèi)外諸多科技工作者開展羊肚菌研究工作已有100多年的歷史，并致力于能夠?qū)崿F(xiàn)羊肚菌商業(yè)化栽培，但栽培試驗尤其是商業(yè)化栽培成功的報道并不多見。筆者所在四川省農(nóng)業(yè)科學院微生物研究室和金地菌類公司合作，近幾年已經(jīng)成功地在室外大田實現(xiàn)羊肚菌栽培，但是，仍然覺得存在著重現(xiàn)性不甚理想的情況，需要深入了解羊肚菌生物學特性，以提高其栽培穩(wěn)定性。

黃年來[3]介紹了國外學者T.N.Kaul等的羊肚菌培養(yǎng)特性。陳慧群（1995）[4]，王秀云（1998）[5]，董愛榮、桂明英、張松（2002）[6-8]，努爾古麗·阿布都熱合曼、趙春燕、陳芳草（2004）[9-11]、彭璐、任桂梅（2006）[12-13]、柴林山（2010）[14]、朱永真（2011）[15]、謝放（2014）[16]等先后對羊肚菌的生物學特性或生態(tài)特性做了試驗研究。筆者對本研究所微生物研究室采集、分離和保存的羊肚菌A1菌株進行了菌絲體培養(yǎng)的試驗研究，以深入了解其菌絲體生長特性。

1　材料和方法

1.1供試菌株

供試羊肚菌菌株A1菌株（Morchella importuna M.Kuo,O'Donnell&T.J.Volk），來源于四川省農(nóng)科院土壤肥料研究所微生物研究室。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL。該培養(yǎng)基用于活化菌株。

1.2.2葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基

葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、維生素B110 mg、瓊脂25 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3試驗處理設(shè)計

1.3.1碳源試驗

將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基作為碳源試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以20 g的阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇、蔗糖、麥芽糖和淀粉7種碳源，替換碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中的20 g葡萄糖，同時，以不加碳源設(shè)置對照（CK），制作成9種培養(yǎng)基（含CK），即共設(shè)計成9個處理的碳源試驗，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2氮源試驗

將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基作為氮源試驗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以2 g的KNO3、NaNO2、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、麥芽浸粉和天冬酰胺7種碳源，替換氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中的2 g蛋白胨，同時，以不加氮源設(shè)置對照（CK），分別制作成9種平板培養(yǎng)基，即共設(shè)計成9個處理（含CK）的氮源試驗，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3溫度試驗

使用1.2.2葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，分別在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共6個溫度條件下培養(yǎng)供試菌株，即共設(shè)計成6個處理的溫度試驗，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3.4pH試驗

采用0.1 mol·L-1檸檬酸、0.2 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖液和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，分別將1.2.2葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的培養(yǎng)基，共計8種培養(yǎng)基，即共設(shè)計成8個處理的pH值試驗，每個處理3次重復(fù)。

1.4試驗方法

1.4.1使用平板培養(yǎng)基

1.3中碳源、氮源、溫度和pH值試驗的培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制作，各個試驗用培養(yǎng)基均勻地分裝于直徑9 cm規(guī)格的平皿中進行試驗。

1.4.2試驗觀測方法

無菌操作，將A1菌株種塊接種于平板培養(yǎng)基表面正中央位置，之后在（25±1）℃培養(yǎng)箱（溫度試驗按照設(shè)計溫度梯度進行）中避光培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。

