無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)在胎兒染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用研究

楊潔霞 郭芳芳 彭海山 齊一鳴 王東梅 侯亞平 歐陽(yáng)浩新 尹愛(ài)華

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

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無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)在胎兒染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用研究

楊潔霞 郭芳芳 彭海山 齊一鳴 王東梅 侯亞平 歐陽(yáng)浩新 尹愛(ài)華*

(廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442)

目的 探討高通量測(cè)序平臺(tái)的無(wú)創(chuàng)基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的可行性。方法 選擇2012年4月到2013年5月在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診,孕齡12～32周的3711例單胎妊娠高危孕婦,記錄臨床指征、年齡、孕周等數(shù)據(jù)。采用高通量測(cè)序平臺(tái)的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)其外周血游離胎兒DNA進(jìn)行分析。檢測(cè)結(jié)果為高危的孕婦行羊膜腔穿刺或臍血穿刺術(shù)進(jìn)行胎兒染色體核型分析。結(jié)果 3711例孕婦中游離胎兒DNA高通量基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出74例染色體高風(fēng)險(xiǎn)胎兒，羊水/臍血核型分析證實(shí)其中59例為染色體異常，分別為41例21-三體和8例18-三體，4例13-三體，5例性染色異常，1例其他常染色異常，1例21-三體和7例其他染色體異常證實(shí)為假陽(yáng)性。結(jié)論 利用高通量測(cè)序平臺(tái)的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出胎兒13、18、21染色體非整倍體異常，其敏感性、特異性與染色體核型分析技術(shù)具有較高的一致性。但是對(duì)于其他染色體異常準(zhǔn)確性還有待技術(shù)完善來(lái)進(jìn)一步提高，對(duì)于染色體微缺失、微重復(fù)的檢測(cè)也日益受到眾多專家學(xué)者的關(guān)注，這也是我們以后研究的方向之一。

游離DNA；染色體非整倍體；無(wú)創(chuàng)；產(chǎn)前診斷

出生缺陷是影響出生人口素質(zhì)的重要問(wèn)題，中國(guó)每年有1600萬(wàn)新生兒出生，出生缺陷率4%～6%。而染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷的重要因素，唐氏綜合征又稱先天愚型或 21-三體綜合征，是新生兒常見(jiàn)的染體病，發(fā)生率約為 1/800,占小兒三體型染色體70%～80%[1]。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法是通過(guò)獲取胎兒的絨毛、羊水、臍血或者胎兒的組織來(lái)進(jìn)行診斷，這些手段不容易被妊娠婦女接受；并且也對(duì)孕婦和胎兒產(chǎn)生一些潛在的風(fēng)險(xiǎn)[2]。傳統(tǒng)的唐氏綜合征篩查血清學(xué)和超聲篩查方法，靈敏度不夠，檢出率低[3]，1997年Lo等[4]發(fā)現(xiàn)妊娠婦女的血漿和血清中含有游離的胎兒DNA，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。近年來(lái)大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障，開(kāi)辟一條切實(shí)可行的有臨床應(yīng)用價(jià)值的道路[5]。章容等[6]應(yīng)用無(wú)創(chuàng)MPS與染色體非整倍篩查已有相關(guān)研究，本文總結(jié)了迄今已經(jīng)完成3711例孕婦的無(wú)創(chuàng)篩查結(jié)果，旨在探討非整倍體無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)在產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年2月至2013年5月在廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診，高齡妊娠、唐氏綜合征篩查異常孕婦3711例，因有4例無(wú)法得到檢測(cè)結(jié)果而剔除，共計(jì)3707例納入研究，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)方法產(chǎn)前診斷和無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)方法的介紹，經(jīng)過(guò)知情同意、自愿選擇接受無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)，孕齡為12～34周，孕婦年齡17～45歲，B超提示宮內(nèi)妊娠單活胎。每個(gè)參與者簽署知情同意書(shū)后抽取外周靜脈血5ml。

