糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA及電鏡下線粒體結(jié)構(gòu)的影響

張濤靜　高彥彬　龔燕冰　周　暉　謝培鳳　關(guān)　崧　易文明.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京　00078；.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京　00069

糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA及電鏡下線粒體結(jié)構(gòu)的影響

張濤靜1高彥彬2龔燕冰1周暉1謝培鳳1關(guān)崧1易文明1
1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100078；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069

目的 觀察糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA、8-羥基脫氧鳥苷 （8-OHdG）及線粒體結(jié)構(gòu)的影響。方法 選取14只SD大鼠作為正常組，其余SD大鼠采用鏈脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型，造模成功后，將其隨機分為模型組、西藥組（α-硫辛酸）、中藥組（糖絡(luò)寧），共給藥8周，給藥結(jié)束后，檢測線粒體DNA水平、8-OHdG水平，并運用電鏡觀察線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠神經(jīng)細胞線粒體DNA、8-OHdG水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組與西藥組神經(jīng)細胞線粒體DNA、8-OHdG水平明顯降低（P＜0.01）。與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體腫脹明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴重，線粒體內(nèi)特異結(jié)構(gòu)嵴消失；而中藥組大鼠DRG線粒體結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體嵴保存完好；西藥組大鼠DRG線粒體也存在輕度腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不完整，嵴顯示不清楚。結(jié)論 糖尿病大鼠神經(jīng)細胞中線粒體會發(fā)生明顯改變，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)嚴重破壞，DNA表達過度升高，DNA的氧化損傷也非常明顯。糖絡(luò)寧可明顯減低線粒體DNA表達，減少氧化損傷，緩解線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，這是糖絡(luò)寧治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的機制之一。

糖絡(luò)寧；糖尿病；大鼠；線粒體；DNA；電鏡

糖尿病性周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率高[1-2]，可累及多種神經(jīng)組織，產(chǎn)生疼痛、麻木甚至運動障礙，嚴重影響糖尿病患者的生存質(zhì)量[3-4]。目前DPN的發(fā)病機制仍不清楚，近年對其發(fā)病機制的研究主要集中在氧化應(yīng)激（oxidative stress）上[5-6]，線粒體作為神經(jīng)細胞中核心的產(chǎn)能細胞器，高度參與了氧化應(yīng)激，是DPN發(fā)病的重要機制[7-8]。多年的臨床研究證實，中藥復(fù)方制劑糖絡(luò)寧治療DPN效果顯著[9-11]，但作用機制、作用靶點不明，本研究復(fù)制糖尿病大鼠模型，觀察糖絡(luò)寧對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞線粒體DNA及電鏡下線粒體結(jié)構(gòu)的影響，從而探討其治療DPN的機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級雄性8周SD大鼠，體重200～250 g，合格證號：SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司供給。購入后置于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。實驗室條件：國標GB14925-2001規(guī)定動物實驗設(shè)施大鼠清潔級屏障環(huán)境[環(huán)境安全合格證號：SYXK（京）2011-0024]，室內(nèi)相對溫度（25±1）℃，相對濕度（60±10）%。

1.2試劑

鏈脲佐菌素（STZ，美國Merck公司，批號：B69776）；線粒體相關(guān)試劑盒 （上海杰美基因醫(yī)藥科技公司）；8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）檢驗試劑盒（日本Japanese aged control institute）；α-硫辛酸（a-lipoic acid）（批號：82159-09-9）。

1.3儀器

恒溫加熱塊（鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；離心機（eppendorf centrifuge 5417R型）；LX-100手掌式離心機（其林貝爾儀器）；電熱恒溫水浴鍋（長安科學(xué)儀器）；熒光偏震儀（全波長多功能酶表儀，intinite M1000，瑞士Tecan）；高速低溫離心機（美國Beckman公司）；722分光光度計（上海分析儀器二廠）；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Forma公司）；ELX800型自動酶標儀（美國BIO.TEK公司）；pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.4造模、分組及給藥方式

造模、分組及給藥方式均參照既往研究[12-13]。選用8周雄性SD大鼠80只，造模前隨機選擇14只作為正常組，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，將成模大鼠共61只隨機分為西藥組（19只）、中藥組（21只）、模型組（21只）。中藥組給予糖絡(luò)寧制劑按生藥5 g/（kg·d）灌胃；西藥組按20 mg/（kg·d）灌胃，將α-硫辛酸用蒸餾水配成混懸液（2.5 mg/mL）灌胃；模型組給予等量蒸餾水灌胃。實驗期間自由飲食，根據(jù)既往實驗研究經(jīng)驗，連續(xù)給藥8周可達到較好效果。實驗結(jié)束，西藥組、中藥組、模型組分別死亡大鼠2、3、3只，各組最終剩余大鼠數(shù)量分別為17、18、18只。由于神經(jīng)組織及線粒體取材困難，故本研究在實驗結(jié)束時統(tǒng)一取材，未在實驗中段取材觀察各組療效。

