陳皮提取物多種藥效作用的譜效關(guān)系研究

羅　歡，卞　海，韓燕全，章俊如，夏倫祝，朱新維

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230031）

陳皮提取物多種藥效作用的譜效關(guān)系研究

羅歡1，卞海2，韓燕全1，章俊如1，夏倫祝1，朱新維2

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230031）

●中醫(yī)藥學(xué)在世界上首先發(fā)現(xiàn)了中藥并首創(chuàng)了方劑，醫(yī)方是“除疾保性命之術(shù)”，而劑則有“調(diào)百藥齊，和之所宜”之功。采用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)重新研究并升華古典方劑之術(shù)，開(kāi)創(chuàng)未來(lái)藥物制劑技術(shù)和新劑型藥物研究的全新思維和方向。

目的：了解陳皮SFE-CO2萃取物指紋圖譜與化痰、抗炎和助消化藥理作用的譜效關(guān)系。方法：建立陳皮SFE-CO2萃取物的GC指紋圖譜，采用酚紅排泌法、二甲苯致耳廓腫脹法、胃半固體糊排空法考察10批陳皮SFE-CO2萃取物的化痰、抗炎、助消化作用，并采用雙變量相關(guān)分析法分析譜效關(guān)系。結(jié)果：譜效相關(guān)性分析結(jié)果表明，陳皮脂溶性成分中有10個(gè)色譜峰與化痰作用顯著相關(guān)，14個(gè)色譜峰與抗炎作用顯著相關(guān)，2個(gè)色譜峰與健胃作用顯著相關(guān)。結(jié)論：譜效關(guān)系分析結(jié)果能夠初步說(shuō)明陳皮脂溶性成分化痰、抗炎、健胃等作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

陳皮；SFE-CO2萃??；脂溶性成分；GC-MS；指紋圖譜；譜效關(guān)系

近年來(lái)以研究中藥指紋圖譜與其療效之間的關(guān)系為目標(biāo)的中藥譜效學(xué)日漸興起，它是建立在中藥指紋圖譜基礎(chǔ)上，將中藥指紋圖譜中化學(xué)成分的變化與藥效結(jié)果聯(lián)系起來(lái)的一種研究手段［1］。采用指紋圖譜與藥效相結(jié)合的新模式，在不需各成分逐一分離純化的情況下，可從整體上考察有效部位中各化學(xué)成分生物活性的大小，詮釋混合物中各化學(xué)成分對(duì)藥效的貢獻(xiàn)程度，明確活性成分。為中藥的質(zhì)量控制提供了思路和研究方法，具有理論意義和實(shí)用價(jià)值。

陳皮為臨床常用中藥，具有止咳化痰、理氣和胃等功效，中醫(yī)臨床多以水煎入藥。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，陳皮脂溶性成分含量較高，也是其重要的藥理活性成分。其脂溶性成分中主要含有右旋檸檬烯、蒎烯、萜烯以及豐富的多甲氧基黃酮類成分，對(duì)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均有一定的藥理作用，且生物利用度較高［2］。陳皮脂溶性成分的化學(xué)組成豐富，藥理作用廣泛，但二者之間的聯(lián)系卻未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此筆者認(rèn)為，陳皮脂溶性成分的化學(xué)組成與藥效之間的關(guān)系如何，是陳皮現(xiàn)代研究亟須解決的的問(wèn)題。

1　材料與方法

1材料

1.1.1儀器VARIAN CP-3800氣象色譜儀/ VARIAN SATURAN 2200質(zhì)譜儀（美國(guó)瓦里安公司），色譜柱為CP-SIL 8CB石英毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；HL-5L/50MPa-CWQⅡ型超臨界CO2流體萃取設(shè)備（杭州市華黎泵業(yè)有限公司）；AG285型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ3200DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent 8453E型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫科技公司）；KDC-16H高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

1.1.2試藥10批陳皮藥材，來(lái)源信息見(jiàn)表1。復(fù)方氯化銨片（浙江康恩貝制藥股份有限公司），阿司匹林腸溶片（南京白敬宇制藥股份有限責(zé)任公司），多潘立酮片（上海信誼天平藥業(yè)有限公司）。正己烷（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）、無(wú)水硫酸鈉（中國(guó)上海金山化工廠）等均為分析純，氦氣（純度為99.9%）。

表1　本實(shí)驗(yàn)所用陳皮產(chǎn)地及批號(hào)

