宜賓烤煙赤星病致病力分化、生物學(xué)特性及抑菌藥劑篩選研究

唐明 向金友 謝冰 程智敏 楊懿德 蔡毅 黃勝 楊蘋(píng) 楊洋 易蔓 饒?jiān)谏?/p>

摘 要：為了使生產(chǎn)上對(duì)煙草赤星病的防治更有針對(duì)性，對(duì)采自宜賓市烤煙種植區(qū)的具有典型赤星病癥狀的煙葉樣品進(jìn)行了組織分離、培養(yǎng)和形態(tài)特征觀察。采用菌絲塊創(chuàng)傷接種法測(cè)定分離菌株的致病性，同時(shí)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了不同致病力的菌株xs-k-1（較強(qiáng)）、xz-k-1（中）和xf-y-1（弱）的生物學(xué)特性及4種殺菌劑對(duì)較強(qiáng)致病力菌株xs-k-1的室內(nèi)抑制效果。結(jié)果表明：21個(gè)菌株均屬于鏈格孢菌，但各菌株間的致病力有明顯的差異，平均病情指數(shù)為18.75～71.25，其中以中等致病力類(lèi)型的菌株為主，占測(cè)試菌株的61.9%，弱致病力類(lèi)型和較強(qiáng)致病力類(lèi)型的菌株所占比例相當(dāng)，未發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力和不致病力菌株。在人工培育條件下，煙草赤星病菌在7～35 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，最適宜的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度為21～28 ℃；高濕度有利于病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，當(dāng)濕度為100%時(shí)，病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量最高，分別為5.83 cm和4.18×105 個(gè)·mL-1；在pH值4～10的范圍內(nèi)該病菌均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，適宜pH值范圍為7～8.5，其中病菌生長(zhǎng)的最適pH值為8.5，產(chǎn)孢量最大的pH值為7 。供試藥劑的室內(nèi)平板抑菌效果為：10%多抗霉素>60%唑醚·代森聯(lián)>50%氯溴異氰尿酸>40%菌核凈，10%多抗霉素的EC50為15.182 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞：烤煙；赤星病；致病性；生物學(xué)特性；藥劑

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.10.022

Abstract： To control Alternaria alternata with strong points， pathogen was isolated from the tobacco leaves with typical brown spot symptom. And the pathogen was cultured and the characters was observed. The pathogenicity of isolates was evaluated by mycelium block traumatic inoculation methods. The biological characteristics of representative isolates xs-k-1 （relatively strong）， xz-k-1 （moderate） and xf-y-1 （weak） with various pathogenicity were determined by using hyphal growth rate method. Moreover， the inhibition of 4 fungicides for relatively strong pathogenicity isolate xs-k-1 was investigated. The results showed that all of the 21 isolates were A. alternata， but the pathogenicity was different among different strains， and average disease index varied from 18.75～71.25. And the moderate virulent isolates distributed dominantly， accounting for 61.9%， the proportion of weak and relatively strong virulent type was the same， neither strong nor nonpathogenic. On PDA medium， mycelial can grow and spore in the temperature range of 7～35 ℃， with the optimum growth and sporulation occurring between 21～28 ℃. The high humidity was favorable for mycelial growth and sporulation， the growth and sporulation reached the highest under 100% RH， 5.83 cm and 4.18×105 individual·mL-1， respectively. Mycelial can grow and spore in the pH range of 4～10， and the suitable pH was 7～8.5， with the optimum growth pH 8.5， the optimum sporulation pH 7. The inhibition effects of different fungicides on A. alternata were 10%polyoxin> 60%pyraclostrobin & metiram> 50%chloroisobromine cyanuric acid> 40%dimetachlone， and 10%polyoxin EC50 values was 15.182 μg·mL-1.