觀察A1菌株在各個試驗處理上的菌落生長勢，主要觀察菌絲生長濃密程度和菌絲爬壁力情況。

測定菌絲生長速度，菌株菌絲生長速度以菌落生長半徑來表示（即菌絲體在平板培養(yǎng)基上直線生長的有效距離）。

菌落半徑的測定：在裝有培養(yǎng)基的平皿外表面，以中心為基點畫兩條垂直直線，沿直線方向測量從接種塊邊緣至菌落邊緣的距離，即菌落生長半徑長度。

1.5數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1碳源對菌絲生長的影響

羊肚菌A1菌株在供試9種碳源培養(yǎng)基上的培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，其菌絲都能夠生長，但濃密程度、爬壁能力有差異。菌絲生長的濃密程度：除了不添加碳源培養(yǎng)基（CK）上的菌絲生長表現(xiàn)為較濃密之外，其余碳源培養(yǎng)基上菌絲生長都濃密；菌絲生長的爬壁能力：在葡萄糖、CK和麥芽糖培養(yǎng)基上菌絲生長的爬壁力較強，在阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇和蔗糖培養(yǎng)基上菌絲生長的爬壁力強，在淀粉培養(yǎng)基上菌絲生長的爬壁力很強。而且還觀察到在阿拉伯糖、甘露糖和淀粉培養(yǎng)基上菌絲生長有變銹色情況發(fā)生。雖然本研究用的阿拉伯糖碳源培養(yǎng)基本身有顏色，但是阿拉伯糖培養(yǎng)基上的菌絲面顏色最深（圖1、表1）。結(jié)果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

圖1　羊肚菌A1菌株在不同碳源培養(yǎng)基上菌絲生長勢Fig.1Growth vigour of tested stain mycelium in different carbon sources

表1　不同碳源對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.1Effect of different carbon sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表1試驗結(jié)果數(shù)據(jù)可知，羊肚菌A1菌株在供試9種碳源培養(yǎng)基上的菌絲生長速度范圍為11.9 mm·d-1～15.6 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為蔗糖（11.9 mm·d-1）＜CK（13.4 mm·d-1）＜葡萄糖（13.7 mm·d-1）＜麥芽糖（14.1 mm·d-1）＜淀粉（14.4 mm·d-1）＜丙三醇（14.6 mm·d-1）＜阿拉伯糖（15.5 mm·d-1）=乳糖（15.5 mm·d-1）＜甘露醇（15.6 mm·d-1），在蔗糖培養(yǎng)基上菌絲生長最慢（11.9 mm·d-1），在甘露醇培養(yǎng)基上菌絲生長最快（15.6 mm·d-1）。其中，甘露醇、阿拉伯糖和乳糖培養(yǎng)基的菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它碳源培養(yǎng)基的菌絲生長速度間達到極顯著差異。試驗結(jié)果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長速度有不同程度的影響。相比之下，含有甘露醇和阿拉伯糖2種碳源的培養(yǎng)基是其菌絲生長速度最快的培養(yǎng)基，加之，這兩種碳源培養(yǎng)基上菌株菌絲生長勢好（菌絲生長濃密、爬壁力強），因此認為，甘露醇和阿拉伯糖這兩種碳源是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適碳源。

2.2氮源對菌絲生長的影響

羊肚菌A1菌株在供試9種氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，其菌絲都能夠生長，但是，觀察到其菌絲生長的濃密程度和爬壁能力有差異。其中，在尿素培養(yǎng)基上菌絲生長很濃密和爬壁力很強，而且菌絲生長變?yōu)榈匿P色面大（圖2、表2）。結(jié)果說明，不同氮源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

圖2　羊肚菌A1菌株在(NH4)2SO4、蛋白胨和尿素3種氮源培養(yǎng)基上菌絲生長勢Fig.2Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in(NH4)2SO4,peptone and urea

由表2可知，A1菌株在供試9種碳源培養(yǎng)基上的菌絲生長速度范圍為7.5 mm·d-1～15.5 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為尿素（7.5 mm·d-1）＜NaNO2（11.1 mm·d-1）＜NH4Cl（12.4 mm·d-1）＜KNO3（12.7 mm·d-1）＜天冬酰胺（13.7 mm·d-1）＜CK（14.6 mm·d-1）＜蛋白胨（14.8 mm·d-1）=麥芽浸粉（14.8 mm·d-1）＜（NH4）2SO4（15.5 mm·d-1），在尿素培養(yǎng)基上菌絲生長最慢（7.5 mm·d-1），在(NH4)2SO4培養(yǎng)基上菌絲生長最快（15.5 mm·d-1）。其中，在蛋白胨、麥芽浸粉、CK和(NH4)2SO4這四種氮源培養(yǎng)基上菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它氮源培養(yǎng)基的菌絲生長速度相比達到極顯著差異。試驗結(jié)果說明，不同氮源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長速度有不同程度的影響。相比之下，含有蛋白胨和(NH4)2SO4兩種氮源的培養(yǎng)基是其菌絲生長速度最快的培養(yǎng)基，加之，這兩種氮源培養(yǎng)基上菌絲生長勢好（菌絲生長濃密、爬壁力強）。這表明，蛋白胨和(NH4)2SO4兩種氮源是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適氮源。

