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    黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA表達(dá)的影響

    2016-11-29 02:24:35李芊綿王超范越田明李芳高士平國紫薇
    中醫(yī)藥信息 2016年5期
    關(guān)鍵詞:五物桂枝黃芪

    李芊綿, 王超,范越,田明,李芳,高士平,國紫薇

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

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    黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA表達(dá)的影響

    李芊綿, 王超,范越*,田明,李芳,高士平,國紫薇

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

    目的:觀察黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)大鼠坐骨神經(jīng)組織中生長因子(NGF)和血管內(nèi)皮因子(VEGF)mRNA表達(dá)的影響,初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN的機(jī)制。 方法:采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)制備大鼠糖尿病模型,用黃芪桂枝五物湯連續(xù)灌胃8周,分離坐骨神經(jīng)組織,采用半定量PCR法測定大鼠坐骨神經(jīng)中NGF mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果:黃芪桂枝五物湯能顯著提高NGF mRNA的表達(dá)量,降低VEGF mRNA的表達(dá),與模型對照組比較有顯著性差異。結(jié)論:黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用可能與加強(qiáng)NGF mRNA表達(dá),減少代償性VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。

    黃芪桂枝五物湯;糖尿病周圍神經(jīng)病變;NFG mRNA;VRGF mRNA

    糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一,根據(jù)其臨床表現(xiàn),中醫(yī)將其歸為“血痹”“脈痹”范疇[1]。黃芪桂枝五物湯是治療血痹證的代表方劑,出自《金匱要略》卷上,由黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗組成,具有益氣通絡(luò)、和血通痹之效,中醫(yī)臨床常用于治療DPN[2-4]?,F(xiàn)代研究表明,DPN發(fā)病機(jī)制與生長因子合成和異常代謝途徑有關(guān)[5-6]。本文通過黃芪桂枝五物湯對大鼠糖尿病模型NGF、VEGF神經(jīng)因子mRNA表達(dá)量的研究,初步探討黃芪桂枝五物湯治療DPN的機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動物

    健康SD大鼠100只,雄性,體質(zhì)量200~250 g(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心提供)。

    1.2 藥物

    黃芪桂枝五物湯由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自制,規(guī)格:含生藥1 g/ml; 甲鈷胺片,日本衛(wèi)才(中國)藥物有限公司,0.5 mg/片,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20030812。

    1.3 試劑

    鏈脲佐菌素(德國Sigma公司);M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司); DEPC(Sigma公司);Trizol 試劑盒(Invitrogen公司);SYBR PrimeScript RT-PCR 試劑盒(Takara公司)。

    1.4 儀器

    普通PCR儀(美國MJ,PTC-100);凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP,GelDoc-It);酸度計(美國Orion,310P-02);精密天平(瑞士Mettler-Toledo,AB265-S);紫外分光光度計(日本島津,UV-2401);超純水儀(美國Millipore,Milli-Q);熒光定量PCR儀(美國AB,ABI-7500);低溫冰箱(日本SANYO,MDF-382E);制冰機(jī)(美國Grant,XB70);高速低溫離心機(jī)(德國Sigma,3-18K)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 DPN大鼠模型的制備及分組

    取SD大鼠100只,造模前隨機(jī)選取出15只,作為正常對照組,剩余大鼠腹腔注射STZ 70 mg/kg(由0.1 mol/ml檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制),72 h后測定血糖變化,血糖≥16.7 mmol/L大鼠歸為模型組,編號,分別檢測動物坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度,正常對照組與模型組分籠飼養(yǎng),自由飲水和進(jìn)食。10周后,再分別檢測模型組動物坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度,與之前比較,軸突縮小、神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低、結(jié)周脫髓鞘者歸為DPN模型組,共計45只。將45只DPN模型大鼠隨機(jī)均分為黃芪桂枝五物湯組(HQG)、彌可保組(MKB)、模型組,每組15只。給予灌胃給藥:HQG組5 g/(kg·d);彌可保170 μg/(kg·d),模型組給予等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)過程中大鼠自由飲水和進(jìn)食,連續(xù)灌胃給藥8周后,分別處死,分離坐骨神經(jīng)組織,迅速置于液氮中并保存于-80℃冰箱。

    2.2 RNA提取

    取坐骨神經(jīng)組織置于研缽中充分研磨,取100 mg組織中加入Trizol試劑1 ml,室溫靜置5 min,加入氯仿0.2 ml,充分振蕩15 s,并在室溫條件下靜置3 min。4℃ 12000 rpm離心15 min。取上清,移至新管并加入異丙醇0.5 ml,輕輕混勻,靜置10 min后,室溫12000 rpm離心10 min后棄上清。向沉淀中加入75%乙醇1 ml ,輕輕混勻。4℃ 7500 rpm離心5 min后棄上清將RNA樣品涼干,加入無RNA酶水20 μL溶解。

    2.3 cDNA合成

    經(jīng)25 μL 反轉(zhuǎn)錄體系:RNA 3 μL,Oligo(dT) 1 μL,dd H2O(DEPC 處理)9.5 μL,以上首先70℃孵育5 min,然后迅速放在冰上。5×Buffer 5 μL,d NTP(10 mmol/L)5 μL,Ribonuclease inhibitor 0. 5 μL,M-MLV RT 1 μL。以上 42℃ 孵育 60 min,然后 70℃ 10 min,將所得的cDNA 保存于-80℃低溫冰箱中備用。

    2.4 半定量PCR測定NGF mRNA和VEGF mRNA表達(dá)[7]