1.2 樣本采集、分離 取孕婦外周靜脈血5ml，EDTA-K2抗凝，1600×g 離心10分鐘，上清血漿分離后再次以16000×g離心10 分鐘。以上兩次離心步驟須在采血后的8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，血漿存放-80℃冰箱進(jìn)一步凍存。

1.3 DNA提取和測(cè)序分析 600μl母體血漿提取血漿DNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。提取過(guò)程中應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。提取后的DNA在-80℃條件下保存。提取的血漿DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。使用Q-PCR檢測(cè)文庫(kù)產(chǎn)量，定量好的文庫(kù)經(jīng)Life Proton測(cè)序。1.4 數(shù)據(jù)分析 將孕婦血中所有游離DNA全部進(jìn)行測(cè)序，獲得分布在每條染色體上真實(shí)核酸片段的數(shù)量，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)、拼接、計(jì)算k-mer覆蓋度[7]，根據(jù)生物信息學(xué)分析，計(jì)算出每條染色體對(duì)應(yīng)的覆蓋深度值，并轉(zhuǎn)化為衡量風(fēng)險(xiǎn)的風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)，確定胎兒患染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)。

1.5 胎兒染色體核型確診方法 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，在知情同意原則下行介入性產(chǎn)前診斷，即采集胎兒羊水或臍血，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后行染色體核型分析或array CGH檢測(cè)確定染色體異常。

1.6 隨訪結(jié)果分析處理 對(duì)每一位接受檢測(cè)的孕婦進(jìn)行妊娠結(jié)局的隨訪跟蹤，記錄胎兒出生后情況，有無(wú)漏診病歷，以便分析無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方法的檢出率、假陰性率、假陽(yáng)性率等。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 接受無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)的孕婦的臨床資料(表 1) 平均年齡(28±5.41)歲，平均孕周(18±4.12)周。

2.2 無(wú)創(chuàng)結(jié)果高風(fēng)險(xiǎn)孕婦介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)共提示74例染色體數(shù)目異常，其中 21-三體43 例、18-三體 10例、13-三體6例、性染色體異常7例、其他染色體異常8例。74例高風(fēng)險(xiǎn)患者中70 例同意做介入性產(chǎn)前診斷，采集胎兒羊水或臍血，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后行染色體核型分析或array CGH確定染色體非整倍體。確認(rèn)異常核型 53 例(75.71%)，結(jié)果見(jiàn)表 2。結(jié)合隨訪結(jié)果，對(duì)21-三體檢出率為100%(41/41)，漏診率為0，誤診率為0.027%(1/3707)；18-三體檢出率為100%(8/8)，漏診率為0，誤診率為0.027%(1/3707)；對(duì)13-三體檢出率為100%(4/4)，漏診率為0，誤診率為0.054%(2/3707)。

2.3 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)性染色體及其他常染色體的檢出情況 該方法共檢出性染色體異常7例，7例孕婦全部接受產(chǎn)前診斷染色體核型分析(結(jié)果見(jiàn)表3)，檢出率為100%(5/5)，漏診率為0，誤診率為0.054%(2/3707)。檢出其他常染色體異常8例，全部接受羊水或臍血穿刺行array CGH檢測(cè)，1例結(jié)果異常，檢出率100%，誤診率0.19%(7/3707)。

表1 3707例無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)孕婦標(biāo)本臨床資料

表2 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果比較

注：*1例拒絕做進(jìn)一步檢查，直接引產(chǎn)；◆1例超聲畸形直接引產(chǎn)；☆2例超聲畸形直接引產(chǎn)

