生長(zhǎng)分化因子-9下調(diào)對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力的影響

馬會(huì)明，張永芳，王蒙蒙，李昀伽，蒲 靜，于 佳，王燕蓉，裴秀英，徐 仙

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生長(zhǎng)分化因子-9下調(diào)對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力的影響

馬會(huì)明，張永芳，王蒙蒙，李昀伽，蒲 靜，于 佳，王燕蓉，裴秀英，徐 仙

目的 探討生長(zhǎng)分化因子-9(GDF9)對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖能力基因周期蛋白A(cyclin A)、周期蛋白D1(cyclin D1)和周期蛋白依賴性激酶抑制因子27(p27kip1)表達(dá)的影響。方法 利用CCK-8檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；使用流式細(xì)胞術(shù)、Real-time PCR和Western blot法驗(yàn)證GDF9 siRNA的干擾效率；采用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 GDF9 siRNA顯著抑制顆粒細(xì)胞增殖活力，其中72 h抑制最明顯(P<0.05)；Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示GDF9 siRNA顯著下調(diào)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中GDF9 mRNA及蛋白的表達(dá)(P<0.01)；Real-time PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞cyclin A、cyclin D1 mRNA表達(dá)降低，p27kip1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)；Western blot法結(jié)果顯示，GDF9 siRNA可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)G2/M期調(diào)控蛋白cyclin A、cyclin D1的表達(dá)。結(jié)論 靶向抑制小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中GDF9的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞cyclin A、cyclin D1的表達(dá)，上調(diào)P27 kip1的表達(dá)，顯著抑制細(xì)胞的增殖。

GDF9 siRNA；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；卵巢顆粒細(xì)胞；小鼠

女性卵巢儲(chǔ)備功能減退原因可能與顆粒細(xì)胞一系列重要的信號(hào)分子和周期蛋白調(diào)控有關(guān)[1-2]， 細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)抑制劑在調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換過程中具有重要作用[3]，其中細(xì)胞周期D1(cyclin D1)和細(xì)胞周期A(cyclin A)的首要功能主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。CDK抑制蛋白p27(p27kip1)是一種CDK抑制劑，通過抑制cyclin D/CDK4、cyclinE/CDK2 的活性，從而抑制細(xì)胞增殖活性[5-6]，使細(xì)胞失去分裂能力。在卵母細(xì)胞的成熟過程中GDF9作為一個(gè)旁分泌因子參與調(diào)節(jié)卵丘顆粒細(xì)胞擴(kuò)展的過程[7]。該研究通過GDF9基因沉默對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞中cyclin D1、cyclin A和p27kip1表達(dá)的檢測(cè)，旨在探討小鼠顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在細(xì)胞增殖分化機(jī)制中的作用，為卵母細(xì)胞發(fā)育機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR) 試劑盒、TRIzol、DMEM/F12(1 ∶1)、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Life Tech公司；兔來源cyclin A、cyclin D1及p27kip1單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；羊抗兔二抗及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自中國(guó)博士德生物公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物試劑公司；重組pcDNA 6.2-GDF9 siRNA(簡(jiǎn)稱GDF9 siRNA)質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染專用試劑HiPerFect購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司； 680型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad儀器公司；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；普通PCR儀和GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-rad儀器公司；Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；BX51熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.2 小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的獲得 取18～22 g 未成熟的雌性Bal小鼠30只(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，按照常規(guī)方法[8]每只腹腔注射孕馬血清(PMSG) 5 IU，注射42 h后在無菌條件下迅速剖取卵巢放入無菌的PBS 中，去除卵巢周圍組織及表面包膜，PBS清洗后置于TCM199-Hepes培養(yǎng)基中。用不銹鋼針刺破卵巢表面的3～8 mm卵泡, 使顆粒細(xì)胞釋放于TCM199-Hepes培養(yǎng)基中。1 000 r/min 低速離心5 min，洗滌2次。將生長(zhǎng)培養(yǎng)基TCM199 (含100 IU/ml雙抗、10% FBS、10 ng/ml EGF) 加入細(xì)胞團(tuán)并制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種在 6 孔培養(yǎng)板中，在5% CO2、37.5 ℃條件下孵育24 h。鏡下觀察是否污染及細(xì)胞的生長(zhǎng)情況, 去除未貼壁細(xì)胞。此后隔日換液1次。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理要求和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.3 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染及最適條件確定 小鼠顆粒細(xì)胞貼壁24 h后，開始轉(zhuǎn)染，按照質(zhì)粒GDF9 siRNA DNA量和HiPerFect量為1.5 μg和12 μg設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后48 h換生長(zhǎng)培養(yǎng)基TCM199。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，用PBS充分洗滌去除漂浮的死細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染率，確定最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。轉(zhuǎn)染率(%)=綠色熒光細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)分為空質(zhì)粒siRNA control組和blank control組及GDF9 siRNA組。

