基于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)比較研究前肢畸形WHBE兔骨代謝特征

呂建敏, 陳方明，陳誠

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053)

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基于OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)比較研究前肢畸形WHBE兔骨代謝特征

呂建敏, 陳方明，陳誠

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，杭州 310053)

目的 利用OPG (osteoprotegerin)/RANK (receptor activator of NF-κB)/RANKL (receptor activator of NF-κB ligand)系統(tǒng)比較研究前肢畸形WHBE兔骨代謝特征。方法 取WHBE兔、日本大耳白兔、前肢畸型WHBE兔各10只，分為3組，標(biāo)記為HWR (healthy WHBE rabbit)、HJR (healthy Japanese rabbit)和FMWR (forelimb malformation WHBE rabbit)組。用X射線機所拍攝X-線片觀察各組兔前肢尺橈部形狀并測定平均灰度值；通過骨組織石蠟切片HE染色對前肢骨組織進行微觀形態(tài)分析；采用熒光定量PCR法檢測OPG、RANKL基因在肝臟中表達；采用酶聯(lián)免疫法和免疫組化法分別測定OPG/RANK/RANKL蛋白在血清和骨組織中的表達。結(jié)果 與HWR和HJR組比較，F(xiàn)MWR組兔前肢尺橈部呈異常彎曲狀，骨皮質(zhì)明顯變薄，X-線片所示灰度值顯著低于HWR組(P<0.05)。FMWR組兔在肝臟RANKL基因表達水平和RANKL/OPG mRNA比值(P<0.01)，血清RANK、RANKL蛋白含量及RANKL/OPG比值(P<0.05,P<0.01)，骨組織RANKL蛋白表達陽性指數(shù)及RANKL/OPG比值(P<0.05,P<0.01)等指標(biāo)上均顯著高于HWR組和HJR組。與HJR組比較，HWR組兔肝臟OPG和RANKL基因表達水平顯著提高(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論 前肢畸形WHBE兔存在骨質(zhì)量下降、骨組織受損現(xiàn)象，RANKL/OPG比值明顯升高，骨代謝紊亂是其骨骼發(fā)生畸形的主要原因。與日本大耳白兔在RANKL基因表達水平上的品種差異可能是WHBE兔對前肢畸形易感的誘因。

WHBE兔；日本大耳白兔；前肢畸形；骨代謝；OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)

白毛黑眼兔(WHBE rabbit)是浙江省的一種特色實驗動物[1]，在育種過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)WHBE兔容易發(fā)生自發(fā)性前肢畸形疾病，且發(fā)生率要高于其他品種兔。已有研究表明,WHBE兔對骨骼畸形疾病敏感性可能與其血清中Ca和ALP水平較低有關(guān)[2]，但具體原因尚不明確。另一方面，骨骼畸形是骨代謝異常的表現(xiàn)，osteoprotegerin (OPG)/receptor activator of NF-κB (RANK)/ receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)系統(tǒng)是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路[3]，目前已作為主要的標(biāo)志物廣泛用于骨代謝的研究[4-8]。本研究首先從骨骼形狀和骨組織微觀形態(tài)觀察上驗證前肢畸形WHBE兔與 兔的差異性，再從OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)入手，從基因和蛋白表達層面比較研究前肢畸形WHBE兔、 WHBE兔和 日本大耳白兔三者在OPG、RANK、RANKL表達特性上差異，為探討前肢畸形WHBE兔致畸原因，揭示W(wǎng)HBE兔骨代謝特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

普通級前肢畸形WHBE兔10只，體重1.9～2.1 kg；普通級WHBE兔10只，體重2.5～2.4 kg；普通級日本大耳白兔10只，體重2.5～2.9 kg，均購自浙江省新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場【SCXK(浙)2010-0042】。以上動物均為雄性，年齡在2.0～2.5 月齡。動物組織取材均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心動物實驗設(shè)施內(nèi)進行【SYXK(浙)2013-0184】進行。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR green 熒光定量PCR試劑盒均購自大連寶生物(TaKaRa)公司；OPG、RANKL及內(nèi)參β-actin引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。 封口膜和PCR板購自美國Bio-Rad公司。

兔護骨素(OPG)、兔核因子KB受體活化子(RANK)和兔核因子KB受體活化子配體因子(RANKL)ELISA 試劑盒(杭州誠維生物公司)，批號分別為E2016050902、E2016050904、2016050903。