Key words： flue-cured tobacco； Alternaria alternata； pathogenicity； biological characteristics； medicaments

煙草赤星?。ˋlternaria alternata）是煙草生產(chǎn)上對(duì)煙葉威脅最大的病害之一，屬真菌性病害，具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)[1-3]，在我國(guó)各煙區(qū)均有發(fā)生，以黑龍江、河南、山東、貴州、安徽、四川等省發(fā)生為害較重[4-6]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。宜賓是四川的重要烤煙產(chǎn)區(qū)之一，種植烤煙面積6 000 hm2左右，其煙葉風(fēng)格獨(dú)特，在主要卷煙品牌的主輔料中占有重要地位，對(duì)促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)[7]。然而，地處高溫高濕的宜賓煙區(qū)由于多年且大面積種植感赤星病的烤煙品種K326和云煙87等[8]原因，烤煙赤星病發(fā)生嚴(yán)重，一般煙田病株率為20%～60%，重病田可達(dá)90%以上，致使煙葉產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約著烤煙生產(chǎn)的發(fā)展。為了生產(chǎn)中對(duì)煙草赤星病的防治更有針對(duì)性，急需明確宜賓各產(chǎn)煙縣此病害的致病力、生物學(xué)特性以及不同藥劑的抑菌效果。鑒于此，對(duì)宜賓煙區(qū)的烤煙赤星病菌致病力、生物學(xué)特性和不同藥劑的抑菌效果進(jìn)行試驗(yàn)，旨在為宜賓煙區(qū)赤星病的高效防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

2015年6月至2015年7月在煙草成熟期，從宜賓筠連、興文、珙縣、屏山、長(zhǎng)寧5個(gè)縣烤煙種植區(qū)采集具有典型赤星病癥狀的煙葉樣品，置于4 ℃冰箱保存，待分離。

1.2 供試藥劑

根據(jù)中煙葉生[2015]24號(hào)文件及中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)（http：//www.chinapesticide.gov.cn/）選擇供試藥劑。10%多抗霉素WP（陜西綠盾生物制品有限責(zé)任公司）；40%菌核凈WP（浙江斯佩斯植保有限公司）；60%唑醚·代森聯(lián)WG（巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司）；50%氯溴異氰尿酸WP（河南銀田精細(xì)化工有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 赤星病病菌的分離與鑒定 在采集樣品的病健交界處切取邊長(zhǎng)約0.5 cm大小的組織塊，用75%酒精消毒30 s，再用3% NaClO消毒約2 min后，用無(wú)菌水清洗3遍后用滅過(guò)菌的濾紙將組織塊表面吸干，移植于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)3 d后對(duì)菌落進(jìn)行純化并單孢分離。將純化的菌株在PDA平板上常規(guī)培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)學(xué)特征，并挑取少許菌絲制成玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。參照關(guān)博元[9]的方法進(jìn)行菌株產(chǎn)孢表型觀察，并按具短分枝的孢子鏈，支鏈一般長(zhǎng)1～5個(gè)孢子為鏈格孢和形成10～15個(gè)孢子長(zhǎng)的分生孢子鏈，孢子鏈通常不分枝，個(gè)別分枝形成l～3個(gè)孢子的側(cè)鏈為長(zhǎng)柄鏈格孢。

1.3.2 赤星病菌株致病力的測(cè)定 將保存的赤星病菌株在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)5 d后，用5 mm內(nèi)徑的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。采摘宜賓煙區(qū)主要栽培品種K326（感赤星?。┲邢虏拷】道鲜烊~片（葉片部位、葉色均勻一致），用75%的酒精棉球?qū)熑~表面消毒，用無(wú)菌水沖洗3次，晾干。每片煙葉以葉脈為分界，用滅菌針將煙葉表面對(duì)稱(chēng)的刺10個(gè)位點(diǎn)，每邊5個(gè)位點(diǎn)。將有菌絲的餅面朝下輕貼于煙葉表面的針刺位點(diǎn)上，以無(wú)菌PDA培養(yǎng)基（直徑5 mm）接種作對(duì)照，每菌株接種2張葉片。接種的離體葉片放在瓷盤(pán)（經(jīng)紫外線滅菌）中的紗布（用滅菌水浸濕的四層滅菌紗布）上，然后用保鮮膜將盤(pán)口封嚴(yán)并置于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。按病斑大小統(tǒng)計(jì)各接種位點(diǎn)的發(fā)病嚴(yán)重度，參照易龍等[10]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1），并根據(jù)公式A計(jì)算病情指數(shù)，確定各赤星病菌株致病力的強(qiáng)弱。

