慢性HBV感染HBsAg含量與T、B淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞相關(guān)性

聶 琳，楊麗莎，彭德珍，張 敏，王君宜

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◇臨床醫(yī)學(xué)研究◇

慢性HBV感染HBsAg含量與T、B淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞相關(guān)性

聶 琳1，楊麗莎2，彭德珍3，張 敏1，王君宜1

目的 探討慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染免疫不全狀態(tài)(非活動期)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)含量與外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的相關(guān)性。方法 收集慢性HBV感染免疫不全狀態(tài)(非活動期)者34例、健康者20例，采用流式細(xì)胞儀檢測其外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞百分比，實時熒光探針定量-聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)方法檢測HBsAg的含量。結(jié)果 HBsAg的含量與B淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)性(P<0.05)，高HBsAg含量組的B淋巴細(xì)胞高于健康組與低HBsAg含量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞無相關(guān)性。結(jié)論 在慢性HBV感染免疫不全狀態(tài)(非活動期)的人群中，HBsAg含量在一定程度上能反映患者的免疫狀態(tài)，外周血淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞檢測對于了解患者免疫狀態(tài)有一定的臨床價值。

乙肝病毒表面抗原含量；T淋巴細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；免疫不全狀態(tài)(非活動期)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是全球性的健康問題。而乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)作為乙肝病毒的包膜蛋白是HBV感染的標(biāo)志，在感染者體內(nèi)大量存在，作為人體的異種蛋白，其持續(xù)存在對人體的作用了解的并不多?！堵砸倚透窝追乐沃改?2010)年版》將嬰幼兒時期HBV感染的自然史分為4個時期：免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低(非)復(fù)制期、再活動期，但并不是所有的HBV感染者都經(jīng)歷以上時期[1]。該實驗通過檢測非活動期的HBV感染人群的外周血T、B細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的百分比以及HBsAg含量，了解HBsAg含量對人體的免疫作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2014年9月～2015年2月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診體檢的免疫不全狀態(tài)(非活動期)者34例，其中男 20 例，女 14 例，年齡21～59(36.88±11.45)歲。正常對照組20例，男12例，女8例，年齡18～50(35.42±8.27)歲，均為健康獻(xiàn)血員?；颊吣挲g、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 研究對象納入、排除及分組情況

1.2.1 研究對象納入標(biāo)準(zhǔn) 選擇在門診體檢的慢性HBV感染不同免疫狀態(tài)(非活動期)人群，診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[1]中非活動或低(非)復(fù)制期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。免疫不全狀態(tài)(非活動期)：血清HBV標(biāo)志物HBsAg、抗-HBe、 抗-HBc陽性，肝功能谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT(基本正常，HBV-DNA低于檢測下限，1年內(nèi)連續(xù)3次以上肝功能ALT均在正常范圍。所有的參與者未接受過抗病毒治療和免疫治療。所有受試者簽署了自愿參加臨床科研實驗的知情同意書。

1.2.2 研究對象排除標(biāo)準(zhǔn) ① 排除其他類型肝炎病毒感染；② 近期無服用影響免疫等藥物情況；③ 已明確診斷為肝硬化、肝癌者；④ 合并心、腦、腎、肺功能障礙及糖尿病等已明確的疾病診斷；⑤ 無自身免疫性疾病史、嗜酒史及肝毒性藥物使用史；⑥ 近期無致病的細(xì)菌病毒感染等疾病。

1.3 方法

1.3.1 檢測HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb) 采用時間分辨免疫熒光分析法，儀器為上海新波生物技術(shù)有限公司ANY-TEST2000時間分辨儀。

1.3.2 定量檢測HBV-DNA 采用實時熒光探針定量-聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)方法,儀器為MJ Opticon Monitor 實時熒光定量 PCR 儀(美國MJ Research公司)。

