富硒蛹蟲(chóng)草的篩選及其耐硒特征的研究

趙建英 賀瑩 邊小娜

摘 要：該文通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出一株發(fā)酵周期短、菌絲體產(chǎn)量及富硒量較高的優(yōu)質(zhì)菌株北冬蟲(chóng)夏草1，研究冬蟲(chóng)夏草的耐硒特征。結(jié)果表明，在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，北冬蟲(chóng)夏草的耐亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時(shí)，其生物量達(dá)到12.01g/L，富硒量達(dá)到4.635μg/mL，富硒率達(dá)到385.92μg/g。研究富硒北冬蟲(chóng)夏草的生長(zhǎng)過(guò)程曲線，了解到當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72h左右時(shí)，其生物量最大且此時(shí)的富硒效果最好。

關(guān)鍵詞：北冬蟲(chóng)夏草；亞硒酸鈉；硒含量測(cè)定；生長(zhǎng)曲線

中圖分類(lèi)號(hào) TS213.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）19-0037-02

Abstract：The selenium- enriched Cordyceps was screened， and the mutant Cordyceps 1 was obtianded. Fermentation conditions were investigated，the concentration of sodium selenite resistant 12μg/ml.Under the optimized conditions， the selenium content of the cells was up to 12.01g/L，Se amount was up to4.635μg/ml， selenium-riched rate was up to 385.92μg/g. The growth curve of cordyceps shows when the incubation time was about 72h， the biomass is the largest and the effect of selenium- enriched is the best.

Key words：Cordyceps；Selenite；Determination of selenium content；Growth curve

北冬蟲(chóng)夏草（蛹蟲(chóng)草）生活史的有性階段包括菌絲體生長(zhǎng)和子實(shí)體生長(zhǎng)[1]。鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)把蛹草擬青霉的孢子食入體內(nèi)，還可以自由活動(dòng)，即為“冬蟲(chóng)”，當(dāng)條件適宜時(shí)，孢子便萌發(fā)形成菌絲體，菌絲體吸取蟲(chóng)蛹的營(yíng)養(yǎng)作為其生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)和能源[2]。

硒是人體必需的微量元素之一，研究發(fā)現(xiàn)，硒尤其是有機(jī)硒具有預(yù)防心腦血管疾病、抗腫瘤、提高免疫力、促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育等作用，人體缺硒會(huì)導(dǎo)致多種疾病。據(jù)硒鹽的毒理分析表明，無(wú)機(jī)硒均為劇毒，且不易被人體吸收，而有機(jī)硒化合物毒性遠(yuǎn)低于無(wú)機(jī)硒化合物，且生物利用率高[3]。通過(guò)人工方法將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，具有普遍的食用和保健價(jià)值。無(wú)機(jī)硒在蟲(chóng)草體內(nèi)通過(guò)菌絲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝，結(jié)合到大分子活性物質(zhì)（如多糖和蛋白質(zhì)）上，轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒多糖和硒蛋白，從而發(fā)揮了硒和蟲(chóng)草固有的以及協(xié)同的生理作用，使其具有無(wú)毒、安全、高效的生理活性，進(jìn)而為開(kāi)發(fā)天然的富硒蛹蟲(chóng)草提供科學(xué)的理論依據(jù)[4]。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌種 供試蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris）為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，各菌株編號(hào)：蛹蟲(chóng)草1，蛹蟲(chóng)草2，蛹蟲(chóng)草3。

1.1.2 試劑 土豆，黃豆，玉米粉（均購(gòu)自同達(dá)森客超市）；葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，硝酸銨，氯化銨，硫酸銨（均為分析純），蛋白胨，酵母粉，實(shí)驗(yàn)室已具有。酵子：玉米面活性干酵母。

1.2 儀器與設(shè)備 KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司），生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器有限公司，型號(hào) SPX-250），手提式蒸汽滅菌器（江陰濱江設(shè)備有限公司），超凈工作臺(tái)（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司，型號(hào) ZHJH-C1112B），恒溫震蕩培養(yǎng)器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司，型號(hào)ZWY-100D）。

1.3 蛹蟲(chóng)草富硒菌株的選育 取0.2～0.3cm的三種菌種的組織塊分別接種到亞硒酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量150mL/250mL，置于19℃、130r/min的恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩培養(yǎng)72h，測(cè)定其發(fā)酵液中殘留無(wú)機(jī)硒（殘硒）的含量及其生物量[5]。

