腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

李 萍 鄧 飛 周 薇 陶靜莉 王 艷

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院病理科 深圳 518000

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腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

李 萍 鄧 飛 周 薇 陶靜莉 王 艷

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院病理科 深圳 518000

目的 探究腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，觀察其對腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中的研究價(jià)值。方法 選取2007-05—2012-03在河北省人民醫(yī)院就診的76例膠質(zhì)瘤患者和24例腦組織正?；颊撸瑢ζ洳捎脤?shí)時(shí)定量PCR和微陣列芯片法(microarray chip)檢測微小RNA-184表達(dá)，同時(shí)對膠質(zhì)瘤患者的無病生存期及總生存期情況采用乘法極限估計(jì)法(Kaplan-Meier)進(jìn)行分析。結(jié)果 膠質(zhì)瘤患者石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)下降，采用實(shí)時(shí)定量PCR對其進(jìn)一步驗(yàn)證。KPS評分、WHO分級、生存時(shí)間及復(fù)發(fā)時(shí)間與微小RNA-184的低表達(dá)顯著相關(guān)。乘法極限估計(jì)法分析結(jié)果顯示，微小RNA-184高表達(dá)患者的無病生存期和總生存期與微小RNA-184低表達(dá)患者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多因素分析結(jié)果表明，微小RNA-184的表達(dá)差異是預(yù)測無病生存期和總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后和微小RNA-184的表達(dá)密切相關(guān)，在預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后情況中微小RNA-184可作為獨(dú)立的標(biāo)志物。

微小RNA-184；膠質(zhì)瘤；臨床病理；實(shí)時(shí)定量PCR

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最為常見的一種腫瘤，放化療和手術(shù)對其均起不到理想效果，患者預(yù)后情況較差。目前，對于膠質(zhì)瘤的研究熱點(diǎn)主要體現(xiàn)在尋找其有效的靶標(biāo)分子及預(yù)后標(biāo)志物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，舌鱗狀細(xì)胞癌、混合性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)上皮細(xì)胞腫瘤、星形細(xì)胞瘤等腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與微小RNA-184密切相關(guān)[2]。然而腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系仍少見報(bào)道。為此，本研究觀察了微小RNA-184在正常腦組織及膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，分析微小RNA-184與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 病例選擇 選取2007-05—2012-03在我院就診的76例腦膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織患者為研究對象，年齡20～75歲。入選患者均經(jīng)病理證實(shí)并首次進(jìn)行手術(shù)治療，術(shù)前均未行放化療。76例患者年齡(50.7±4.2)歲，男60例，女16例。卡氏評分<80分59例，≥80分17例。根據(jù)2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對患者的腫瘤組織分級，其中Ⅰ級8例，Ⅱ級17例，Ⅲ級35例，Ⅳ級16例。同時(shí)選取24例行腦外傷行內(nèi)減壓的正常腦組織患者為對照。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。

1．2 RNA的濃度測定 采用Trizol法從腦組織中提取總RNA，抽提試劑由北京索萊寶科技有限公司提供，使用ND2000超微量分光光度計(jì)對總RNA濃度進(jìn)行測定，儀器由北京科爾德科貿(mào)有限公司提供。RNA提取及濃度測定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1．3 微小RNA微陣列芯片法檢測 為研究正常腦組織和膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中選取4例正常腦組織和4例膠質(zhì)瘤的石蠟包埋組織，使用晶芯微陣列芯片掃描儀(博奧生物有限公司)進(jìn)行檢測。根據(jù)操作說明進(jìn)行掃描、洗滌、加多聚A尾、染色、雜交等操作。采用Affymetrix基因芯片技術(shù)對陣列圖像進(jìn)行分析以便獲得原始數(shù)據(jù)，選擇GeneSpring基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。探針含有所有樣品均有的基團(tuán)必須≥1，使用“P”進(jìn)行標(biāo)識用作更精確的數(shù)據(jù)分析。比較P值能夠確定微小RNA的表達(dá)差異，基因上調(diào)及下調(diào)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)是P≤0.05。

1．4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測微小RNA-184表達(dá) 為了對微陣列芯片法分析中微小RNA表達(dá)變化進(jìn)行驗(yàn)證，采用實(shí)時(shí)定量PCR對正常腦組織及膠質(zhì)瘤中微小RNA-184表達(dá)進(jìn)行檢測，內(nèi)參選用RUN6B。微小RNA-184和RUN6B的引物由上海華津生物科技有限公司合成。

1．5 隨訪情況 從接受手術(shù)日起，對受試者進(jìn)行每3月一次的定期隨訪，隨訪資料同步更新。末次隨訪時(shí)間為2015-06-24。其中6例由于聯(lián)系方式發(fā)生變化而導(dǎo)致失訪，其余70例隨訪時(shí)間為7～30個(gè)月。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。采用秩和檢驗(yàn)或曼-惠特尼U檢驗(yàn)對微小RNA-184表達(dá)和臨床病理特征間的關(guān)系進(jìn)行分析。采用時(shí)序檢驗(yàn)和乘法極限估計(jì)法分析生存曲線。采用Cox分析多因素和單因素，對生存期和臨床病理特征的相關(guān)性評價(jià)選用HR和CI。α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測微小RNA-184表達(dá) 對24例正常腦組織和76例膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184的表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，微小RNA-184在正常腦組織的相對表達(dá)量為(7.31±1.79)，膠質(zhì)瘤為(2.84±0.85)，2組微小RNA-184的表達(dá)量比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2．2 微陣列芯片分析結(jié)果 選取4例正常腦組織和4例膠質(zhì)瘤的石蠟包埋組織進(jìn)行微陣列芯片分析，分析結(jié)果表明膠質(zhì)瘤中微小RNA-184的表達(dá)下調(diào)，與實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果一致(P<0.05)。