1.4 小鼠顆粒細(xì)胞增殖情況的確定 按照常規(guī)方法[8]將分離純化的小鼠顆粒細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，使每孔細(xì)胞密度為1×104個(gè)，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，并設(shè)不含細(xì)胞的空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。然后根據(jù)上述方法開始轉(zhuǎn)染GDF9 siRNA及對(duì)照siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后，按照CCK-8試劑盒使用說明每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm下的光密度(optical density，OD)值。

1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和Real-time PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，清洗、消化細(xì)胞后按照常規(guī)方法(9)分別提取總RNA，并用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用GDF9、cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA特異性引物(表1)，擴(kuò)增特異性條帶。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增的條帶大?。籖eal-time PCR反應(yīng)以β-actin mRNA的表達(dá)作為內(nèi)參，每組平行試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量并用2-ΔΔCt法表示，各組的Ct值均經(jīng)β-actin校正，以正常組的表達(dá)作為100%。

1.6 Western blot 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，清洗、消化細(xì)胞并裂解細(xì)胞全蛋白，按照常規(guī)方法[9]用BCA法測(cè)定濃度并定量，取 50 μg 蛋白樣品按照常規(guī)方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 并濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉后，分別加入一抗cyclinA、cyclinD1和p27kip1 (1 000 ∶1)，4 ℃孵育過夜；漂洗后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (2 000 ∶1)，37 ℃室溫孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)ECL顯色，曝光。以β-actin作為等量蛋白質(zhì)上樣對(duì)照，每個(gè)樣本至少重復(fù)3 遍，曝光圖片經(jīng)GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)掃描后，計(jì)算條帶的吸光度，cyclin A、cyclin D1和p27kip1 蛋白相對(duì)表達(dá)采用與β-actin吸光度比值來表示。

表1 Real-time PCR相關(guān)基因的引物序列及參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 GDF9 siRNA對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞干擾后干擾效率的檢測(cè) 分離純化的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞用GDF9 siRNA和無關(guān)序列siRNA control分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后更換為正常培養(yǎng)基TCM199，熒光顯微鏡下觀察(圖1A)，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析GDF9 siRNA和siRNA control兩組細(xì)胞，約有70%以上卵巢顆粒細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)綠色熒光蛋白(圖1B、1C)，能滿足后續(xù)表達(dá)調(diào)控分析的要求。GDF9 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h 后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采用Real-time PCR檢測(cè)GDF9 mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF9 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(F=33.058，P<0.05)，siRNA control轉(zhuǎn)染細(xì)胞GDF9 mRNA表達(dá)沒有顯著變化(圖1D)。

圖1 GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

A：顆粒細(xì)胞原代轉(zhuǎn)染×100；B：siRNA control轉(zhuǎn)染效率；C：GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染效率；D：GDF9轉(zhuǎn)染后基因沉默檢測(cè);與siRNA control和blank control比較：*P<0.05