RANK兔多抗(博奧森公司)，批號為AD062301；RANKL鼠單抗和OPG兔多抗(Adcam公司)，批號分別為GR58773-1和GR81101-1。

1.1.3 主要儀器

PLX700B/B高頻移動式C形臂X射線機(南京普愛射線影像設(shè)備有限公司)，用于X線片拍攝。

組織均質(zhì)機(法國Bertin公司)； iQ5熒光定量PCR儀、水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Nanodrop2000蛋白核酸測定儀、冷凍高速離心機(美國Thermo公司)；9700 PCR擴增儀(美國ABI公司)，用于熒光定量PCR檢測。Model 680型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，用于ELISA檢測。Microm AP280組織包埋機、Microm HM 335E型輪轉(zhuǎn)切片機(德國Microm公司)；Leica染色機操作規(guī)程(瑞士Leica公司)，NanoZoomer 2.0 RS數(shù)字切片掃描儀(日本濱松光電)用于免疫組化檢測。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

取2.0～2.5 月齡雄性前肢畸形WHBE兔、WHBE兔、日本大耳白兔各10只，分為3組：前肢畸形WHBE兔組(forelimb malformation WHBE rabbit group,簡稱FMWR組)，WHBE兔組(healthy WHBE rabbit group，簡稱HWR組)和日本大耳白兔組(healthy Japanese rabbit group, 簡稱HJR組)。

1.2.2 樣本采集

先將各組實驗兔固定，取血，分離血清，置-20℃冰箱保存，用于血清OPG、RANK、RANKL蛋白含量的檢測；再麻醉處死各組兔，X射線機下拍片后，取肝臟于凍存管中，-80℃冰箱保存，用于OPG、RANKL基因表達檢測；取左側(cè)前肢骨(尺橈部)于4%中性甲醛中固定，用于前肢骨組織學(xué)及免疫組化分析。

1.2.3 檢測指標(biāo)

(1)前肢骨形狀X射線拍片觀察及圖像分析

分別將各組剛處死的實驗兔置于PLX700B/B高頻移動式C形臂X射線機下進行前肢骨(橈骨和尺骨)形狀拍片。利用Image J圖像分析軟件分析前肢橈尺骨X線片，測定平均灰度值，以間接了解骨密度情況[9]。

(2)兔肝臟OPG、RANKL mRNA熒光定量PCR檢測：1)肝臟總RNA提取和檢測：采用TAKARA動物組織RNA提取試劑盒提取兔肝臟組織總RNA(具體操作步驟參照試劑盒說明書)。采用Nanodrop 2000蛋白核酸測定儀檢測總RNA的純度和濃度。所提取RNA樣品于-80 ℃保存。2)cDNA合成： 每個樣品取2 μg總RNA，按RT反轉(zhuǎn)錄試劑說明書方法合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?)qRT-PCR：根據(jù)Genbank中要檢測基因的mRNA序列，用Oligo 6軟件設(shè)計OPG、RANKL及內(nèi)參β-actin引物(引物序列見表1)。熒光定量 PCR在伯樂iQ5熒光定量PCR儀上進行，反應(yīng)體系按照TAKAR公司 SYBR Green 試劑盒推薦的方法進行配制，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性10 s，然后95℃ 變性5 min，60℃ 復(fù)性30 s， 40個循環(huán)后進入融解曲線程序。每個樣品PCR反應(yīng)重復(fù)3次，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性。差異基因表達水平參考文獻[10]的方法計算(采用2-ΔΔCT計算)。

(3)兔血清OPG、RANK、RANKL蛋白含量

利用酶聯(lián)免疫法，參照兔OPG、RANK、RANKL蛋白檢測的ELISA 試劑盒說明書，測定以上3種蛋白在血清中的含量。

(4)兔前肢骨組織OPG、RANK、RANKL蛋白表達

兔前肢骨經(jīng)固定、脫鈣、石蠟包埋等程序制作成前肢橈骨組織石蠟包埋塊，利用切片機對組織包埋塊進行切片，每個標(biāo)本取5 張切片，常規(guī)脫蠟后，分別用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色。免疫組化操作按相關(guān)試劑盒說明書進行，制作好切片后用數(shù)字切片掃描儀對每張切片所要分析的部位進行掃描，利用圖像分析軟件(Carl Zeiss Imaging Systems：Carl Zeiss公司)進行圖像分析，最終以陽性指數(shù)(總吸光度IOD/72049.356)來反映OPG、RANK和RANKL蛋白的表達強度。