表3 無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)對(duì)性染色體異常的檢出情況

3 討論

染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所致的疾病稱為染色體病[8]。染色體病沒(méi)有有效的治療方法，染色體病患兒一旦出生，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和精神負(fù)擔(dān)，目前主要通過(guò)產(chǎn)前篩查和診斷避免患兒出生。通用的產(chǎn)前篩查方法是檢測(cè)與染色體非整倍體異常相關(guān)的因素[9]，但是目前的唐氏綜合征篩查方案有5%的假陽(yáng)性率，而篩查準(zhǔn)確率也只有70% 或85%[10]。這些篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦需要進(jìn)行進(jìn)一步侵入性產(chǎn)前診斷，對(duì)孕婦和胎兒都存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。1997年Lo等[4]發(fā)現(xiàn)妊娠婦女的血漿和血清中含有游離的胎兒DNA，為無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了新的可能。以及高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了染色體非整倍體異常的檢出率，結(jié)合隨訪結(jié)果，該方法對(duì)21-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.027%；18-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.027%；對(duì)13-三體檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.054%?？捎型娲舾卸容^低的傳統(tǒng)血清學(xué)篩查方法。這一點(diǎn)國(guó)內(nèi)學(xué)者章容等[6]已有大樣本的研究證明。

孕婦外周血中的游離胎兒DNA 之所以可以運(yùn)用于無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)，主要因?yàn)樗鼈兇嬖谝韵聨讉€(gè)方面的生理特點(diǎn)：孕婦血中胎兒游離DNA含量相對(duì)較孕婦血中胎兒細(xì)胞豐富[1]，游離胎兒DNA保留了父母的多態(tài)性位點(diǎn)信息，半衰期短，大部分孕婦產(chǎn)后2小時(shí)即檢測(cè)不到胎兒游離DNA的存在[11]。 但是胎兒游離DNA也存在不穩(wěn)定的特性，呈起伏波動(dòng)，因此可能存在檢測(cè)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，Bianchi等[12]采用無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)篩查了532例孕婦，有16例(3%)孕婦血漿未能提取出足量的胎兒DNA導(dǎo)致檢測(cè)失敗，我們3715例標(biāo)本中95例(2.56%)重新抽血后得到檢測(cè)結(jié)果，另外還有4例(0.108%)兩次抽血后仍然無(wú)法得到明確檢測(cè)結(jié)果而予退費(fèi)處理。因此我們?cè)谥橥鈺?shū)里充分說(shuō)明可能出現(xiàn)重新抽血或檢測(cè)不出結(jié)果可能。

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體檢測(cè)已日趨成熟，因其檢出率高而且不會(huì)對(duì)胎兒造成流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越被臨床醫(yī)生及孕婦群體接受，章容等[6]學(xué)者已有大樣本研究，研究結(jié)果在本研究中也充分得到印證，本研究還對(duì)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)對(duì)性染色體和其他常染色體的檢出率做了初步分析，該方法共檢出性染色體異常7例，結(jié)合隨訪結(jié)果，計(jì)算出該方法檢出率100%，漏診率為0，誤診率為0.054%。檢出其他常染色體異常8例，全部接受羊水或臍血穿刺行array CGH檢測(cè)，1例結(jié)果異常，檢出率100%，誤診率0.19%。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明對(duì)于性染色體和其他常染色體異常還有一定的局限性，還需要更多的數(shù)據(jù)積累。

無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)篩查方法相比較具有明顯優(yōu)勢(shì)，但是由于其費(fèi)用相對(duì)比較昂貴，同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室要求具備高水平的分析技術(shù)[13]，短期內(nèi)難以普及。而且對(duì)于染色體嵌合結(jié)構(gòu)[14]和微小缺失及重復(fù)等無(wú)法檢測(cè)，在臨床應(yīng)用還存在一定的局限性，也決定其暫時(shí)無(wú)法取代傳統(tǒng)的血清學(xué)和超聲結(jié)合篩查方法。但是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)具有無(wú)創(chuàng)性、高準(zhǔn)確性、高通量等優(yōu)勢(shì)，而且可以用于單基因病、RH血型不合、以及一些其他妊娠期疾病的檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)外很多專家學(xué)者都在致力于這方面的研究，相信在不久的將來(lái)，該技術(shù)臨床應(yīng)用前景非常廣闊，為降低中國(guó)出生缺陷做出更大的貢獻(xiàn)。

[1] Ministry of Health, People’s Republic of China. Report on Women and Children’s Health Development in China[M]. Beijing: Ministry of Health, 2011.

[2] Lo YM, Tein MS, Lau TK, et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma abnd serum; implications for non-invasive prenatal diagnosis[J]. Am J Hum Genet, 1998, 62(4): 768-775.