1.3.3 赤星病病菌生物學(xué)特性的測(cè)定 （1） 溫度對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響。將分離純化的赤星病菌移植到PDA平板上，培養(yǎng)3 d后，用無(wú)菌打孔器在菌落生長(zhǎng)邊緣處打取直徑為5 mm的菌餅。將病原菌菌餅移植于PDA平板上，分別置于7，14，21，28和35 ℃ 5個(gè)溫度條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。5 d后采用十字交叉法和血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)量菌落直徑增長(zhǎng)量和不同處理產(chǎn)孢量；（2） 濕度對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響。參考Winton等[11]的方法，將不同飽和鹽溶液倒入大培養(yǎng)皿，并用封口膜密封，造成不同相對(duì)濕度（RH，40%，60%，80%和100%）的試驗(yàn)環(huán)境。將PDA平板在50 ℃真空干燥箱中烘干，將赤星病菌餅（直徑5 mm）移植于PDA平板中央，除去皿蓋置入各不同RH的大培養(yǎng)皿中，在28 ℃下培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。5 d后采用十字交叉法和血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)量菌落直徑增長(zhǎng)量和不同處理產(chǎn)孢量；（3） pH值對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響。用1 mol·L-1和1mol·L-1 NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基pH值分別為4，5.5，7，8.5和10。將病原菌菌餅（直徑5 mm）分別接種于不同pH值的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。5 d后采用十字交叉法和血球計(jì)數(shù)板分別測(cè)量菌落直徑增長(zhǎng)量和不同處理產(chǎn)孢量。

1.3.4 不同藥劑對(duì)赤星病菌株抑制效果 試驗(yàn)以生長(zhǎng)速率法（瓊脂平板法）測(cè)定各藥劑對(duì)赤星病菌株（xs-k-1）菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，各化學(xué)藥劑藥液濃度分別為200.0，100.0，50.0，25.0和12.5 g·mL-1。在預(yù)培養(yǎng)3 d的菌落邊緣打取5 mm直徑的新鮮菌餅接種于不同藥液濃度梯度的PDA培養(yǎng)基上，每皿1塊，3次重復(fù)，以不加藥劑的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取平均值，計(jì)算抑制率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel2007、DPS7.05和SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤星病菌株的分離與鑒定

從采集煙葉樣品上分離獲得21個(gè)菌株（表2），其中興文13株，筠連2株，長(zhǎng)寧3株，珙縣 1株，屏山2株。在PDA培養(yǎng)基上，初期為白色，后逐漸呈現(xiàn)灰黑色或暗綠色同心輪狀菌落，菌落絨氈狀，平整，擴(kuò)展較快，與于莉等[12]報(bào)道基本一致。經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分生孢子單生或短鏈生，倒棒錘形或橢圓形，淡褐色至褐色，具2～6個(gè)橫膈膜和1～3個(gè)縱、斜隔膜，孢身10～45×5.5～18 μm；在分生孢子梗上形成具短分枝的孢子鏈，支鏈一般長(zhǎng)1～5個(gè)孢子，表現(xiàn)出鏈格孢菌的典型特征。

2.2 赤星病菌株致病力的測(cè)定

根據(jù)嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和致病力強(qiáng)弱分化標(biāo)準(zhǔn)對(duì)21個(gè)菌株測(cè)定結(jié)果表明，供試菌株在鑒別煙葉（K326）上的平均病指為18.75～71.25，致病力存在明顯的差異（表3），其中較強(qiáng)致病力菌株4個(gè)，占測(cè)試菌株的19.05%，中等致病力菌株13個(gè)，占測(cè)試菌株的61.9%，弱致病力菌株4個(gè)，占測(cè)試菌株的19.05%。上述結(jié)果表明，在宜賓烤煙種植區(qū)，中等致病力類(lèi)型的菌株占有主導(dǎo)地位，弱致病力類(lèi)型和較強(qiáng)致病力類(lèi)型的菌株所占比例相當(dāng)，未發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力和不致病力菌株。

