Mcl-1 siRNA對(duì)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

金 瑋，吳 萍

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Mcl-1 siRNA對(duì)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

金 瑋1，吳 萍2

目的 探討轉(zhuǎn)染髓樣細(xì)胞白血病(Mcl-1)siRNA特異性沉默Mcl-1基因?qū)δ[瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響。方法 采用碘化丙啶(PI)染色法流式細(xì)胞術(shù)分析TRAIL單獨(dú)作用的細(xì)胞凋亡率以及廣譜caspase抑制劑z-VAD-fmk對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用；Western blot法分析TRAIL處理前后半胱天冬酶-3(caspase-3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的活化以及抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1的蛋白表達(dá)情況；采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA入HGC-27細(xì)胞，Western blot 法驗(yàn)證基因沉默效果，流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果 HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感，48 h的凋亡率僅為(20.65±3.23)%，z-VAD-fmk能幾乎完全阻止TRAIL誘導(dǎo)的凋亡；TRAIL作用晚期caspase-3活化、PARP-1裂解，Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1在TRAIL處理前后沒(méi)有明顯的變化；Mcl-1 siRNA轉(zhuǎn)染后能顯著降低細(xì)胞中Mcl-1的蛋白表達(dá)水平，且細(xì)胞轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA后再加入TRAIL處理，細(xì)胞凋亡率明顯增加。結(jié)論 Mcl-1的高表達(dá)可能與HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL抵抗有關(guān)，Mcl-1 siRNA沉默Mcl-1基因能增加HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。

胃癌；細(xì)胞凋亡；小干擾RNA；Mcl-1

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族的成員，具有選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，相比一般的化療藥物有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。TRAIL既可以通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，又可以通過(guò)線粒體途徑使凋亡信號(hào)得以放大。Bcl-2家族是調(diào)控線粒體途徑的關(guān)鍵分子，其25個(gè)成員根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能不同，分為促凋亡和抗凋亡蛋白，兩種力量之間的平衡決定了細(xì)胞是存活還是死亡。髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)屬于抗凋亡蛋白，最初在ML-1人髓樣白血病細(xì)胞系的分化中發(fā)現(xiàn)[1]。Mcl-1在多種腫瘤組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，通過(guò)反義寡核苷酸或RNA干擾技術(shù)抑制Mcl-1的表達(dá)可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物變敏感[2-3]。該研究選擇對(duì)TRAIL不敏感的胃癌細(xì)胞HGC-27，采用siRNA技術(shù)特異性沉默Mcl-1基因，了解其對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 未分化的人胃癌細(xì)胞HGC-27(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI 1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；重組人可溶性TRAIL(美國(guó)Immunex公司)；碘化丙啶(PI)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；廣譜的caspase抑制劑z-VAD-fmk(美國(guó)Calbiochem公司)；人Mcl-1 siRNA序列由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成； Lipofectamine 2000 Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)；小鼠抗人Bcl-2、半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly[ADP-ribose] polymerase-1，PARP-1)單克隆抗體和兔抗人Mcl-1多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗人Bcl-XL多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HGC-27細(xì)胞用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將HGC-27細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，次日細(xì)胞融合達(dá)80%以上，給予不同處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后分別收集上清液至流式管中，1 200 r/min離心10 min，棄上清液，孔中貼壁細(xì)胞加750 μl PI溶液(含50 mg/L PI、0.1%枸櫞酸鈉及0.1% Triton X-100)于37 ℃避光作用10～20 min，待孔內(nèi)細(xì)胞完全消化后也收集至對(duì)應(yīng)的流式管中，混勻，置于4 ℃避光染色過(guò)夜，次日上流式細(xì)胞儀(BD FACSVerse)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CS Express 4軟件分析亞二倍體峰(sub-G1)所占的百分率即為細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別收集不同處理的細(xì)胞，加入100 μl RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后4 ℃、14 000 r/min離心30 min，上清液即總蛋白；采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，每個(gè)樣品取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE；將分離開(kāi)的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入不同的一抗(caspase-3、PARP-1、Bcl-2、Bcl-XL或Mcl-1抗體)，以GAPDH為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜；次日用TBST洗3次，每次10 min，再加入不同的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；最后用ECL法顯色，天能全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染 Mcl-1 siRNA 正義鏈：5’-GUGCCUUUGUGGCUAAACA-3’，反義鏈：5’- UGUUUAGCCACAAAGGCAC-3’。實(shí)驗(yàn)分為未轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(NC siRNA組)和轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染在6孔板及24孔板中進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前1 d接種細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合達(dá)30%。轉(zhuǎn)染前1 h將孔中培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(6孔板每孔800 μl，24孔板每孔400 μl)。6孔板轉(zhuǎn)染分別用100 μl Opti-MEM稀釋100 pmol siRNA和5 μl Lipofectamine 2000 Reagent，二者混合后室溫放置20 min，最后將200 μl復(fù)合物滴入細(xì)胞中，4 h后換液，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，采用Western blot法判斷基因沉默效果。24孔板轉(zhuǎn)染則分別用50 μl Opti-MEM稀釋20 pmol siRNA和1 μl Lipofectamine 2000 Reagent，二者混合后室溫放置20 min，最后將100 μl復(fù)合物滴入細(xì)胞中，4 h后換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)，加入200 μg/L TRAIL繼續(xù)處理48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 z-VAD-fmk能抑制TRAIL誘導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感，200 μg/L TRAIL處理48 h的細(xì)胞凋亡率僅為(20.65±3.23)%。z-VAD-fmk對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，而用z-VAD-fmk提前1 h預(yù)處理，再加入TRAIL繼續(xù)作用48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡幾乎被完全阻止，凋亡率僅為(6.97±2.12)%(圖1)，與單用TRAIL組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.012，P<0.05)，說(shuō)明TRAIL誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生的是caspase依賴性的細(xì)胞凋亡。