2.2 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響 顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)GDF9 siRNA顆粒細(xì)胞開始表現(xiàn)為細(xì)胞輪廓稍有萎縮，細(xì)胞漂浮物變多。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：siRNA control與blank control相比，siRNA control轉(zhuǎn)染后48 h的OD值降低，GDF9 siRNA與siRNA control和blank control組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.321，P<0.05)。見圖2。

2.3 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9對(duì)cyclin A、cyclin D1和p27kip1 mRNA表達(dá)的影響 GDF9 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后, RT-PCR分別擴(kuò)增出特異性cyclin A、cyclin D1和p27kip1片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3A，擴(kuò)增的條帶大小與理論片段大小一致；Real-time PCR分析檢測(cè)cyclin A、cyclin D1和p27kip1基因表達(dá)情況 (圖3B)。siRNA control與blank control組相比較，cyclin A、cyclin D1和p27kip1基因表達(dá)無顯著性差異。干擾GDF9后p27kip1的mRNA表達(dá)量顯著上升 (F=259.165，P<0.05)；干擾GDF9后cyclin D1的mRNA表達(dá)顯著下降(F=17.224，P<0.05)；cyclin A的mRNA表達(dá)量降低，但沒有顯著性變化。

圖2 CCK-8法檢測(cè)GDF9 siRNA 對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖3 GDF9 siRNA 對(duì)p27 kip1、cyclin D1及cyclin A mRNA表達(dá)的影響

A：瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果；B：Real-time PCR分析結(jié)果；1: cyclin A; 2: cyclin D1; 3: p27kip1;與blank control組比較：*P<0.05

2.4 siRNA干擾顆粒細(xì)胞GDF9對(duì)cyclin A、cyclin D1和p27kip1 蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示，干擾GDF9后，可顯著增加p27kip1蛋白的表達(dá)(F=123.564，P<0.05)，cyclin D1蛋白的表達(dá)明顯下降(F=11.237，P<0.05)。但干擾GDF9 后，cyclin A蛋白表達(dá)下降，但是沒有顯著性改變。見圖4。

