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    豬流行性腹瀉病毒繁殖條件的研究

    2016-11-29 08:59:03王靚靚白會新
    豬業(yè)科學(xué) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:胰酶孔板滴度

    王靚靚,白會新

    (1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江 大慶 163311;大慶市畜牧技術(shù)推廣站,黑龍江 大慶 163311)

    豬流行性腹瀉病毒繁殖條件的研究

    王靚靚1,白會新2*

    (1.大慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,黑龍江 大慶 163311;大慶市畜牧技術(shù)推廣站,黑龍江 大慶 163311)

    豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) 引起的一種嚴(yán)重的病毒性傳染病。該病可導(dǎo)致哺乳仔豬發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水,并且致死率極高,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。實驗為了提高PEDV的繁殖滴度,對PEDV的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化并連續(xù)體外傳代培養(yǎng),分別從改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)方式三個方面進(jìn)行了PEDV的傳代培養(yǎng),最終提高了病毒的滴度(TCID50),從而降低了該病毒的致病性。

    豬流行性腹瀉病毒;疫苗;培養(yǎng)特性

    PEDV是一種有包膜的單鏈RNA病毒,屬于冠狀病毒科,冠狀病毒屬,該病毒引起的臨床癥狀一般表現(xiàn)為嚴(yán)重的水樣腹瀉,病豬在腹瀉3~4 d后,會因嚴(yán)重脫水而死亡。PEDV經(jīng)口傳染仔豬,在腹瀉的早期階段,它富集在小腸內(nèi)的組織內(nèi)容物中。隨著PEDV在許多國家的暴發(fā),國內(nèi)外很多學(xué)者始終致力于研究PEDV的培養(yǎng)條件[1],提高病毒的滴度[2],為PEDV的疫苗研制提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但是,由于其復(fù)雜的培養(yǎng)條件,病毒在細(xì)胞中繁殖滴度等問題仍是急需解決的難題之一。為了解決此問題,本實驗通過改變胰酶濃度、吸附時間和培養(yǎng)條件等方面對PEDV HLJBX株進(jìn)行培養(yǎng),確立了PEDV的最佳培養(yǎng)條件,從而提高了病毒的滴度,為下一步疫苗開發(fā)奠定了一定的基礎(chǔ)。

    1??毒株、細(xì)胞系和引物

    本實驗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防與獸醫(yī)學(xué)實驗室進(jìn)行,PEDV HLJBX株由實驗室分離并保存,非洲綠猴傳代腎細(xì)胞(Vero)細(xì)胞系于實驗室保存, PEDV鑒定引物均由實驗室設(shè)計并由博仕生物公司合成。

    2??實驗方法

    2.1??細(xì)胞庫的建立

    將Vero細(xì)胞的復(fù)蘇后,進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞庫性狀穩(wěn)定后進(jìn)行無菌檢測和支原體檢測。

    2.2??PEDV的特異性檢測

    2.2.1 間接免疫熒光檢測

    接種病毒的Vero細(xì)胞培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液,用PBS漂洗細(xì)胞標(biāo)本片3次,用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞,室溫20 min后用PBS漂洗3次,用甘氨酸溶液350μL/孔處理細(xì)胞,室溫10 min,再用PBS漂洗3次,將殘留液棄凈后,加入一抗,37 ℃孵育60 min,PBS洗滌3次后,再加二抗,37 ℃避光孵育60 min,最后用中性甘油封片,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    2.2.2 RT-PCR檢測

    取150μL的PEDV放入EP管中,管中加入RA2液500μL,充分顛倒10次,靜置1 min。將PEDV裂解物全部吸入內(nèi)套管中,離心1 min。取出內(nèi)套管,棄掉外套管中的液體,在內(nèi)套管中加入500 μL洗液,離心1 min。重復(fù)一次上面的步驟后,取出內(nèi)套管棄掉外套管中的液體,再將內(nèi)套管放回到外套管中,不加洗液離心1 min。將內(nèi)套管移入新的EP管中,在內(nèi)套管膜的中央加入洗脫液25 μL,室溫靜置1 min后離心1 min,獲得總RNA。之后用PEDV引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)參數(shù)為42 ℃、1 h,72 ℃、15 min,冰上冷卻。