1.3.3 血細(xì)胞分析 采用全自動血液分析儀進(jìn)行分析。

1.3.4 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測方法 采用四色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)進(jìn)行分析。實驗試劑：四色淋巴細(xì)胞亞群試劑、溶血素、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血。主要儀器：采用美國Beckman Coulter公司的EPICS-xL流式細(xì)胞儀。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，用Spearman以及Pearson相關(guān)分析方法分析HBsAg定量與免疫細(xì)胞之間關(guān)系以及各免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，用t檢驗分析免疫不全狀態(tài)(非活動期)組與健康人群的免疫細(xì)胞百分比差異，統(tǒng)計學(xué)顯著檢驗水準(zhǔn)為0.05(雙側(cè))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，用方差分析法分析高含量組與低含量組及健康組間的差異，統(tǒng)計學(xué)顯著檢驗水準(zhǔn)為0.05(雙側(cè))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組與健康人群的T、B淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分比 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組的T、B淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞百分比與健康組的T、B淋巴細(xì)胞亞群以及NK細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組和健康組T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比

2.2 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組的HBsAg定量與T、B淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分比之間的相關(guān)性 HBsAg與B淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)性，Spearman相關(guān)系數(shù)為rs=0.37；在置信區(qū)間(雙側(cè))為0.05時，相關(guān)性顯著(P<0.05)。在置信區(qū)間(雙側(cè))為0.05時，與T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分比無明顯相關(guān)性。高、中、低含量組及健康組B淋巴細(xì)胞百分比分別為(13.44±3.64)、(11.61±1.72)、(10.78±3.51)、(10.52±2.67)。高含量組B淋巴細(xì)胞百分比與低含量組以及健康組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.87，P<0.05)。

2.3 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組的T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比之間的關(guān)系 免疫不全狀態(tài)(非活動期)組CD3+細(xì)胞與CD56+細(xì)胞之間呈負(fù)相關(guān)性，Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.886,在置信區(qū)間(雙側(cè))為0.05時，相關(guān)性顯著(P<0.05)。其他免疫細(xì)胞之間無相關(guān)性。

3 討論

1968年Blumberg et al[2]首次報道了HBsAg是HBV感染的標(biāo)志物。從確定其為乙型肝炎的病毒標(biāo)志物以來,人類與乙肝病毒的斗爭已經(jīng)持續(xù)了40余年。乙肝病毒抗體至少有3個系統(tǒng)，即HBsAg系統(tǒng)(HBsAg和抗HBs)、核心抗原抗體系統(tǒng)(HBcAg和抗HBc)、e抗原抗體系統(tǒng)(HBeAg和抗HBe)；HBV表達(dá)的HBsAg和HBeAg都是胸腺依賴性抗原，而HBcAg是胸腺依賴性及非胸腺依賴性抗原[3]。因此，HBV感染患者雖然細(xì)胞免疫低下，體內(nèi)任然可出現(xiàn)抗HBc，但很少出現(xiàn)抗HBe或抗HBs。臨床病程中當(dāng)患者HBeAg陰轉(zhuǎn)的同時出現(xiàn)抗HBe則提示機(jī)體的細(xì)胞免疫有所好轉(zhuǎn)。但是e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者極少出現(xiàn)HBsAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，而且很多的肝硬化、肝癌患者也都是小三陽人群，病毒的復(fù)制并不高，人體的細(xì)胞免疫也大致恢復(fù)了，可是有些患者的身體狀況卻更差了，因此持續(xù)存在的HBsAg對人體作用的重要性顯而易見。

一些學(xué)者對HBsAg做了一些相關(guān)的研究，在HBsAg定量方面：首先，HBsAg定量與HBV DNA聯(lián)用可以識別非活動性攜帶者。Brunetto et al[4]分析了意大利209例未治療和無癥狀的攜帶者發(fā)現(xiàn)：HBsAg<1 000 IU/ml和HBV DNA<2 000 IU/ml能識別3年非活動狀態(tài)診斷的正確率是94.3%，敏感性91.1%，特異性95.4%，陽性預(yù)測值87.9%,陰性預(yù)測值96.7%。本研究對象的選擇正是這樣的未治療、無癥狀、復(fù)制陰性的小三陽人群，盡量的排除DNA復(fù)制、藥物、e抗原等對免疫的作用從而觀察HBsAg含量對免疫的影響。