圖1 z-VAD-fmk能阻止TRAIL誘導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞凋亡

A：對(duì)照組；B：TRAIL(200 μg/L)處理48 h；C：z-VAD-fmk(20 μmol/L)處理 48 h；D：z-VAD-fmk(20 μmol/L)先處理1 h，再加入 TRAIL(200 μg/L)繼續(xù)處理48 h；與TRAIL(200 μg/L)處理48 h比較：*P<0.05

2.2 TRAIL處理前后的caspase活化及抗凋亡蛋白的表達(dá)情況 caspase-3位于凋亡通路的末端，其激活可以切割多種細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞骨架蛋白，引起凋亡的各種改變，其中最主要的底物是PARP-1。在TRAIL作用晚期cleaved-caspase-3和cleaved-PARP-1才出現(xiàn)，說(shuō)明caspase活化很有限；而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1在TRAIL作用前后都沒(méi)有明顯的改變(圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA能有效地降低細(xì)胞內(nèi)Mcl-1蛋白的表達(dá)水平 采用Lipofectamine 2000將Mcl-1 siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HGC-27細(xì)胞，Western blot法從蛋白水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，與對(duì)照組及NC siRNA組比較，Mcl-1 siRNA組幾乎檢測(cè)不到細(xì)胞中Mcl-1的蛋白(圖3)，說(shuō)明基因沉默效果很好。

圖2 caspase-3、PARP-1、Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1在TRAIL處理前后的表達(dá)

圖3 Mcl-1 siRNA敲除效果

2.4 轉(zhuǎn)染 Mcl-1 siRNA能增加HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性 在24孔板中轉(zhuǎn)染后，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合，加入TRAIL繼續(xù)處理，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染Mcl-1 siRNA可以明顯增加細(xì)胞凋亡率，48 h的凋亡率為(54.78±7.56)%，與NC siRNA組(20.65±3.95)%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.927，P<0.05)。

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤，盡管近年來(lái)手術(shù)治療和化療取得了很大的進(jìn)展，患者的預(yù)后依然很差。TRAIL的優(yōu)勢(shì)在于其能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，而不損傷正常細(xì)胞，因而被寄托了很大的希望，但是仍有許多腫瘤細(xì)胞對(duì)之不敏感，成為其應(yīng)用于臨床的重大障礙。在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中，死亡受體途徑和線粒體途徑存在相互交叉，因而這兩條途徑中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)都可能使得細(xì)胞對(duì)TRAIL發(fā)生抵抗，如細(xì)胞膜表面誘騙受體TRAIL-R3和TRAIL-R4的表達(dá)、cFLIP表達(dá)水平的升高、凋亡抑制蛋白家族的高表達(dá)或者抗凋亡的Bcl-2家族蛋白的高表達(dá)等。早期研究[4]顯示許多細(xì)胞是因?yàn)楦弑磉_(dá)Bcl-2和Bcl-XL才導(dǎo)致其對(duì)TRAIL抵抗，而近幾年Mcl-1的抗凋亡作用越來(lái)越引起人們的注意。

Mcl-1的結(jié)構(gòu)與Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w等有很大的同源性，但也有其自身的特點(diǎn)。Mcl-1的羧基端有一個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)區(qū)的BH2、BH1和BH3結(jié)構(gòu)域，其氨基端比其他抗凋亡蛋白更長(zhǎng)，且含有兩個(gè)PEST(脯氨酸P/谷氨酸E/絲氨酸S/蘇氨酸T)基序，這可能是其半衰期短的原因，且這樣的結(jié)構(gòu)也是Mcl-1更新、定位、磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5]。Mcl-1主要定位在線粒體外膜上，阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放入胞質(zhì)。Mcl-1還能以很高的親和力與Bim、Bid及Puma結(jié)合，但是其對(duì)Noxa和Bak的選擇性更高。Mcl-1可以通過(guò)分離Bak，阻止Bak寡聚化，達(dá)到促生存的目的[6]。