1.5背根神經(jīng)節(jié)取材及線粒體提取

背根神經(jīng)節(jié)取材及線粒體提取均參照既往研究[12-13]，最終提取樣本放進-70℃冰箱里備用。

1.6線粒體DNA的測量[14-15]

采用相對定量方法測定，運用iCycler iQ實時檢測系統(tǒng)進行實時PCR擴增和SYBR綠色熒光檢測：將提取好的線粒體經(jīng)過均勻加工處理后分別以800 r/min及7000 r/min，離心10 min，離心半徑為75 mm，取沉淀物為線粒體斷片，各加入1 mL 10 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl及0.2%SDS進行再加工處理，所得物在56°C下用蛋白激酶K孵化70 min，然后加熱至95℃10 min，再加入等容量的苯酚、氯仿和異戊醇提取mtDNA。共10 ng基因組DNA用于線粒體DNA和核DNA標記，在25μL反應(yīng)液中包含1X SYBR Green iCycler iQ混合物和0.2μM的正向和反向基因特異性引物，引物序列見表1。熒光閾值（Ct）值運用iCycler iQ系統(tǒng)軟件進行計算：①計算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因A（Action）-Ct細胞色素b，分別計算實驗組和正常組的ΔCt。②計算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt檢測組-ΔCt正常組；③計算相對表達量的差值2-ΔΔCt。

表1　m tDNA引物序列

1.7線粒體8-OHdG的測量[16-17]

應(yīng)用雙抗體夾心法測定大鼠DRG線粒體8-OHdG水平，運用專門的8-OHdG酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒進行測試：將提取好的線粒體用原倍標準品在小試管中進行稀釋；分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔，在酶標包被板上標準品準確加樣50μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL；用封板膜封板后置37℃溫育30 min；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外；每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）；以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行；計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。得出標準曲線的回歸方程為y=634.05x+9.5594（R2=0.9697）。

1.8電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)

運用透視電子顯微鏡對標本進行觀察：組織固定，在“低溫”條件下（0～4℃）操作，使用兩步固定法，第1次固定使用戊二醛固定液，經(jīng)過充分洗滌后，用鋨酸作第2次固定，2次固定的時間相同，均為20 min；組織脫水：按照標準流程進行脫水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，85%乙醇10 min，95%乙醇15 min，100%乙醇15 min，100%乙醇15 min，中間溶劑10 min；組織包埋：組織脫水后入中間溶劑，直接入純丙酮與包埋劑混合液中開始浸透，接著包埋于新?lián)Q的包埋劑于預(yù)先干燥的膠囊中聚合，后2次包埋劑不更換膠囊；超薄切片：使用超薄切片機切片，切出來的切片收集到有Formva支持膜的載網(wǎng)上，從水中撈起晾干，放入電鏡中觀察。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA及8-OHdG水平比較

與正常組比較，模型組大鼠神經(jīng)細胞線粒體DNA表達明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組與西藥組神經(jīng)細胞線粒體DNA表達明顯減少（P＜0.01）。與正常組比較，模型組大鼠神經(jīng)細胞線粒體中8-OHdG水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組與西藥組神經(jīng)細胞線粒體中8-OHdG水平明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA及8-OHdG水平比較（U/mg protein，）

表2　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體DNA及8-OHdG水平比較（U/mg protein，）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；8-OHdG：8-羥基脫氧鳥苷

組別　只數(shù)　線粒體DNA　線粒體8-OHdG（ng/L）正常組模型組西藥組中藥組F值P值14 18 17 18 1.00±0.02 1.98±0.51*1.51±0.34#1.47±0.37#31.22＜0.01 78.34±3.67 124.36±10.21*78.99±8.82#80.43±3.75#26.78＜0.01

2.2各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體電鏡觀察結(jié)果

電鏡觀察DRG線粒體顯示：與正常組比較，模型組大鼠DRG線粒體腫脹明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴重，線粒體內(nèi)特異結(jié)構(gòu)嵴消失；而中藥組大鼠DRG線粒體結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體嵴保存完好；西藥組大鼠DRG線粒體也存在輕度腫脹，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不完整，嵴顯示不清楚。見圖1～4。

圖1　正常組大鼠DRG線粒體電鏡照片（120 000×）

3　討論

圖2　模型組大鼠DRG線粒體電鏡照片（50 000×）

圖3　中藥組大鼠DRG線粒體電鏡照片（60 000×）

糖絡(luò)寧是筆者根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)出的中藥復(fù)方制劑，藥物組成主要包括生黃芪、山萸肉、狗脊、丹參、全蝎等，經(jīng)過十余年的觀察，療效確切，但其具體作用機制尚不清楚[9-11]。根據(jù)筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，糖絡(luò)寧可降低大鼠坐骨神經(jīng)山梨醇水平[18]，升高大鼠血清神經(jīng)生長因子（NGF）含量和坐骨神經(jīng)NGF mRNA表達[19]，增加血清中胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的含量，上調(diào)糖尿病大鼠肝組織IGF-1 mRNA表達[20-21]。另外筆者針對神經(jīng)細胞線粒體的研究還提示，糖絡(luò)寧可顯著改善糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)線粒體抗氧化劑的活性[12]，提高糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)中線粒體呼吸鏈各個復(fù)合物的活性[13]，減少和改善線粒體氧化應(yīng)激。