研究[5]顯示在HBeAg陰性且HBV DNA<2 000 IU/ml時，決定肝細(xì)胞癌(HCC)的因素包括性別、年齡、ALT水平、HBsAg≥1 000 IU/ml，HBsAg>1 000 IU/ml成為了在e抗原陰性、DNA低復(fù)制的人群中預(yù)測肝癌的重要指標(biāo)。肝癌的發(fā)生與乙肝病毒有著密切的聯(lián)系，目前的大多數(shù)觀點認(rèn)為，免疫介導(dǎo)的損傷是HBV感染肝細(xì)胞損害的主要原因[6-7]。免疫作用在HBV感染以及肝炎的發(fā)生過程中扮演著“雙刃劍”的角色[8-9]。理想的免疫應(yīng)答可通過中和病毒顆粒、清除被感染細(xì)胞以及抑制病毒復(fù)制等方式對抗病毒入侵；而不理想者，免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致部分慢性HBV感染患者的肝細(xì)胞損傷和壞死,持續(xù)性的損傷可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等病變。在本實驗中研究對象與健康對照組人群的T、B淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于本實驗的樣本數(shù)較少，存在誤差，同時可能與選擇的實驗人群是健康的攜帶者有關(guān)。

眾所周知，B淋巴細(xì)胞經(jīng)過抗原的刺激后可以產(chǎn)生抗體，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用，HBV的抗原系統(tǒng)均能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，但是中和抗體只針對病毒的包膜蛋白，迄今為止，最明確的具有中和病毒作用的保護(hù)型抗體是抗HBs。在本實驗中乙肝HBsAg含量與B淋巴細(xì)胞有明顯的相關(guān)性，高含量組的B淋巴細(xì)胞與低含量組和健康組方差分析是有統(tǒng)計學(xué)差異的，經(jīng)LSD兩兩對比是有意義的。因此，推測乙肝HBsAg的持續(xù)存在刺激著B細(xì)胞的增殖分化，但是B細(xì)胞的功能不足以產(chǎn)生抗HBs，從而清除HBsAg。因此在臨床中很多的患者不會發(fā)生HBsAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換。而有報道[10]顯示北京協(xié)和醫(yī)院肝外科醫(yī)師認(rèn)為，根據(jù)我國的臨床經(jīng)驗，大部分乙肝相關(guān)性肝癌患者在最初確診時，多為丙氨酸轉(zhuǎn)移酶正常的小三陽患者，不應(yīng)忽略乙肝小三陽與肝癌的關(guān)聯(lián)性。這部分患者恰恰因為其乙肝相關(guān)檢查多為正?；蛘哧幮远钊菀妆缓雎裕麄冊谂R床上的受重視程度遠(yuǎn)低于大三陽、活動性肝炎患者。如此多的肝硬化、肝癌患者是小三陽人群，推測一方面可能是由于乙肝病毒攜帶多年，在人體免疫系統(tǒng)的作用下，病毒會發(fā)生e抗原血清學(xué)的轉(zhuǎn)換，但是需要的時間長，機(jī)體免疫系統(tǒng)長期的與HBV對抗過程會使機(jī)體處于消耗狀態(tài)，最終發(fā)展為嚴(yán)重疾病。另一方面，在乙肝病毒攜帶的小三陽人群中，可能是由于乙肝HBsAg的持續(xù)存在，刺激免疫系統(tǒng)，機(jī)體需要更多的能量去產(chǎn)生更多的體液免疫細(xì)胞，以期望達(dá)到HBsAg的清除。對于肝硬化、肝癌的人群來說，推測可能是由于體液免疫的長期激活狀態(tài)消耗了機(jī)體的物質(zhì)能量，機(jī)體逐漸虛弱而發(fā)生更嚴(yán)重的疾病。臨床上的治療很多都以e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換作為停藥的指標(biāo)，然而當(dāng)停止治療的時候，也不能忽視患者機(jī)體還在進(jìn)行的戰(zhàn)斗，應(yīng)該在還未發(fā)生更嚴(yán)重的疾病之前在免疫方面做一些相關(guān)工作。