1.4 富硒蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液的制備 將三角錐瓶中培養(yǎng)的液體移入離心管中，稱(chēng)重后等量對(duì)稱(chēng)放置在臺(tái)式離心機(jī)中，以4 000r/min的轉(zhuǎn)速常溫離心30min，離心后的上清液即為發(fā)酵液[6]。

1.5 蛹蟲(chóng)草生物量測(cè)定 采用干重法，將三角錐瓶中培養(yǎng)的液體移入離心管中，稱(chēng)重后等量對(duì)稱(chēng)放置在臺(tái)式離心機(jī)中，以4 000r/min的轉(zhuǎn)速常溫離心30min，傾去上清液，將固體放到稱(chēng)量紙上，置于精密電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，100℃烘干至恒重，稱(chēng)量[7]。

1.6 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參加文獻(xiàn)[8]。

1.7 發(fā)酵液中殘留無(wú)機(jī)硒（殘硒）含量測(cè)定 參加文獻(xiàn)[9]。

1.8 蛹蟲(chóng)草耐硒實(shí)驗(yàn) 參加文獻(xiàn)[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲(chóng)草富硒菌株的選育

2.1.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以亞硒酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，以420nm處的吸光值為縱坐標(biāo)做圖，得硒標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），其回歸線性方程為y=0.0070x-0.0050。

2.1.2 富硒菌株的選育 從表1可以看出，在指標(biāo)生物量的考察中蛹蟲(chóng)草1占優(yōu)勢(shì)，在指標(biāo)富硒量的考察中蛹蟲(chóng)草1占優(yōu)勢(shì)，在指標(biāo)富硒率的考察中蛹蟲(chóng)草1同樣占優(yōu)勢(shì)。該實(shí)驗(yàn)表明，在同等實(shí)驗(yàn)條件下蛹蟲(chóng)草1富硒效果最好。

2.2 蛹蟲(chóng)草耐硒實(shí)驗(yàn) 表2顯示了亞硒酸鈉濃度對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體的生長(zhǎng)情況和富硒效果的影響。由表2可以看出，培養(yǎng)基中亞硒酸鈉濃度的高低會(huì)影響蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，生物量呈下降趨勢(shì)。亞硒酸鈉有一定的毒性，當(dāng)亞硒酸鈉濃度低于12μg/mL時(shí)，它的加入雖然會(huì)影響蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)，但并不顯著。當(dāng)亞硒酸鈉濃度超過(guò)14μg/mL時(shí)，蛹蟲(chóng)草的生物量急劇下降，表明蛹蟲(chóng)草在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中耐硒濃度為12μg/mL。由表2還可以看出，隨著培養(yǎng)基濃度的增加，蛹蟲(chóng)草菌絲體的富硒量越高，其富硒效果越好，然而當(dāng)亞硒酸鈉濃度達(dá)到14μg/mL時(shí)，發(fā)酵液由淡黃色變?yōu)榉奂t褐色，這可能是由于蛹蟲(chóng)草將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒而不是轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的緣故。當(dāng)亞硒酸鈉的濃度較高時(shí)（超過(guò)14μg/mL后），盡管富硒率繼續(xù)增加，但富硒量與生物量已顯著下降，因此，蛹蟲(chóng)草1搖瓶培養(yǎng)時(shí)的耐亞硒酸鈉最大濃度為12μg/mL，此時(shí)蛹蟲(chóng)草1的生物量可以達(dá)到12.01g/L，富硒量達(dá)到4.635μg/mL，富硒率達(dá)到385.92μg/g。

2.3 蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn) 圖2、3顯示了蛹蟲(chóng)草生物量與富硒量隨培養(yǎng)時(shí)間變化的關(guān)系。由圖2、3可以看出，當(dāng)蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)72h時(shí)，生物量與富硒量均達(dá)到最高值，培養(yǎng)時(shí)間從12h到72h，蛹蟲(chóng)草的菌絲體生物量與富硒量逐漸增加，而72h之后菌絲體的生物量和富硒量急劇下降，此時(shí)菌絲體出現(xiàn)了明顯的萎縮、老化現(xiàn)象，而富硒量下降的原因還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文研究了蛹蟲(chóng)草的耐硒特征，結(jié)果表明，在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，蛹蟲(chóng)草耐亞硒酸鈉濃度為12μg/mL時(shí)，生物量達(dá)到12.01g/L，富硒量達(dá)到4.635μg/mL，富硒率達(dá)到385.92μg/g。

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（責(zé)編：張宏民）