圖4 GDF9 siRNA 對(duì)p27kip1、cyclin D1及cyclin A 蛋白表達(dá)的影響

1:blank control組; 2:siRNA control組; 3:GDF9 siRNA組；與blank control組比較：*P<0.05

3 討論

在正常卵巢的周期性卵泡發(fā)育過程中, 卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞增殖分化和凋亡密切相關(guān)。GDF9對(duì)卵泡發(fā)育有重要作用的細(xì)胞因子，可以通過多個(gè)信號(hào)通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖過程[7]。本研究中利用RNA干擾技術(shù)沉默GDF9基因的表達(dá)，達(dá)到抑制顆粒細(xì)胞增殖，首先發(fā)現(xiàn)靶向GDF9的siRNA對(duì)顆粒細(xì)胞干擾效果明顯，GDF9基因表達(dá)量明顯降低，能夠通過細(xì)胞周期蛋白表達(dá)研究卵巢顆粒細(xì)胞增殖，為研究PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞黃素化和凋亡的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞周期是與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖極其相關(guān)的一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)過程，在這一重要過程中有許多關(guān)鍵的因子調(diào)控細(xì)胞的進(jìn)程，這些分子包括cyclin D1、cyclin A和p27kip1等，正常的細(xì)胞周期有序的循環(huán)是通過激活和失活CDK來實(shí)現(xiàn)的。cyclinD1作為細(xì)胞周期進(jìn)程的啟動(dòng)子，是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。cyclin A在細(xì)胞周期中的G1-S和G2-M時(shí)相中均發(fā)揮了作用，能夠以有活性的cyclin A-CDK-2復(fù)合物的形式促進(jìn)細(xì)胞的增殖[10]。本研究結(jié)果顯示，沉默GDF9基因的表達(dá)后，cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。其中，可以與CDK4結(jié)合形成復(fù)合體，通過磷酸化和失活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB)，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期到S期的進(jìn)展，并通過這種方式介導(dǎo)DNA的合成，是一個(gè)比其他Cyclins更加敏感的指標(biāo)，對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控至關(guān)重要[10]。cyclin A可在細(xì)胞周期的不同時(shí)相分別與 CDK-1、CDK-2結(jié)合，并激活其活性[11]?？梢粤姿峄疪B蛋白而使E2F游離，活化、細(xì)胞便進(jìn)入增殖階段[12]。Viglietto et al[13]研究結(jié)果顯示，cyclin A的表達(dá)量有一定的降低，但是沒有顯著性下降，p27kip1可以與cyclin E-CDK2、cyclin A-CDK2、cyclin D-CDK4復(fù)合物結(jié)合抑制其對(duì)底物的磷酸化作用，使細(xì)胞不能發(fā)生G1～S期的時(shí)相轉(zhuǎn)換，停滯于G1期，細(xì)胞增殖停止。本研究結(jié)果顯示，干擾GDF9后， p27kip1的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著上升，細(xì)胞增殖減緩，因此也證實(shí)了p27kip1在介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，尤其在細(xì)胞增殖及其調(diào)控中扮演負(fù)性調(diào)節(jié)的角色[14]，可能p27kip1在細(xì)胞PI3K 和 Notch通路中參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控[15]， 本研究也證實(shí)了p27kip1表達(dá)上升促進(jìn)了對(duì)cyclin D1的抑制作用，使cyclin D1表達(dá)顯著性下降，從而抑制了細(xì)胞的增殖分裂。但是研究中是否存在PI3K/Akt/p27kip1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，顆粒細(xì)胞PI3K通路活性是否受到影響，從而影響細(xì)胞周期的正常調(diào)控，需要進(jìn)一步對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行研究。

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Effect of downregulated growth differential factor-9 on cell proliferative activity in mouse ovarian granulose cell

Ma Huiming，Zhang Yongfang，Wang Mengmeng，et al

(Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education,FertilityCenterforReproductiveMedicine,DeptofAnotomyandHistology-Embryology,NingxiaMedicalUniversity，yinchuan750004)

Objective In the present study, we determined whether GDF9 siRNA were involved in the expressions of cyclin A, cyclin D1 and p27kip1 which were key molecules in controlling cell cycling and cell proliferation by regulating cyclin D1 expression in mouse ovary granulose cell. Methods Real-time PCR and Western blot assay were used to investigate the expressions of cyclin D1, cyclin A, and p27kip1.We further observed the effect of GDF9 siRNA on the cell proliferation by regulating the expressions of cyclin D1, cyclin A, and p27kip1 in mouse ovary granulose cell.Results We found that the expressions of cyclin D1 and cyclin A were down-regulated at both protein and mRNA levels in GDF9 siRNA group while p27kip1 was upregulated by real-time PCR and Western blot assay. Furthermore, GDF9 siRNA had additive effect in down-regulation of cyclin D1,cyclin A and upregulation of p27kip1.Compared with the control group，the expression level of cyclin D1 was significantly decreased(P<0.05)and p27kip1 was significantly increased(P<0.05).Conclusion These data suggest that cell cyclin signal pathway may coordinately regulate the cell proliferation and differentiation processes through up-regulating cyclin D1 and down-regulating p27kip1 of mouse ovary granulose cell.

GDF9 siRNA;cell proliferation;ovary granulose cell;mouse

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.024.html

寧夏自然科學(xué)基金(編號(hào)：NZ11128)

寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、寧夏回族自治區(qū)生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、人體解剖與組織胚胎學(xué)系,寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750004

馬會(huì)明，男，講師，博士；

裴秀英，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：peixiuying@163.com；

R 711.6

A

1000-1492(2016)01-0051-05

2015-09-30接收

徐 仙，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xux36@163.com