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠360只（小鼠3批藥效實(shí)驗(yàn)各120只），雌雄各半，體重18～22 g，動(dòng)物合格證編號(hào)001886，由安徽長(zhǎng)臨河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1陳皮脂溶性成分的提取分別將10批陳皮藥材粉碎，入萃取釜進(jìn)行超臨界CO2（SFE-CO2）萃取。萃取條件按照課題組前期研究得出的最佳萃取工藝［3］，即：萃取溫度45℃，萃取壓力25 MPa，分離釜I壓力8 MPa，分離溫度30℃，萃取時(shí)間2.0 h，CO2流量20 kg/h，陳皮粉碎度60目。得10批陳皮SFE-CO2萃取物（S1～S10）。

1.2.210批陳皮提取物指紋圖譜的建立

1.2.2.1GC/MS色譜條件①色譜條件：CP-SIL 8CB石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃（保持5 min），以8℃/min升溫至220℃（保持2 min），然后保持至分析完成；氣化室溫度250℃：載氣為高純氦氣，載氣流量0.9 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比為1∶50。②質(zhì)譜條件：MS電子能量70 eV，離子源溫度150℃，延時(shí)3 min，掃描范圍（m/z）30～650 amu。

1.2.2.2供試品制備與測(cè)定精密稱定10批陳皮SFE-CO2萃取物樣品各0.2 g，用正己烷定容至10 mL，置分液漏斗中萃取后取上層溶液，備用。分別精密吸取供試品溶液各1 μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.2.3方法學(xué)考察①精密度試驗(yàn)：取S2的陳皮提取物供試液，在相同的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%。表明儀器的精密度良好。②重復(fù)性試驗(yàn)：取陳皮（批號(hào)108896）共6份，按相同方法分別進(jìn)行提取，制備出陳皮SFE-CO2萃取物供試液6份，在相同的色譜條件下進(jìn)行分析，測(cè)得各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%。表明試驗(yàn)方法的重復(fù)性較好。③穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S2的陳皮萃取物供試品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于3%，說(shuō)明陳皮提取物供試品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.2.4樣品測(cè)定在1.2.2.1項(xiàng)色譜條件下測(cè)定10批陳皮SFE-CO2萃取物樣品，圖1中A、B、C圖分別是其中3批陳皮提取物的總粒子流圖（TIC圖）。色譜圖中27個(gè)峰是各供試品共有的（圖1中A圖所示），因此確定這27個(gè)峰為共有峰。由于GC-MS色譜工作站所獲得的數(shù)據(jù)與多種相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)均不兼容，故利用Excel工作表函數(shù)及數(shù)據(jù)分析程序計(jì)算27個(gè)特征成分的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積。

圖1　陳皮SFE-CO2萃取物的TIC圖

1.2.3藥效實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1化痰作用小鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、1～10批陳皮SFE-CO2萃取物組、復(fù)方氯化銨組，每組10只。各組連續(xù)灌胃給藥（劑量按公斤體重計(jì)算，相當(dāng)于成人用生藥量的10倍）或生理鹽水7 d，末次給藥前禁食24 h，自由飲水。末次給藥后30 min，分別給各小鼠腹腔注射5%酚紅10 mL/kg，30 min后頸椎脫臼處死小鼠，解剖小鼠，剝?nèi)夤苤車M織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水的試管中，再加1 mol/L NaOH 0.1 mL，搖勻放置2 h，使氣管的色素溶出。用8534E紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于波長(zhǎng)546 nm處測(cè)吸光度（A）值，根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)液管的A值做回歸方程，從而計(jì)算酚紅排出量。結(jié)果見(jiàn)表2。

1.2.3.2抗炎作用小鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分成模型組、1～10批陳皮SFE-CO2萃取物組、阿司匹林組。各組連續(xù)灌胃給藥（劑量按公斤體重計(jì)算，相當(dāng)于成人用生藥量的10倍）或生理鹽水7 d，末次給藥前禁食24 h，自由飲水。末次給藥后30 min，用二甲苯50 μL涂抹小鼠左耳的兩側(cè)致炎，右耳不做任何處理。涂藥1 h后頸椎脫臼處死小鼠，剪下兩耳，用直徑為8 mm的打孔器切下兩耳圓形耳片，立即精確稱量質(zhì)量，計(jì)算耳腫脹度和腫脹抑制率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　陳皮SFE-CO2萃取物對(duì)小鼠呼吸道酚紅排泌量的影響