[3] Ghaffari SR, Tahmasebpour AR, Jamal A, et al. First-trimester screening for chromosomal abnormalities by integrated application of nuchal translucency, nasal bone, tricuspid regurgitation and ductus venosus flow combined with maternal serum free beta-hCG and PAPP-A: a 5-year prospective study[J]. Ultrasound Obstet Gynecol, 2012, 39(5):528-534.

[4] Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et a1. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]. Lancet, 1997, 350(9076): 485-487.

[5] Chiu RW, Chan KC, Gao Y, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(51):20458-20463.

[6] 章容,徐聚春,許歡歡,等. 5997例母血胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)大規(guī)模平行測(cè)序篩查胎兒染色體數(shù)目異常[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(16):1744-1747.

[7] Dan S, Wang W, Ren J, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors[J]. Prenat Diagn, 2012, 32(13): 1225-1232.

[8] 吳清明, 周瑾. 出生缺陷產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志, 2011, 19(1):129-131.

[9] Malone FD, Canick JA, Ball RH, et al.First trimester or second trimester screeing，or both, for Down syndrome[J].N Engl J Med，2005,353(19):2001-2011.

[10] Pertl B, Bianchi DW. First-trimester prenatal diagnosis: fetal cells in the maternal circulation[J]. Semin Perinatol，1999，23∶ 393．[11] Lo YM,Zhang J,Leung TN,et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternalplasma[J],Am J Hum Genet,1999,64(1):218-224.

[12] Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD,et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing[J]. Obstet Gynecol, 2012, 119(5): 890-901.

[13] Tong YK, Jin S, Chiu RW, et al. Noninvasive prenatal detection of trisomy 21 by an epigenetic chromosome-dosage approach[J].Clin Chem,2010,56(1):90-98.

[14] Wright CF, Chitty LS, Cell-free DNA and RNA in maternal blood: implications for safer antenatal testing[J].BMJ,2009,339:b2451.

編輯：劉鄧浩

Objective Using massively parallel genome sequencing technology to detect pregnant women free DNA in peripheral blood plasma,for fetal chromosomal aneuploidy noninvasive prenatal genetic testing, explore aneuploid noninvasive prenatal genetic testing in the value of prenatal screening and prenatal diagnosis. Method From February 2012 to May 2013, a total of 3711 high-risk pregnant women were recruited at Prenatal Diagnostics Center of Guang dong Province MCH，with gestational age from 12 to 34 weeks. Five milliliters of peripheral blood were drawn, the DNA were extracted from mother plasma and barcoded, And test results of high risk which accepted interventional prenatal diagnosis as fetal amniotic fluid or cord blood that is collected by the cell culture underwent karyotype analysis or array-CGH identified chromosome aneuploidy.And all detected pregnant women after childbirth were followed-up. Results 3711 cases of pregnant women with a high risk of blood were 74 cases, including 21-trisomy 41 cases; 18-trisomy 8 cases, 13-trisomy 4 cases, sex chromosome abnormalities in 5 cases, other chromosomal abnormalities 1 case. Combined the results of interventional prenatal diagnosis and followed-up, detection rate of this method for 21-trisomy(40/41)、18-trisomy(8/8)、13-trisomy(4/4) reach 100%,the misdiagnosis rate is 1.08%; sex chromosome detection rate and other chromosome detection rate of 100% (6/6), the misdiagnosis rate of 2.43%. Conclusions Using non-invasive prenatal genetic testing to detect maternal blood plasma of free fetal chromosomal DNA lines aneuploidy screening for 21-trisomy 、18-trisomy and 13-trisomy , the sensitivity, specificity and chromosomal karyotyping have high consistency. But for the sex chromosomes and other chromosomal abnormalities often have some limitations, but also need more data accumulate. The technology has the non-invasive, high accuracy, high throughput advantages in clinical which have considerable potential value.

cffDNA； chromosome aneuploidy；non-invasive；prenatal diagnosis

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.007

R714.55

A

2016-05-18)

*通訊作者：尹愛(ài)華，E-mail:yinaiwa@vip.126.com