    將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物使用上游引物及下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸50 s,30個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

    反應(yīng)結(jié)束后,用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

    2.2.3 PEDV滴度的測定采用96孔板進(jìn)行測定。首先將細(xì)胞進(jìn)行消化,分裝到96孔板內(nèi),待細(xì)胞長滿80 %時,棄去DMEM液,用PBS洗3次,將病毒稀釋成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,

    10-9,10-10,10個稀釋度,每一稀釋度接種5孔細(xì)胞,接種量為100 μL/孔,并設(shè)立一行作為細(xì)胞對照,在接毒后72 h,判定細(xì)胞病變,當(dāng)病變細(xì)胞在80 %以上時,判定為病變細(xì)胞孔,進(jìn)行TCID50的測定。按公式計算(Reed-Muech 氏法)。

    2.2.4 PEDV滴度的提高

    2.2.4.1 不同胰酶濃度對病毒滴度的影響

    取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化,分裝到24孔板中,觀察細(xì)胞,待細(xì)胞長滿80%時,棄去24孔板中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞2次,將病毒液和無血清的DMEM液混合,同時胰酶終濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/ mL、5 μg/ mL、10 μg/ mL、15 μg/ mL、20 μg/ mL、25 μg/mL、50 μg/ mL、60 μg/ mL和75 μg/ mL,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)共同吸附1 h后加入不含血清的DMEM,同時設(shè)立細(xì)胞對照孔,37 ℃培養(yǎng),72 h收毒,繁殖8代后,均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行TCID50測定。

    2.2.4.2 不同吸附時間對病毒滴度的影響

    取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化,分裝到24孔板中,觀察細(xì)胞,待細(xì)胞長滿80 %時,棄去24孔板中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞2次,將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)共同吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后加入不含血清的DMEM,同時設(shè)立細(xì)胞對照孔,37 ℃培養(yǎng),72 h收毒,繁殖8代后,均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行 TCID50測定。

    2.2.4.3 不同培養(yǎng)條件對病毒滴度的影響

    取生長良好的Vero單層細(xì)胞進(jìn)行消化,分裝到24孔板中,觀察細(xì)胞,待長滿80 %時,棄去24孔板中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞2次,將病毒液、最適的胰酶終濃度和無血清的DMEM液按比例混合,接種在Vero細(xì)胞上,在到達(dá)最適吸附時間時,一孔直接加入無血清的DMEM,一孔棄去吸附液后加入無血清的DMEM,并設(shè)立細(xì)胞對照孔,37 ℃培養(yǎng),72 h收毒,繁殖8代后,均接種在長滿Vero細(xì)胞的96孔板中進(jìn)行 TCID50測定。

    3??實驗結(jié)果

    3.1??Vero細(xì)胞的培養(yǎng)

    待細(xì)胞長滿單層時進(jìn)行傳代,接種密度是1×106/ mL,細(xì)胞狀態(tài)良好。鏡檢可見,長滿單層的細(xì)胞緊貼于細(xì)胞壁,生長致密,呈長梭形,輪廓清晰,折光性強(qiáng)(如圖1A)。將PEDV病毒接種在Vero細(xì)胞上,在30 h時出現(xiàn)明顯的CPE,有部分細(xì)胞腫脹變圓,折光性增強(qiáng),顆粒物質(zhì)增多(如圖1D),細(xì)胞對照未出現(xiàn)異常(如圖1B)。培養(yǎng)48 h,細(xì)胞間隙變大,有少量細(xì)胞脫落(如圖1E),對照細(xì)胞生長良好,仍然未見異常(如圖1C)。在72 h時,細(xì)胞脫落已達(dá)80 %以上,細(xì)胞間隙變大、皺縮、融合,細(xì)胞單層形成網(wǎng)眼狀,收毒(如圖1F)。