CD3分子是所有T淋巴細(xì)胞的共同標(biāo)志，T淋巴細(xì)胞是一類重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，CD56是人NK細(xì)胞最有價值的表面標(biāo)志之一，NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者，參與非特異免疫，可以抑制殺傷腫瘤，也能殺傷病毒感染的靶細(xì)胞，同時它對T細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞等均有調(diào)節(jié)作用，并通過釋放細(xì)胞因子(INF-α、INF-γ和IL-2)對機(jī)體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[11]。權(quán)衡和平衡是免疫系統(tǒng)運行的基本策略，生物體在一生中經(jīng)歷無數(shù)次的斗爭和變化，免疫系統(tǒng)經(jīng)受無數(shù)次的權(quán)衡和平橫，一邊倒似的勝利并不多，更多的是權(quán)衡處理，以求體內(nèi)的平橫[12]。本實驗顯示在免疫不全狀態(tài)組CD3+細(xì)胞與CD56+細(xì)胞之間存在負(fù)相關(guān)性，可以用機(jī)體的免疫細(xì)胞之間存在的互相權(quán)衡，已到達(dá)平橫的觀點來解釋，同時也可以證明上段提出的假設(shè)，機(jī)體在長期制造更多地體液免疫細(xì)胞的同時也會引起機(jī)體的另一些細(xì)胞或者一些物質(zhì)、能量的減少，帶來的結(jié)果可能是不好的。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會,中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中國病毒病雜志, 2011, 1(1):9-23.

[2] Blumberg B S,Sutnick A I,London W T.Hepatitis and Leukemia：their relation to Australia antigen[J].Bull N Y Acad Med,1968,44(12):1566-86．

[3] 陳紫榕.病毒性肝炎(第2版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2012：92.

[4] Brunetto M R,Oliveri F,Colombatto P,et al.Hepatitis B surface antigen serum levels help to distinguish active from inactive hepatitis B virus genotype D carrriers[J].Gastroenterology,2010 139(2):483-90.

[5] Tseng T C，Liu C J，Yang H C，et al.High levels of hepatitis B surface antigen increase risk of hepatocellular carcinoma in patients with low HBV load[J].Gastroenterology,2012,142(5):1140-9.

[6] Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J]. Nat Rev Immunol, 2005,5(3):215-29.

[7] Wang F S,Zhang Z.Host immunity influeneces disease progression and antiviral efficacy in humans infected with hepatitis B virus[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2009,3(4):499-512.

[8] 于新蕾,許金波.乙型肝炎病毒與宿主天然免疫間相互作用[J].軍事醫(yī)學(xué),2011,35(4):310-4.

[9] 李樹龍,姜 穎,賀福初.乙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2006,30(4):580-3.

[10]陳明雁，趙海濤. 乙肝小三陽患者罹患肝癌可能性不容忽視[EB/OL].( 2009-09-18 ). http://www.jkb.com.cn/news/industryNews/2009/0918/159873.html

[11]竇肇華，張遠(yuǎn)強(qiáng)，郭順根.免疫細(xì)胞學(xué)與疾病[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2004,6:115-7.

[12]吳克復(fù).免疫的細(xì)胞社會生態(tài)學(xué)原理[M].北京：科學(xué)出版社，2012(生命科學(xué)前沿):92-5.

Nie Lin1,Yang Lisha2, Peng Dezhen3, et al

Association between HBsAg levels and T, B lymphocyte subsets or NK cells in chronic HBV infected patients

(1Dept of Gastroenterology,2Dept of Traditional Chinese Medicine,3Dept of Clinical Laboratory,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege,Guilin541001)

Objective To investigate the correlation between the levels of HBsAg and T, B and NK cells subgroup in immune incompetence(inactive phase) which were infected by HBV.Methods Thirty four cases of immunodeficiency (inactive phase) which were infected by HBV were selected in our study,at the same time, twenty normal cases for control.The levels of peripheral blood lymphocyte subsets and NK cells were detected by the flow cytometry. Serum HBsAg levels were tested by Real-time fluorescent probe quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR).Results The content of HBsAg was positively correlated with the percentage of B lymphocytes in inactive state cases.The levels of B lymphocytes in the group of high content of HBsAg was higher than that in the healthy group as well as the group of low content of HBsAg (P<0.05) . However, there was no statistically significant correlation between it and T,B or NK cells. Conclusion Among patients which were infected by HBV in inactive phase,the serum HBsAg levels could represent B cells levels to some extent.The detection of peripheral blood lymphocyte subsets and NK cells have clinical value for understanding the immune status of patients.

hepatitis B surface antigen quantification; T-lymphocytes; B-lymphocytes; natural killer cells; immunodeficiency (inactive phase)

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.038.html

國家自然科學(xué)基金(編號：81260602)

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1消化內(nèi)科、2中醫(yī)科、3檢驗科，桂林 541001

聶 琳，女，碩士研究生；

楊麗莎，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:yangsha@glmc.edu.cn

R 446.11；R 373.2

A

1000-1492(2016)01-0082-04

2015-10-13接收