表1 OPG、RANKL 及內(nèi)參(β-actin)引物序列及

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 8.1 統(tǒng)計軟件中的ANOVA過程進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P>0.05為差異無顯著性，P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異極顯著，組間樣本均數(shù)差異采用Duncan氏多重比較檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組兔前肢骨X射線拍片觀察結(jié)果

三種實驗兔前肢X光片見圖1。與WHBE兔和日本大耳白兔相比，前肢畸形WHBE兔前肢尺橈部呈明顯彎曲狀。利用Image J 圖像分析軟件測得前肢畸形WHBE兔X-線片平均灰度值為(52.7±3.1)，低于WHBE兔(55.9±1.3)和日本大耳白兔(55.4±3.5)，且與WHBE差異存在顯著性(P<0.05)，說明前肢畸形WHBE兔的骨骼質(zhì)量發(fā)生明顯下降。

2.2 各組兔肝臟OPG、RANKL基因表達

兔肝臟OPG、RANKL 基因表達情況見表2和圖2。WHBE兔的OPG和RANKL的基因表達水平均顯著高于日本大耳白兔(P<0.05，P<0.01)，說明這兩種兔在骨代謝特征上存在差異，但兩者在RANKL/OPG比值上差異無顯著性(P>0.05)。與WHBE兔和日本大耳白兔相比，前肢畸形WHBE兔RANKL mRNA表達水平和RANKL/OPG mRNA比值均極顯著升高(P<0.01)。

2.3 各組兔血清OPG、RANK、RANKL表達

兔血清ORG、RANK、RANKL蛋白含量見表3和圖3。由表和圖可見，3組兔在血清OPG蛋白含量上差異無顯著性(P>0.05)，且WHBE兔和日本大耳白兔之間在血清RANK和RANKL蛋白含量及RANKL/OPG比值上差異也無顯著性(P>0.05)。與WHBE兔和日本大耳白兔比較，前肢畸形WHBE兔血清RANK和RANKL蛋白含量分別極顯著(P<0.01)和顯著升高(P<0.05)；RANKL/OPG比值顯著高于日本大耳白兔(P<0.01)和WHBE兔(P<0.05)。

注：A. WHBE兔；B. 日本大耳白兔；C. 前肢畸形WHBE兔。圖1 兔前肢X線片Note: A. A healthy WHBE rabbit; B. A healthy Japanese rabbit; C. A forelimb malformation WHBE rabbit.Fig.1 X-ray film of forelimb in the rabbits

組別GroupsOPGRANKLRANKL/OPGWHBE兔組(HWR),HealthyWHBErabbitgroup2.03±0.65a1.17±0.25B0.64±0.25B日本大耳白兔組(HJR)HealthyJapaneserabbitgroup1.32±0.66b0.45±0.11C0.41±0.11B前肢畸形WHBE兔組(FMWR)ForelimbmalformationWHBEgrabbitgroup1.45±0.09ab2.04±0.21A1.42±0.20A

注：同列無字母或數(shù)據(jù)肩標(biāo)存在相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

Note. In the same line, values with no letter or the same letter superscripts meanP>0.05, while values with different small letter superscripts meanP<0.05, and with different capital letter superscripts meanP<0.01. The same as in tab.3 and 4.

表3 各組兔血清OPG、RANK、RANKL蛋白含量及RANKL/ORG比值

注：同一指標(biāo)柱形圖上方無字母或數(shù)據(jù)肩標(biāo)存在相同字母表示差異無顯著性(P>0.05),不同小寫字母表示差異有顯著性(P<0.05), 不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖3、6同。圖2 肝臟 OPG/RANKL基因表達及RANKL/OPG比值Note. On the column figure of the same parameter, values with no letter or the same letter superscripts mean P>0.05, while values with different small letter superscripts mean P<0.05, and with different capital letter superscripts mean P<0.01. The same as in the Fig. 3 and Fig.6.Fig.2 OPG /RANKL gene expression and RANKL/OPG ratio in the rabbit livers

2.4 各組兔骨組織形態(tài)觀察及骨組織OPG、RANK、RANKL蛋白表達

2.4.1 兔骨組織形態(tài)學(xué)觀察

各組兔橈骨組織石蠟切片HE染色觀察結(jié)果見圖4， WHBE兔(A)和日本大耳白兔(B)的骨皮質(zhì)部位均勻緊密；前肢畸形WHBE兔(C)骨皮質(zhì)明顯變薄，并存有大量編織骨，提示前肢畸形WHBE兔的骨組織發(fā)育不良，骨形態(tài)受損。