Mcl-1基因在人類腫瘤中是高度擴(kuò)增的基因之一[7]，在腫瘤發(fā)生中具有重要的作用。Mcl-1在多種腫瘤中高表達(dá)[8-9]，這可能是腫瘤細(xì)胞用來(lái)逃逸細(xì)胞死亡或者對(duì)化療藥物抵抗的機(jī)制[10]。目前已知去泛素酶USP9X能結(jié)合到Mcl-1上，去除容易被蛋白酶體降解的賴氨酸48-連接的多聚泛素鏈，從而穩(wěn)定Mcl-1的結(jié)構(gòu)[11]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。Mcl-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織，并且與胃癌的T分期、臨床分期、轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)以及5年生存率密切相關(guān)，同樣在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜細(xì)胞[12]。本研究中，HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL不敏感，48 h的凋亡率低于30%。細(xì)胞內(nèi)抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1都呈高表達(dá)，且TRAIL處理之后沒(méi)有明顯改變，這可能是導(dǎo)致HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL抵抗的原因。

研究[13-14]顯示下調(diào)Mcl-1可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，目前下調(diào)Mcl-1的藥物主要有細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑和去泛素酶抑制劑。而反義寡核苷酸(ASO)和RNA干擾(RNAi)是體外實(shí)驗(yàn)中常用的下調(diào)Mcl-1基因表達(dá)的方法。RNAi能把雙鏈siRNA引入細(xì)胞，通過(guò)特異性降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)。和ASO相比，其能抵御核酸酶降解，但siRNA有瞬時(shí)性，在體內(nèi)停留的時(shí)間較短。本研究用脂質(zhì)體法將Mcl-1特異性siRNA轉(zhuǎn)入HGC-27細(xì)胞，48 h后在蛋白水平檢測(cè)基因沉默效果，Mcl-1蛋白表達(dá)明顯降低，siRNA序列有效。隨即觀察轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果 Mcl-1 siRNA能顯著增加TRAIL誘導(dǎo)的HGC-27細(xì)胞凋亡率，這進(jìn)一步說(shuō)明了Mcl-1在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)是導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TRAIL耐受的因素。

綜上所述，本研究采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默Mcl-1基因，從而下調(diào)胃癌細(xì)胞HGC-27內(nèi)Mcl-1的表達(dá)，且下調(diào)Mcl-1后HGC-27細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性增強(qiáng)。目前通過(guò)高通量篩選的辦法鑒定出多種Mcl-1的小分子抑制劑，其中選擇性抑制劑UMI-77可以通過(guò)與Mcl-1分子的BH3結(jié)合溝結(jié)合在前列腺癌細(xì)胞系及小鼠異種移植物模型中發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。Mcl-1目前作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)受到了腫瘤研究領(lǐng)域的關(guān)注，通過(guò)各種辦法抑制Mcl-1可能幫助克服腫瘤細(xì)胞化療藥物的抵抗。

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Effect of Mcl-1 siRNA on TRAIL-induced apoptosis in gastric cancer cells

Jin Wei1, Wu Ping2

(1Dept of Otolaryngology, Chaohu Hospital of Anhui Medical University, Chaohu 238000;2DeptofImmunology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032)

Objective To explore the effect of Mcl-1 small interference RNA (siRNA) on tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis in gastric cancer HGC-27 cells. Methods The apoptotic rates of cells treated with TRAIL and pan-caspase inhibitor (z-VAD-fmk) alone or combination were measured by propidium iodide (PI) method using flow cytometry. The activation of caspase-3, cleavage of PARP-1, as well as the protein level of anti-apoptotic Bcl-2 proteins Bcl-2, Bcl-XLand Mcl-1 before and after TRAIL treatment were monitored by Western blot analysis. Transfection of Mcl-1 siRNA was performed using Lipofectamine 2000 reagent. The efficiency of gene silencing was quantified by Western blot and the effect of Mcl-1 siRNA on TRAIL-induced apoptosis was measured using PI method. Results HGC-27 cells were resistant to TRAIL-induced apoptosis, and z-VAD-fmk pretreatment could block apoptosis nearly completely. Activation of caspase-3 and cleavage of PARP-1 occurred in the late stage of apoptosis. The expression levels of Bcl-2, Bcl-XLand Mcl-1 were not altered after exposure to TRAIL. Transfection with Mcl-1 siRNA could obviously downregulate the expression level of Mcl-1 in HGC-27 cells and enhanced the sensitivity of cells to TRAIL-induced apoptosis. Conclusion Overexpression of Mcl-1 may account for the resistance of HGC-27 cells to TRAIL. Downregulation of Mcl-1 by siRNA can effectively enhance the sensitivity of HGC-27 cells to TRAIL-induced apoptosis.

gastric cancer; apoptosis; siRNA; Mcl-1

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.022.html

安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號(hào)：KJ2014A113)

1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院耳鼻喉科，巢湖 238000

2安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 230032

金 瑋，男，醫(yī)師；

吳 萍，女，講師，責(zé)任作者，E-mail：wuping@ahmu.edu.cn

R 735.2

A

1000-1492(2016)01-0047-05

2015-10-20接收