2．3 臨床病理特征與微小RNA-184表達(dá)的相關(guān)性 對臨床病理變量及微小RNA-184的表達(dá)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，KPS評分、生存時(shí)間、WHO分級和復(fù)發(fā)時(shí)間與微小RNA-184表達(dá)之間存在明顯的相關(guān)性，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2．4 總生存期和無病生存期與微小RNA-184的關(guān)系 分析性別、年齡、腫瘤大小、輔助治療、WHO分級等影響因素，觀察膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織中微小RNA-184表達(dá)的對患者預(yù)后作用。見表2。時(shí)序檢驗(yàn)結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤微小RNA-184低表達(dá)患者無病生存期較高表達(dá)患者更短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；膠質(zhì)瘤微小RNA-184低表達(dá)患者總生存期較高表達(dá)患者更短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對無病生存期和總生存期進(jìn)行多因素回歸分析，結(jié)果表明，KPS評分、WHO分級和微小RNA-184的表達(dá)與總生存期具有明顯相關(guān)性。WHO分級、微小RNA-184表達(dá)和KPS評分與無病生存期具有明顯相關(guān)性。見表3。

表2 單因素Cox分析膠質(zhì)瘤患者的無病生存期和總生存期

表3 多因素Cox分析膠質(zhì)瘤患者的無病生存期和總生存期

3 討論

微小RNA是一種非編碼RNA，長度約為22個(gè)核苷酸。微小RNA對蛋白的合成具有抑制作用，從而能有效發(fā)揮自身的生物學(xué)功能。通常惡性腫瘤患者的微小RNA會出現(xiàn)功能失調(diào)，這表明肺癌、膠質(zhì)瘤及乳腺癌等惡性腫瘤與其功能失調(diào)具有密切聯(lián)系[3]。

隨著腫瘤相關(guān)微小RNA的研究逐漸增多，腦膠質(zhì)瘤中微小RNA的作用及分布也逐漸被越來越多的人所了解，膠質(zhì)瘤組織中的微小RNA表達(dá)異常，干細(xì)胞生成、細(xì)胞存活、分化及腫瘤血管生成等膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為與微小RNA的異常表達(dá)密切相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的miR-222、miR-21等23種微小RNA表達(dá)上調(diào)；而miR-128、miR-7等34種則下調(diào)[5]。本次研究中采用微陣列芯片法對膠質(zhì)瘤中微小RNA-184的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腦組織中微小RNA的表達(dá)高于膠質(zhì)瘤，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR法對微陣列芯片法的檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩種不同的方法檢驗(yàn)結(jié)果相一致。這提示膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展可能與微小RNA-184表達(dá)下調(diào)有關(guān)。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)總生存期、WHO分級、復(fù)發(fā)時(shí)間及KPS評分等因素與膠質(zhì)瘤中微小RNA-184的表達(dá)具有密切聯(lián)系，這表明膠質(zhì)瘤中微小RNA-184可能具有抑制作用。微小RNA-184能夠?qū)Φ蛲銮盎蚣耙职┗虻榷喟悬c(diǎn)起到調(diào)節(jié)效果，從而產(chǎn)生癌基因作用；其能夠?qū)Π饧?xì)胞起靶向結(jié)合作用，調(diào)節(jié)激酶1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’UTR，抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1蛋白的產(chǎn)生，從而對膠質(zhì)瘤增殖發(fā)揮抑制效果。通過本次研究，微小RNA-184的內(nèi)在機(jī)制可能是：(1)微小RNA-184低表達(dá)能夠作用于靶基因從而對細(xì)胞生長起到促進(jìn)作用并提高其生存能力；(2)微小RNA-184低表達(dá)能夠?qū)Π谢蛏险{(diào)，對膠質(zhì)瘤的侵襲性具有促進(jìn)作用[6]。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤的進(jìn)展可能與特定微小RNA表達(dá)異常有關(guān)，通過對微小RNA-184檢測能夠?qū)δz質(zhì)瘤的預(yù)后起到預(yù)測作用[7]。本次研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-184表達(dá)水平越高其預(yù)后也越好，同時(shí)Cox回歸分析表明，不良無病生存期和總生存期密切相關(guān)的預(yù)后因素是微小RNA-184的低表達(dá)，從而能夠證實(shí)在預(yù)測膠質(zhì)瘤的預(yù)后中可以將其作為分子標(biāo)志物。其機(jī)制可能是微小RNA-184能夠?qū)?xì)胞生存產(chǎn)生抑制作用，而當(dāng)微小RNA-184表達(dá)下調(diào)時(shí)就能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長，進(jìn)而使得患者的預(yù)后較差[8]。

綜上所述，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后和微小RNA-184的表達(dá)密切相關(guān)，在預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中微小RNA-184可作為獨(dú)立的標(biāo)志物。

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(收稿2016-04-02)

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1673-5110(2016)21-0059-03