圖4　西藥組大鼠DRG線粒體電鏡照片（50 000×）

本研究則從更深層次的DNA水平、DNA損傷來驗證糖絡(luò)寧的作用機制，實驗結(jié)果提示，在高血糖狀態(tài)下線粒體的DNA表達是更加活躍的，線粒體中8-OHdG水平顯著升高。線粒體作為細胞氧化代謝最主要的細胞器，其DNA表達過度增加會直接導(dǎo)致氧代謝的提升，從而間接增加氧化應(yīng)激的產(chǎn)生；8-OHdG作為反映DNA氧化損傷的重要指標，其水平升高表明高血糖下大鼠神經(jīng)細胞線粒體DNA的氧化損傷十分明顯，線粒體中的氧化應(yīng)激明顯增加；糖絡(luò)寧和α-硫辛酸均可明顯抑制神經(jīng)細胞線粒體DNA的過度表達，降低神經(jīng)細胞線粒體中8-OHdG水平，這表明糖絡(luò)寧及硫辛酸均可減少高血糖導(dǎo)致的線粒體DNA的氧化損傷，對線粒體DNA起到很好的保護作用，這可能是糖絡(luò)寧及硫辛酸治療DPN的機制之一。

線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的完整對于其功能的保障非常重要，通過電鏡觀察DRG線粒體證實，糖尿病大鼠DRG線粒體腫脹明顯，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞嚴重，中藥組大鼠DRG線粒體結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體嵴保存完好，初步認為中藥糖絡(luò)寧可保護線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，避免糖尿病所致的線粒體結(jié)構(gòu)破壞，這可能是糖絡(luò)寧治療DPN的機制之一。

總之，高血糖狀態(tài)下，神經(jīng)細胞中線粒體會發(fā)生明顯改變，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)嚴重破壞，DNA表達過度升高，DNA的氧化損傷也非常明顯。糖絡(luò)寧作為一個療效顯著的中藥復(fù)方可明顯改善線粒體在高血糖下的上述改變，減低DNA表達，減少氧化損傷，緩解線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，這是糖絡(luò)寧治療DPN的機制之一。

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Influence of Tangluoning on activities of m itochondrial DNA and structure of electron m icroscope in dorsal root ganglion in diabetic rats

ZHANG Taojing1GAO Yanbin2GONG Yanbing1ZHOU Hui1XIE Peifeng1GUAN Song1YI Wenming1
1.Department of Endocrinology,Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100078,China; 2.School of Traditional Chinese Medicine,Capital Medical University,Beijing100069,China

Ob jective To investigate the effect of Tangluoning on activities of mitochondrial DNA,8-OHdG and structure of electron microscope in dorsal root ganglion in diabetic rats.Methods Fourteen SD rats were selected as normal group,the other SD rats were given streptozotocin to make diabetic rats model,after success,they were random ly divided into model group,Western medicine group(α-lipoic acid),TCM group(Tangluoning).The activities of mitochondrial DNA,8-OHdG were detected,and the mitochondrial structure was observed by electron microscope after 8 weeks′treatment.Results Compared with normal group,the activities of mitochondrial DNA and 8-OHdG in model group were significantly increased(P＜0.01).Compared with model group,the activities of mitochondrial DNA and 8-OHdG in Western medicine group and TCM group were significantly decreased(P＜0.01).Compared with normal group,diabetic rats DRG mitochondria was swelled,the internal structure was damaged obviously and seriously,the specific structure of the mitochondria cristae was disappeared;and DRG mitochondria of TCM group had relatively intact structure,the mitochondrial cristae was well preserved;DRG mitochondria of Western medicine group also existed mild swelling,the internal structure was not complete,crest display was not clear.Conclusion In diabetic rats,the mitochondria of nerve cells is changed significantly,the internal structure is damaged seriously,the DNA expression is increased excessively, and the oxidative damage of DNA is also very obvious.Tangluoning can significantly decrease the expression of mitochondrial DNA,reduce the oxidative damage,and alleviate the destruction of mitochondrial structures,which is one of the mechanisms of Tangluoning in the treatment of diabetic peripheral neuropathy.

Tangluoning;Diabetes;Rats;Mitochondria;DNA;Electron microscope

R587

A

1673-7210（2016）04（b）-0004-05

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81102574）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81473663）；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院東方新星項目（DFRC2014C03）。

張濤靜，男，博士，副主任醫(yī)師；研究方向：糖尿病并發(fā)癥的中醫(yī)藥防治。

（2016-01-03本文編輯：張瑜杰）