表3　陳皮SFE-CO2萃取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹度的影響?。ā纒）

表3　陳皮SFE-CO2萃取物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹度的影響?。ā纒）

注：與模型組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

組別　劑量（g/kg）腫脹度（mg）抑制率（%）模型組　14.88±3.36阿司匹林組　0.043　4.25±1.49　71.402）S1陳皮SFE-CO2萃取物組　0.025　13.63±3.55　8.401）S2陳皮SFE-CO2萃取物組　0.025　12.88±4.06　13.441）S3陳皮SFE-CO2萃取物組　0.013　10.78±2.80　27.501）S4陳皮SFE-CO2萃取物組　0.019　9.63±2.72　35.291）S5陳皮SFE-CO2萃取物組　0.035　5.50±1.83　63.032）S6陳皮SFE-CO2萃取物組　0.014　13.44±3.89　9.621）S7陳皮SFE-CO2萃取物組　0.041　10.88±4.02　26.892）S8陳皮SFE-CO2萃取物組　0.017　8.56±1.96　42.481）S9陳皮SFE-CO2萃取物組　0.035　4.88±2.10　67.232）S10陳皮SFE-CO2萃取物組　0.014　8.33±1.06　43.971）

1.2.3.3促胃動(dòng)力作用小鼠120只，雌雄各半，隨機(jī)分成對(duì)照組、1～10批陳皮SFE-CO2萃取物組、多潘立酮組。各組連續(xù)灌胃給藥（劑量按公斤體重計(jì)算，相當(dāng)于成人用生藥量的10倍）或生理鹽水7 d，末次給藥前禁食24 h，自由飲水。末次給藥后30 min，各組小鼠灌胃半固體糊（5 g梭甲基纖維素、7 g奶粉、4 g糖、4 g淀粉加130 mL水，配成150 mL糊狀物）0.8 mL/只，30 min后脫頸椎處死動(dòng)物，沿腹白線剖開(kāi)腹腔，結(jié)扎胃賁門和幽門。取胃用濾紙拭干后精確稱量全重，然后沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后用濾紙拭干，精確稱量胃凈重，計(jì)算胃內(nèi)殘留率。結(jié)果見(jiàn)表4。

1.2.4譜效學(xué)研究利用SPSS17.0 for WindowsXP/ NT的雙變量相關(guān)分析（Bivariate）方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將共有峰的峰面積與各藥效數(shù)據(jù)建立相關(guān)性［4］，得到陳皮脂溶性成分中各共有特征色譜峰與藥效抑制率的相關(guān)系數(shù)?？梢?jiàn)部分色譜峰與藥效呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），即這些色譜峰對(duì)藥效作用有顯著影響。結(jié)果見(jiàn)表5，表6和表7。

表4　陳皮SFE-CO2萃取物對(duì)小鼠胃內(nèi)殘留率的影響（n=10，±s）

表4　陳皮SFE-CO2萃取物對(duì)小鼠胃內(nèi)殘留率的影響（n=10，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，1）P<0.05，2）P<0.01

組別　劑量（g/kg）　胃內(nèi)殘留率（%）空白對(duì)照組　66.34±4.26多潘立酮組　0.040　29.70±5.031）S1陳皮SFE-CO2萃取物組　0.025　60.37±6.692）S2陳皮SFE-CO2萃取物組　0.025　56.31±2.311）S3陳皮SFE-CO2萃取物組　0.013　49.06±5.711）S4陳皮SFE-CO2萃取物組　0.019　59.11±9.841）S5陳皮SFE-CO2萃取物組　0.035　26.12±5.392）S6陳皮SFE-CO2萃取物組　0.014　36.74±3.512）S7陳皮SFE-CO2萃取物組　0.041　33.13±4.582）S8陳皮SFE-CO2萃取物組　0.017　35.56±9.712）S9陳皮SFE-CO2萃取物組　0.035　21.61±4.532）S10陳皮SFE-CO2萃取物組　0.014　32.11±9.071）

表5　色譜峰面積與酚紅排泌數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)