    采用半定量PCR法檢測坐骨神經(jīng)NGF mRNA和VEGF mRNA的表達(dá)。以軟件Primer5.0設(shè)計引物并進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參基因通過半定量PCR法測定NGF mRNA與VEGF mRNA表達(dá)。引物序列:NGF擴(kuò)增引物:上游5′CAC TCT GAG GTG CAT AGC GT 3′,下游5′GCT TCA GGG ACA GAG TCT CC3′;VEGF擴(kuò)增引物:上游5′CAT GCG GAT CAA ACC TCA CC3′下游5′TCA CCG CCT TGG CTT GTC AC3′;β-actin擴(kuò)增引物:上游::5 ′CAT TGC TGA CAG GAT GCA GAA G 3′ ,下游:5 ′GAG CCA CCA ATC CAC ACA GAG T3′。在PCR擴(kuò)增體系中,依次加入下列試劑:cDNA 2.0 μL、SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μL、PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μL、ROX Reference Dye ∏(50×) 0.4 μL、滅菌蒸餾水6.8 μL。

    PCR擴(kuò)增程序:變性 94℃ 30 s;退火 65℃ 35 s;延伸 72℃ 70 s,總計循環(huán) 30次。最后 1次72℃時延伸 10 min。收集反應(yīng)過程中熒光,反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)開始儀器設(shè)定的閾值,計算每份樣品中NGF mRNA與VEGF mRNA達(dá)到閾值時的Ct值,計算得出相對原始濃度,使用內(nèi)參基因進(jìn)行矯正,進(jìn)而得出每份樣品中NGF mRNA與VEGF mRNA相對表達(dá)含量。

    3 結(jié)果

    3.1 統(tǒng)計學(xué)處理

    3.2 黃芪桂枝五物湯對大鼠坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達(dá)的影響

    結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)期間,有部分大鼠死亡,但減少數(shù)量在實(shí)驗(yàn)允許范疇內(nèi)。由表一數(shù)據(jù)得知,模型組大鼠坐骨神經(jīng)NGF mNRA表達(dá)明顯低于正常組(P<0.05);HQG組、MKB組的mRNA表達(dá)高于模型組(P<0.05),但低于正常組(P<0.05)。

    表1 各組大鼠NGF mRNA表達(dá)的比較

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與MKB組比較,&P<0.05。

    3.3 黃芪桂枝五物湯對大鼠坐骨神經(jīng)VEGF mRNA表達(dá)的影響

    由表2數(shù)據(jù)得知,模型組大鼠坐骨神經(jīng)VEGF mRNA表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05);HQG組、MKB組表達(dá)低于模型組(P<0.05),但顯著高于正常組(P<0.05)。

    表2 各組大鼠VEGF mRNA表達(dá)的比較

    注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與MKB組比較,&P<0.05。

    4 討論

    在神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成與表達(dá)若是降低,會直接導(dǎo)致神經(jīng)元和雪旺氏細(xì)胞[5]的生理功能減弱,進(jìn)而誘發(fā)DPN各類癥狀。NGF作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,存在于部分感覺神經(jīng)元及交感神經(jīng)元所在的細(xì)胞組織內(nèi),能夠有針對性的保護(hù)、修復(fù)、再生神經(jīng)元,抑制神經(jīng)元凋亡,具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育、分化等生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),DPN模型大鼠血液或者組織中NGF mRNA表達(dá)量通常降低。本研究中,模型組大鼠坐骨神經(jīng)中NGF mRNA表達(dá)相對量大幅降低,而黃芪桂枝五物湯組與彌可保組較模型組顯著升高,提示黃芪桂枝五物湯可通過促使神經(jīng)因子表達(dá)進(jìn)而保護(hù)、修復(fù)與再生周圍神經(jīng)。

    VEGF既是血管通透性因子,也是誘導(dǎo)血管生長與形成、內(nèi)皮細(xì)胞增值與遷移的多功能因子。具有促進(jìn)軸突生長;提升神經(jīng)元、雪旺氏細(xì)胞存活率;促進(jìn)神經(jīng)內(nèi)血管與神經(jīng)再生等作用[8-11]。研究發(fā)現(xiàn),治療過程中VEGF mRNA表達(dá)升高,推測由于高糖環(huán)境下VEGF發(fā)揮營養(yǎng)因子保護(hù)作用而代償性增加。 本研究中,模型組大鼠坐骨神經(jīng)中VEGF mRNA表達(dá)相對量大幅升高,而黃芪桂枝五物湯組與彌可保組較模型組低,提示黃芪桂枝五物湯能抑制神經(jīng)組織損傷,不需更多代償性的VEGF mRNA的表達(dá),減輕了DPN損害程度。

    綜上研究認(rèn)為,黃芪桂枝五物湯對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護(hù)作用可能與加強(qiáng)NGF mRNA表達(dá)與減少代償性VEGF mRNA表達(dá)有關(guān)。改變大鼠坐骨神經(jīng)組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)含量,可能是黃芪桂枝五物湯治療DPN機(jī)制之一。

    [1] 栗明,丁常宏,方芳,等.糖尿病周圍神經(jīng)病變的中醫(yī)藥治療進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2012,40(6):133-136.

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    [3] 王紅,韓兆瑩,呂佳奇, 等.黃芪桂枝五物湯臨床應(yīng)用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2014,42(1):105-107.

    [4] 李冀,孫新雨,畢珺輝,黃芪桂枝五物湯的臨證應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報,2014,42(5):108-111.

    [5] 何晶,丁文龍.雪旺氏細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用及其分子機(jī)制[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2005,11(4):367-372.

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    黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.H2015047)

    李芊綿(1991-),女,碩士研究生,主要研究方向:中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與新藥研發(fā)。

    范越*(1961-),女,編審,主要研究方向:醫(yī)藥文獻(xiàn)研究。

    2016-03-31

    R285.5

    A

    1002-2406(2016)05-0042-03

    修回日期:2016-04-15

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