2.3溫度對菌絲生長的影響

不同溫度對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響情況見表3。

表2　不同氮源對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.2Effect of different nitrogen sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表3　不同溫度對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.3Effect of different temperature on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表3可知，A1菌株在6個溫度梯度下培養(yǎng)，其菌絲生長速度范圍為3.5 mm·d-1～17.9 mm·d-1，菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為30℃（3.5 mm· d-1）＜10℃（5.0 mm·d-1）＜35℃（5.1 mm·d-1）＜15℃（11.6 mm·d-1）＜20℃（15.3 mm·d-1）＜25℃（17.9 mm·d-1），菌株在30℃溫度下菌絲生長速度最慢（3.5 mm·d-1），25℃溫度下菌絲生長速度最快（17.9 mm· d-1）。其中，20℃和25℃溫度下菌絲生長速度之間無極顯著差異，但與其它溫度梯度下菌絲生長速度相比達到極顯著差異。結(jié)果表明，溫度15℃～25℃是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適培養(yǎng)溫度。

2.4pH值對菌絲生長的影響

在pH值試驗中，隨著pH值上升培養(yǎng)基顏色也加深，所以本試驗中pH值7.5和8.0顯示的是培養(yǎng)基本身的顏色（圖3）。

圖3　羊肚菌A1菌株在不同pH值培養(yǎng)基上菌絲生長勢Fig.3Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in different pH

羊肚菌A1菌株在供試8個梯度pH值下培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，其菌絲都能夠生長，但是，觀察到其菌絲生長的濃密度及爬壁能力有所差異。在pH值5.0、6.0、6.5和7.0下菌絲變銹色（圖3、表4）。結(jié)果說明，不同碳源對羊肚菌A1菌株的菌絲生長勢有不同程度的影響。

由表4可見，A1菌株在8個pH值下培養(yǎng)，其菌絲生長速度范圍為1.1 mm·d-1～11.7 mm·d-1，其菌絲日均生長速度由慢至快順序依次為pH 8（1.1 mm·d-1）＜pH 7.5（4.8 mm·d-1）＜pH 7.0（8.1 mm·d-1）＜pH 6.5（9.2 mm·d-1）＜pH 6.0（10.5 mm·d-1）＜pH 5.0（11.3 mm·d-1）＜pH 5.5（11.4 mm·d-1）＜pH 4.5（11.7 mm·d-1），pH為8條件下菌絲生長速度最慢（1.1 mm·d-1），pH值4.5條件下菌絲生長速度最快（11.7 mm·d-1）。其中，pH值4.5、5.0和5.5條件下菌絲生長速度間無極顯著差異，但與其它pH值梯度下菌絲生長速度相比達到極顯著差異。結(jié)果表明，培養(yǎng)基pH值4.5～5.5是羊肚菌A1菌株菌絲生長的最適培養(yǎng)pH值。

表4　不同pH值對羊肚菌A1菌株菌絲生長的影響Tab.4Effect of different pH on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表5　幾種羊肚菌最適培養(yǎng)條件的比較Tab.5Comparison on optimal culture conditions of the Morchella

3　小結(jié)與討論

3.1羊肚菌A1菌株培養(yǎng)特性

本試驗結(jié)果表明，羊肚菌A1菌株菌絲體培養(yǎng)的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，最適氮源為蛋白胨和(NH4)2SO4，最適溫度為15℃～25℃，最適pH值為4.5～5.5。