    圖1 在不同時間點接種PEDV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生的病變(20X)

    3.2??細(xì)胞的純凈檢測結(jié)果

    3.2.1 Vero細(xì)胞的細(xì)菌、霉菌檢測結(jié)果

    用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(G.P)

    對Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測,未見細(xì)菌、霉菌污染。

    3.2.2 Vero細(xì)胞的支原體檢測結(jié)果

    用支原體培養(yǎng)基對Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測,均未見支原體污染。

    3.3??PEDV的鑒定結(jié)果

    3.3.1 間接免疫熒光檢測結(jié)果

    取Vero細(xì)胞培養(yǎng)物接種長滿單層的Vero細(xì)胞48 h后,經(jīng) PEDVN蛋白單克隆抗體間接免疫熒光檢測,在未接種PEDV的Vero細(xì)胞中,未見到任何特異性綠色熒光斑點(圖 2A),而在感染PEDV的Vero細(xì)胞中觀察到大量特異性綠色熒光斑點(圖 2B)。表明PEDV在Vero細(xì)胞中復(fù)制增殖。

    圖2 間接免疫熒光檢測 PEDV(20 X)

    3.3.2 RT-PCR檢測結(jié)果

    擴(kuò)增產(chǎn)物片段約467 bp,與預(yù)期結(jié)果相一致(見圖3)。

    圖3 PEDV的RT-PCR結(jié)果

    3.4??PEDV滴度的測定結(jié)果

    采用96孔板進(jìn)行測定,在接毒后72 h,判定細(xì)胞病變,當(dāng)病變細(xì)胞在80 %以上時,判定為病變細(xì)胞孔,進(jìn)行TCID50的測定。按公式計算(Reed-Muech 氏法)結(jié)果見表1。

    其確切稀釋倍數(shù)可按下列公式計算:

    將由上式獲得的0.73加在高于50 %死亡的稀釋度的對數(shù)(3)上,因此該病毒的 TCID50應(yīng)是10-3.73/0.1 mL。

    3.5??PEDV滴度的提高

    3.5.1 不同的胰酶濃度對滴度的影響

    設(shè)立了胰酶濃度分別為1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進(jìn)行PEDV的培養(yǎng),當(dāng)胰酶濃度在50 μg/mL及以上時,PEDV無法進(jìn)行培養(yǎng)。達(dá)到該濃度時可以觀察到細(xì)胞拉網(wǎng)成堆,很難觀察出病變。

    表1 TCID50測定結(jié)果

    圖4 不同的胰酶濃度對病毒滴度的影響

    3.5.2 不同吸附時間對滴度的影響

    在培養(yǎng)PEDV毒株時,分別設(shè)立在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)吸附0.5 h、1 h、1.5 h和2 h后,加入無血清的DMEM溶液,72 h收毒,測定病毒滴度。

    圖5 不同吸附時間對病毒滴度的影響

    3.5.3 不同培養(yǎng)方式對滴度的影響

    培養(yǎng)PEDV時采用2種培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng),分別為留吸附液和棄吸附液,之后在加入維持液,72 h收毒,測定病毒滴度。