2.4.2 兔骨組織OPG、RANK、RANKL蛋白表達

注：(1): OPG蛋白表達；(2): RANK蛋白表達；(3): RANKL蛋白表達；(4): RANKL/OPG比值。圖3 血清OPG/RANK/RANKL蛋白表達及RANKL/OPG比值Note. (1) OPG protein expression, (2) OPG protein expression, (3) OPG protein expression,(4)RANKL/OPG ratio.Fig.3 OPG/RANK/RANKL protein expression and of RANKL/OPG ratio in the rabbit serum

各組兔橈骨組織OPG/RANK/RANKL蛋白免疫組化染色圖片見圖5，蛋白表達的陽性指數(shù)見表4和圖6。OPG/RANK/RANKL蛋白在骨細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中均有表達(圖5)。且由表4和圖6可知，各組兔在骨組織OPG和 RANK蛋白表達陽性指數(shù)上差異無顯著性(P>0.05)。而前肢畸形WHBE兔的RANKL蛋白表達陽性指數(shù)和RANKL/OPG比值均高于其他兩組兔，分別與日本大耳白兔和 WHBE兔具有極顯著性(P<0.01)和差異有顯著性 (P<0.05)。

3 討論

OPG、RANK和RANKL是腫瘤壞死因子超家族的新成員，OPG屬于分泌性糖蛋白，RANK和RANKL主要為跨膜蛋白[3]。OPG、RANK、RANKL基因可在多種組織中表達(如肝臟和骨組織)[3]，其基因表達產(chǎn)物不僅存在于骨組織，而且也可在血清中測出，目前已有將血清OPG、RANK、RANKL蛋白檢測結(jié)果用于骨代謝評估的報道[11-12]。OPG/RANK/RANKL對骨代謝的作用主要體現(xiàn)在對破骨細(xì)胞形成和活化的調(diào)控上[13]，其具體機制為：在骨組織中，RANKL和OPG主要在成骨細(xì)胞(OB)中表達，RANK主要在破骨細(xì)胞(OC)表達，RANKL與RANK結(jié)合形成RANK-RANKL信號，可激活下游信號分子，促進破骨細(xì)胞分化、成熟和骨的吸收[14]；而OPG作為受體拮抗劑，主要功能是與RANKL競爭性結(jié)合，抑制骨的吸收[13]，在正常情況下，RANKL/OPG比值處于相對恒定狀態(tài)，一旦異常升高或降低，將會使破骨細(xì)胞分化功能異常增強或減弱，導(dǎo)致骨代謝紊亂和相關(guān)疾病的發(fā)生。因此，RANKL/OPG比值被認(rèn)為是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子[15]，可利用該比值判斷骨破壞程度[16]。

注：A. WHBE兔；B. 日本大耳白兔；C. 前肢畸形WHBE兔。圖4 兔橈骨石蠟切片HE 染色結(jié)果(×25)Note. A. A healthy WHBE rabbit, B. A healthy Japanese rabbit, C. A forelimb malformation WHBE rabbit. HE stainingFig.4 Comparison of the histology of the radius.

注：A. OPG蛋白表達； B. RANK蛋白表達；C. RANKL蛋白表達。圖5 兔橈骨OPG、RANK、RANKL蛋白免疫組織化學(xué)染色(×100)Note. A. Expression of OPG, B. Expression of RANK, C. Expression of RANKL.Fig.5 Expression of OPG, RANK and RANKL in the rabbit radius tissues. Immunohistochemical staining.

組別Groups陽性指數(shù)Positiveindex(×103)OPGRANKRANKLRANKL/OPGWHBE兔組(HWR)HealthyWHBErabbitgroup13.68±1.8942.83±2.953.71±0.44ABb0.28±0.05ABb日本大耳白兔組(HJR)HealthyJapaneserabbitgroup13.60±1.4145.29±10.893.49±0.50Bb0.27±0.03Bb前肢畸形WHBE兔組(FMWR)ForelimbmalformationWHBEgrabbitgroup13.12±1.6247.91±2.234.44±0.33Aa0.34±0.03Aa

注：(1)OPG蛋白；(2)RANK蛋白；(3)RANKL蛋白；(4)RANKL/OPG比值。圖6 骨組織OPG/RANK/RANKL蛋白表達陽性指數(shù)及RANKL/ORG比值Note. (1) OPG protein, (2) RANK protein, (3) RANKL protein，(4)RANKL/OPG ratio.Fig.6 Positive indexes of OPG /RANK/RANKL protein expression and RANK/OPG ratio in the rabbit bone tissues