3.2羊肚菌特性因菌株而異

筆者將本試驗研究結(jié)果與其他學者關(guān)于羊肚菌培養(yǎng)的主要研究結(jié)果進行比較（表5）認為，羊肚菌的培養(yǎng)特性因菌株不同而不同。這與廣義羊肚菌指羊肚菌屬[1]，屬內(nèi)有多個種，種中又有不同菌株密切相關(guān)。根據(jù)杜習慧等[17]文獻，目前已知羊肚菌屬有61個種，東亞或中國分布了該屬近一半的物種（30種），歐洲分布有23種，北美分布有19種。物種及種內(nèi)菌株的分布地域不同，菌株長期適應(yīng)當?shù)丨h(huán)境條件，形成了菌株自身的種性特點。

3.2.1最適碳源

本試驗結(jié)果表明供試菌株A1菌絲體培養(yǎng)的最適碳源為甘露醇和阿拉伯糖，與其他人的結(jié)果有所不同：如董愛榮研究的最適碳源為蔗糖[6]，張松和朱永真研究的最適碳源為淀粉[8，15]，陳芳草研究的最適碳源為葡萄糖、蔗糖[11]，趙春燕[10]、彭璐[12]、任桂梅[13]和柴林山[14]研究的最適碳源為葡萄糖，謝放[16]研究的最適碳源分別為葡萄糖、麥芽糖、淀粉（因菌株而異）。

3.2.2最適氮源

本試驗結(jié)果表明供試菌株A1菌絲體培養(yǎng)的最適氮源為蛋白胨和（NH4）2SO4。其中的蛋白胨結(jié)果與張松[8]、陳芳草[11]、彭璐[12]和謝放[16]等的結(jié)果相一致。

3.2.3最適溫度

本試驗結(jié)果表明供試菌株A1菌絲體培養(yǎng)的最適溫度為15℃～25℃。這與陳慧群[4]研究的22～24℃、趙春燕[10]研究的24℃相近，與王秀云[5]、董愛榮[6]、彭璐[12]、柴林山[14]和謝放[16]研究的25℃結(jié)果吻合，而與陳芳草[11]研究的15℃～20℃相同。

3.2.4最適pH

本試驗結(jié)果表明供試菌株A1菌絲體培養(yǎng)的最適pH值為4.5～5.5。這個結(jié)果的上限值pH值5.5與董愛榮[6]研究的pH值5.0～6.0和陳芳草[11]研究的pH值5.0～7.0的部分結(jié)果相同。與其他人的結(jié)果不一致，如陳慧群[4]研究的pH值7.0～7.5，王秀云[5]研究的pH值7.0，張松[8]研究的pH值6.0～7.0，趙春燕[10]和柴林山[14]研究的pH值7.5，謝放[16]研究的pH值6.0～8.0。

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Mycelium Cultivation Characteristics of Morchella importuna A1 strain

ZHOU Jie1,TAN Wei1,CAO Xue-lian1,2,MIAO Ren-yun1,2,PENG Wei-hong1, HUANG Zhong-qian1,GAN Bing-cheng1
(1.Soil and Fertilizer Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China; 2.Sichuan Jindi Fungus Co.Ltd.,Chengdu 610066,China)

Eight carbon sources,eight nitrogen sources,six gradient temperatures and eight pH to culture mycelium of Morchella importuna A1 strain were devised.The cultivation characteristics of growth vigour and growth rate were analyzed.The results revealed that the optimal cultural characteristics of A1 mycelium under the below condition were gained,such as mannitol and arabinose as the best carbon sources,peptone and(NH4)2SO4as the best nitrogen sources,temperature between 15℃to 25℃, pH between 4.5 and 5.5.

Morchella;mycelium;carbon source;nitrogen source;temperature;pH;growth vigor;growth rate

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0012-06

四川省財政創(chuàng)新能力提升工程項目（青年基金）（2013QNJJ-017）。

周潔（1983-），女，碩士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳育種研究。E-mail:caoqianyou88@qq.com

**通信作者：譚偉（1964-），男，碩士，研究員，主要從事主要從事食用菌育種與栽培研究。E-mail:332528058@qq.com

2016-05-15