    圖6 不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響

    4??討論

    近年來,有關(guān)PEDV疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展[3],疫苗滴度的高低可以直接影響到疫苗接種的效果,因此準(zhǔn)確測定疫苗滴度十分重要。本文通過改變胰酶終濃度、孵育時間和培養(yǎng)方式,來提高病毒的滴度,最終將PEDV的滴度維持在10-6.0/0.1 mL至10-7.0/0.1 mL之間。Hofinann和Wy1er實驗表明,在培養(yǎng)PEDV時,若不加胰酶,那么PEDV感染細(xì)胞的能力會大大減弱,連續(xù)培養(yǎng)幾代后,會使病毒在細(xì)胞上發(fā)生丟失[4]。所以PEDV的繁殖是有賴于胰酶的存在的。但是很多研究學(xué)者在培養(yǎng)PEDV時,對于胰酶的終濃度的選擇都有一定的差別[5-6]。在本實驗中,對PEDV HLJBX毒株進(jìn)行培養(yǎng)時,設(shè)立了胰酶終濃度為1μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL和75 μg/mL這10個濃度進(jìn)行PEDV的培養(yǎng),結(jié)果表明當(dāng)胰酶濃度在50 μg/mL及以上時,PEDV無法進(jìn)行培養(yǎng)。達(dá)到該濃度時可以觀察到細(xì)胞拉網(wǎng)成堆,很難觀察出病變。在胰酶終濃度1~25 μg/mL之間,都適合PEDV的培養(yǎng),但是在胰酶終濃度為2.5 μg/mL時,我們測得PEDV的病毒滴度高于其他組的病毒滴度。

    本實驗對不同吸附時間對病毒滴度的影響進(jìn)行了研究,分別設(shè)立了0.5 h、1 h、1.5 h和2 h 4個時間點。結(jié)果表明,吸附時間為1.5 h,病毒的滴度最高,到2 h時病毒的滴度反而有所下降,但是下降不明顯。這可能是由于吸附時間過長,導(dǎo)致一些狀態(tài)不好的細(xì)胞貼在了培養(yǎng)瓶底部,因此影響了病毒的滴度。本實驗還研究了不同培養(yǎng)方式對病毒滴度的影響,分別采用棄吸附液和留吸附液兩種方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用棄吸附液的培養(yǎng)方式PEDV的病毒滴度明顯比留吸附液的培養(yǎng)方式要高。這可能是由于在吸附液中存在一些感染能力較弱的病毒,當(dāng)棄去吸附液后,感染能力較弱的病毒也隨之棄去,那么感染細(xì)胞能力較強(qiáng)的病毒就會吸附在細(xì)胞上。如果留吸附液,對于感染能力較弱的病毒便會留在吸附液中,繁殖幾代后便失去感染細(xì)胞的能力,從而影響了病毒的滴度。

    [1] 周靚靚,孫心,吳蕾. 豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉疫苗病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2014,39(6):33-35.

    [2] 王琳,邢育鋼,李繼昌. 豬流行性腹瀉病毒疫苗株在Vero細(xì)胞中繁殖條件的優(yōu)化[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè),2014(11):3-4.

    [3] 王靚靚,李訓(xùn)良,李鵬沖,等. 豬流行性腹瀉的診斷與預(yù)防[J].世界華人消化雜志,2013,21(1):33-38.

    [4] HOFMANN M,WYLER R.Propagation of the virus of PED in ce11 cu1ture[J].J C1in Microbio1,1988,26:2235-2239.

    [5] 郝偉偉,邱文英,徐靜,等.豬流行性腹瀉病毒SZ株的分離與鑒定[J].福建畜牧獸醫(yī),2012,34(6):1-3.

    [6] 毛雅元,張桂紅,葛俊偉,等.豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/ 03分離及培養(yǎng)特性[J].病毒學(xué)報,2010,26(6):483-489.

    2016-07-17)

    黑龍江省高??萍紕?chuàng)新團(tuán)隊基金資助項目(2011TD001)

    王靚靚(1987-),女,黑龍江哈爾濱人,獸醫(yī)師,獸醫(yī)碩士,主要從事工作:動物衛(wèi)生監(jiān)督和疫病防控。E-mail:383456366@qq.com 聯(lián)系電話:18345587338

    白會新(1986-),男,黑龍江望奎人,畜牧師,博士,研究方向:分子營養(yǎng)學(xué)與免疫學(xué)。E-mail:dqxmjbhx@163.com

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