2.3 赤星病病菌生物學(xué)特性的測(cè)定

2.3.1 溫度對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均具有顯著性影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，病菌在7～35 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。其中，病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的適宜溫度是21～28 ℃；在28 ℃溫度下，病菌生長(zhǎng)最大，產(chǎn)孢最多，分別為4.72 cm和4.2×105 個(gè)·mL-1。

2.3.2 濕度對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，赤星病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均需要高濕度環(huán)境條件。病菌的生長(zhǎng)隨濕度增加逐漸增大，當(dāng)濕度達(dá)到80%后病菌增長(zhǎng)緩慢，且與濕度在100%時(shí)差異不顯著；病菌的產(chǎn)孢量隨濕度增加而顯著增多，且在不同濕度條件下，病菌產(chǎn)孢量差異達(dá)極顯著，當(dāng)濕度達(dá)100%時(shí)，孢子數(shù)達(dá)到最大值，產(chǎn)孢量為4.18×105 個(gè)·mL-1。

2.3.3 pH值對(duì)赤星病菌生長(zhǎng)的影響 在不同的酸堿度環(huán)境下，病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均具有明顯差異。測(cè)定結(jié)果（圖3）表明，赤星病菌在4～10的pH值范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的適宜pH值為7～8.5，在pH值為8.5的PDA培養(yǎng)基上病菌生長(zhǎng)最大，pH值為7的PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最多。

2.4 不同藥劑對(duì)赤星病菌株的抑制效果

從表4可以看出，各藥劑對(duì)赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均隨藥液濃度的增加而升高，且不同藥劑的抑制效果有差異。比較EC50，10%多抗霉素對(duì)赤星病菌絲的抑制效果最好，EC50為15.182 μg·mL-1；40%菌核凈對(duì)赤星病菌絲的抑制效果最差，EC50為50.818 μg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

采用組織分離法從宜賓植煙區(qū)采集的具典型赤星病癥狀的煙葉樣品上分離赤星病菌，并進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果表明，21個(gè)菌株在分生孢子梗上形成具短分枝的孢子鏈，支鏈一般長(zhǎng)1～5個(gè)孢子，表現(xiàn)出鏈格孢菌的典型特征，但不同菌株的致病力差異明顯，其中以中等致病力類(lèi)型的菌株為主，占測(cè)試菌株的61.9%，弱致病力類(lèi)型和較強(qiáng)致病力類(lèi)型的菌株所占比例相當(dāng)，未發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病力和不致病力菌株，這一現(xiàn)象可能與宜賓高溫高濕的環(huán)境因素有關(guān)，也可能受樣品采集的限制，宜賓地區(qū)煙草赤星病有無(wú)其他致病力菌株有待進(jìn)一步研究。

目前有關(guān)煙草赤星病菌生物學(xué)特性研究的報(bào)道較多。本文通過(guò)對(duì)宜賓地區(qū)煙草赤星病菌的生物學(xué)特性研究表明，煙草赤星病菌在7～35 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，最適宜的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度為21～28 ℃；高濕度有利于病菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，當(dāng)濕度為100%時(shí)，病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量最高，分別為5.83 cm和4.18×105 個(gè)·mL-1；在pH值4～10的范圍內(nèi)該病菌均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，適宜pH值范圍為7～8.5，其中病菌生長(zhǎng)的最適pH值為8.5，產(chǎn)孢量最大的pH值為7 ，這一研究結(jié)果與杜雷等[4]對(duì)安徽煙草赤星病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果較一致。該試驗(yàn)結(jié)果可為宜賓煙區(qū)赤星病發(fā)生發(fā)展規(guī)律的預(yù)測(cè)預(yù)警提供參考。

室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，4種供試藥劑對(duì)赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果為：10%多抗霉素>60%唑醚·代森聯(lián)>50%氯溴異氰尿酸>40%菌核凈。10%多抗霉素和60%唑醚·代森聯(lián)對(duì)赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌效果顯著，EC50值分別為15.182 μg·mL-1和19.828 μg·mL-1；40%菌核凈抑菌效果最差，EC50為50.818 μg·mL-1，這可能是由于40%菌核凈積年累月的使用導(dǎo)致赤星病菌對(duì)其產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗性。

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