本研究首先通過X攝片和骨組織石蠟切片HE染色觀察驗證了前肢畸形WHBE兔在骨形狀、骨密度及骨組織微觀形態(tài)上與 兔的差異性，確認(rèn)了前肢畸形WHBE兔存在骨質(zhì)量下降和骨組織形態(tài)受損的病癥。繼而從基因和蛋白表達層面探討前肢畸形WHBE兔的致病原因，發(fā)現(xiàn)前肢畸形WHBE兔無論在基因還是蛋白表達水平上，其RANKL/OPG比值均顯著高于WHEB兔及日本大耳白兔。而RANKL/OPG比值是判斷骨破壞程度的重要因子[15]，RANKL/OPG比值升高可使破骨細(xì)胞分化作用增強，骨的吸收和破壞程度加劇，導(dǎo)致骨代謝異常，這可能是導(dǎo)致前肢畸形WHBE兔發(fā)病的主要原因。此結(jié)果與前人報道較一致[16-19]，他們在研究骨質(zhì)疏松和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等骨代謝疾病發(fā)病機制時，均發(fā)現(xiàn)上述疾病發(fā)生與RANKL/OPG比值升高相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn) WHBE兔RANKL基因表達水平顯著高于 日本大耳白兔，說明兩者在RANKL基因表達上存在品種差異，這可能是WHBE兔易發(fā)生前肢畸形的誘因，但具體機制還有待進一步研究。

基于基因、血清蛋白、骨組織蛋白表達層面分析，可推測RANKL/OPG比值升高是造成前肢畸形WHBE兔骨骼發(fā)育異常的主要原因，而WHBE兔和日本大耳白兔在RANKL基因表達上的品種差異，可能是WHBE兔容易發(fā)生骨骼畸形的誘發(fā)因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)不僅揭示了前肢畸形WHBE兔的發(fā)病原因，而且為自發(fā)性骨代謝疾病動物模型的開發(fā)提供了思路。

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Comparative study on the characteristics of bone metabolism in forelimb malformation WHBE rabbits via the OPG/RANK/RANKL system

LV Jian-min*, CHEN Fang-min, CHEN Cheng

(Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To comparatively investigate the characteristics of bone metabolism in forelimb malformation WHBE rabbits based on the OPG/RANK/RANKL system. Methods Healthy male 2-2.5-month old WHBE rabbit (HWR), Healthy Japanese rabbit (HJR) and forelimb malformation WHBE rabbit (FMWR) were used in this study and divided into 3 groups, HWR, HJR and FMWR groups, with 10 rabbits in each group. The shape of forelimb and mean gray value observed from X-ray film were examined, and the bone tissue micro-morphology was analyzed using HE staining. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to determine the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-KB ligand (RANKL) mRNA. The expressions of OPG, receptor activator of NF-KB (RANK) and RANKL protein in serum and bone tissue were assayed by enzyme-linked immunoassay (ELISA) and immunohistochemistry, respectively. Results Compared with the HWR and HJR groups, rabbits in the FMWR group appeared abnormal in toutuous forelimb and thinner bone cortex. The mean gray values of X-ray in the FMWR group were lower than that in the HWR group (P<0.05). There were significant differences between the FMWR and healthy rabbits (HWR and HJR) in the following parameters: RANKL mRNA expression and RANKL/OPG mRNA ratio in the liver(P<0.05,P<0.01), serum protein expression of RANK and RANKL and RANKL/OPG ratio (P<0.05,P<0.01), and positive index of expression of RANKL protein and RANKL/OPG ratio in the bone tissue(P<0.05,P<0.01). Furthermore, the gene expression levels of OPG and RANKL of HWR were significantly higher than that of HJR(P<0.05,P<0.01). Conclusions The FMWR show some abnormal symptoms in bone metabolism as well as decrease of bone quality and histological changes of bone micro-structure, due to the significant increase of RANKL/OPG ratio of FMWR. The breed differences between WHBE and Japanese rabbits in RANKL mRNA expression level may be one of factors inducing limb malformation in the WHBE rabbits.

WHBE rabbit; Japanese rabbit; Forelimb malformation; Bone metabolism; OPG/RANK/RANKL system

LV Jian-min， E-mail: ljm6666@163.com

浙江省科技廳資助項目基金(編號：2014C37008)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團隊基金(編號：XTD201301)。

呂建敏(1971-)，女，研究員，博士，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: ljm6666@163.com。

研究報告

Q95-33

A

1005-4847(2016)05-0503-08

10.3969/j.issn.1005-4847.2016.05.012

2016-05-30