結(jié)果表明，陳皮脂溶性成分中存在10個(gè)色譜峰與化痰藥效顯著相關(guān)（P<0.05），其中右旋檸檬烯、α-吡喃酮和芳酮與化痰藥效呈非常顯著相關(guān)（P<0.01）。14個(gè)色譜峰與抗炎藥效相關(guān)性較大，其中長(zhǎng)葉松萜烯、β-蓽澄茄烯和月桂醇與抗炎藥效呈非常顯著相關(guān)。2個(gè)色譜峰與胃內(nèi)殘留率顯著負(fù)相關(guān)，即與胃排空藥效顯著正相關(guān)，對(duì)應(yīng)的化合物分別為β-水芹烯和香茅醛。

表6　色譜峰面積與耳腫脹抑制率數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)

表7　色譜峰面積與胃排空數(shù)據(jù)的Pearson相關(guān)系數(shù)

2　討論

本文采用雙變量相關(guān)分析法研究了所建立的陳皮SFE-CO2萃取物指紋圖譜與化痰、抗炎和助消化藥理作用的譜效關(guān)系。根據(jù)關(guān)聯(lián)度與對(duì)應(yīng)成分藥理作用貢獻(xiàn)程度成正比的原則，說(shuō)明陳皮脂溶性成分中分別有10個(gè)、14個(gè)、2個(gè)化合物在化痰、抗炎和助消化藥理作用中可能起到非常重要的作用，初步揭示了陳皮SFE-CO2萃取物發(fā)揮上述3種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

分析結(jié)果表明，萃取物中含量最高的右旋檸檬烯（5號(hào)峰）與化痰作用的關(guān)聯(lián)度最大，這與文獻(xiàn)報(bào)道的檸檬烯具有祛痰平喘作用結(jié)果相一致［5］。與抗炎及胃排空作用關(guān)聯(lián)度最大的成分分別為β-蓽澄茄烯和香茅醛，未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其單體的相關(guān)藥理活性，說(shuō)明其藥理作用可能是中藥內(nèi)在“化學(xué)成分群”發(fā)揮整體藥效作用的結(jié)果。陳皮脂溶性成分及有效部位的提取分離將得到進(jìn)一步研究。

［1］秦昆明，鄭禮娟，沈保家，等.譜效關(guān)系在中藥研究中的應(yīng)用及相關(guān)思考［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38（1）：26-30.

［2］李曉芳，張健康，王慧鸞，等.陳皮的研究進(jìn)展［J］.江西中醫(yī)藥，2014，45（375）：76-78.

［3］羅歡，夏倫祝，韓燕全，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)選陳皮超臨界CO2萃取工藝［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，13（1）：33-36.

［4］李康.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：206-229.

［5］王文淵，韓立路，張蕓蘭，等.橘皮檸檬烯的研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2012，20（5）：46-47.

（編輯：梁葆朱）

Investigation on spectrum-activity relationship between extracts from pericarpium citri reticulatae and its pharmacological action

Luo Huan1，Bian Hai2，Han Yanquan1，Zhang Junru1，Xia Lunzhu1，Zhu Xinwei2
（1.The First Hospital Affiliated to Anhui University of TCM，Hefei Anhui 230031； 2.Anhui University of TCM，Hefei Anhui 230031）

Objective：To establish GC finger prints of SFE-CO2extracts from pericarpium citri reticulatae and found the correlation between finger prints and its effect on dissipating phlegm，anti-inflammatory，digestive function.Methods：Supercritical fluid extracts in ten batches of pericarpium citri reticulatae were analyzed by GC-MS，and GC finger prints of its liposoluble components were established.Then experimental datas in phenolsulfonphthalein excretion experiment，xylene-induced ear edema experiment and gastric semisolid paste emptying experiment were conducted by bivariate correlation analysis.Results：Spectrum-activity relationship studies manifested，there were 10 chromatographic peaks associated with dissipating phlegm significantly，14 chromatographic peaks associated with anti-inflammatory significantly，and 2 chromatographic peaks associated with digestive function significantly in the liposoluble constituents of pericarpium citri reticulatae.Conclusion：Spectrum-activity relationship can explain material basis of drug action of liposoluble constituent in pericarpium citri reticulatae preliminarily.

pericarpium citri reticulatae；SFE-CO2；liposoluble constituents；GC-MS；finger print；spectrum-activity relationship

R285

A

1671-0258（2016）05-0022-04

2014年度安徽中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2014qn023）

羅歡，碩士，藥師，E-mail：lhuan1229@163.com

夏倫祝，教授，E-mail：xialunzhu@sohu.com