乳頭管灌注LPS對(duì)家兔血液中NO和NOS含量的影響

袁曦 曹隨忠 楊齊

摘 要：目的：探討急性乳腺炎對(duì)家兔血液中一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合酶（NOS）活力的影響，為臨床治療家兔乳腺炎提供依據(jù)。方法：通過家兔乳頭管灌注LPS建立家兔乳腺炎模型，在灌注內(nèi)毒素前后不同時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定健康家兔和患病家兔血清中NO的含量和NOS活力，判定乳頭管灌注LPS對(duì)家兔血液中NO含量和NOS活力的影響。結(jié)果：乳頭管灌注LPS之后，有明顯的體溫變化，乳房先稍有腫脹，12h后變紅腫，48h變堅(jiān)硬，5d硬度下降。NO含量和NOS活力均在灌注LPS后上升并在6h達(dá)到最高值，NO含量在24h時(shí)開始下降，72h時(shí)基本下降到接種前水平；NOS活力在12h開始下降，48h時(shí)又開始增加。結(jié)論：乳頭管灌注LPS對(duì)家兔血液中NO含量和NOS活力有影響，NO和NOS在乳腺炎的發(fā)展過程中有一定的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：LPS；家兔；NO；NOS

中圖分類號(hào) S858.291 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）19-0085-04

Abstract：[Objective]To explore the effect of acute mastitis on nitric oxide （NO） content and nitric oxide synthase （NOS） activity in rabbit blood ， provide the basis for clinical treatment of mastitis.[Methods]Through the rabbits nipple tube perfusion LPS to establish rabbit mastitis model.at different time pointsbefore and after the infusion of endotoxin，determination of NO content and NOS activity in serum of healthy and diseased rabbits，to determine the effect of nipple tube perfusion LPS on NO content and NOS activity in rabbit blood.[Results]NippletubeafterLPSinfusion， showing significant changes in body temperature，Breast to slightly swollen， 12 hours later become inflamed，48hours become hard，5 days later decreased hardness，NO content and NOS activity were increased after LPS perfusion，And reached the highest value in the 6 hours，NO content began to decline in 24 hours，dropped to the level before vaccination in 72 hours；NOS activity began to decline in 12 hours，began to increase again in 48 hours.[Conclusion]Nipple tube perfusion LPS on rabbit blood NO content and NOS activity， NO and NOS have a certain role in the development process of mastitis， providing a theoretical basis for clinical treatment.

Key words：LPS；Rabbits；NO；NOS

乳腺炎又名乳房炎，是當(dāng)今世界各國(guó)奶牛業(yè)中最常見也是造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一。奶牛患上乳腺炎后，不僅會(huì)影響牛奶的產(chǎn)量，降低牛奶的品質(zhì)，還易延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情和妊娠的時(shí)間，甚至使病牛失去生產(chǎn)性能，使處于產(chǎn)奶高峰期的奶牛過早被淘汰，給奶牛行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。乳腺炎主要是由多種非特定的病原微生物引起，目前已發(fā)現(xiàn)約有130多種，常見的有23種，其中細(xì)菌14種，霉形體2種，真菌及病毒7種，給乳腺炎的防治帶來了很大的困難[2]，其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是最常見的分離菌株。脂多糖（LPS）作為革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的主要成分，是導(dǎo)致炎癥和感染的重要原因。炎癥、感染、創(chuàng)傷后早期，病變部位的血管包括微循環(huán)血管中即出現(xiàn)白細(xì)胞黏附現(xiàn)象。黏附的白細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)、活性氧等，使組織損傷加重[3]。NO參與炎癥反應(yīng)，作用比較復(fù)雜，有廣泛的生物活性[4]。

一氧化氮（NO）是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的內(nèi)源性血管舒張因子[5]。一氧化氮為氣體自由基，易于氧分子、超氧自由基等反應(yīng)，在體內(nèi)極不穩(wěn)定，生物半衰期短，只有3～5s，微溶于水，具有親脂性，能透過生物膜擴(kuò)散，發(fā)揮信息功能[6]。NO在生物體內(nèi)主要由一氧化氮合酶催化合成，在NADPH和/或BH4存在的條件下，NOS催化L-精氨酸末端胍基中的一個(gè)氮原子和氧分子反應(yīng)生成NO和胍氨酸[7]。NO在循環(huán)系統(tǒng)中有著廣泛的生理作用：血管內(nèi)皮釋放的NO通過升高血管平滑肌cGMP水平，使血管平滑肌松弛，引起血管擴(kuò)張，血壓下降，調(diào)節(jié)血管張力等；NO抑制淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞及血小板凝集和黏附到內(nèi)皮細(xì)胞上；NO對(duì)血管通透性的影響與血管的性質(zhì)有關(guān)，在大血管中降低通透性，在微血管中則促進(jìn)[8]。

一氧化氮合酶（NOS）包括三個(gè)酶家族，神經(jīng)元型一氧化氮合酶（NOS-Ⅰ），誘導(dǎo)型一氧化氮（NOS-Ⅱ）和內(nèi)皮一氧化氮合酶（NOS-Ⅲ），神經(jīng)元內(nèi)和內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合酶統(tǒng)稱結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（TNOS）[9]。TNOS可源源不斷的產(chǎn)生，而iNOS只在受到感染或其他方面的刺激才產(chǎn)生。NOS可以催化L-精氨酸生成氨甲酰鳥氨酸，同時(shí)伴隨著NADPH的氧化，從而生成游離的NO[10]。微量LPS刺激成纖維細(xì)胞可引起細(xì)胞增殖，并增加細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)[11]。

本研究通過乳頭管灌注LPS建立家兔急性乳腺炎模型[12，13]，測(cè)定乳腺炎發(fā)展過程中NO含量和NOS活性，根據(jù)其變化，探究乳腺炎過程中NO和NOS的作用，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 5只健康的懷孕15d左右的家兔（購于四川省名山縣），均為初產(chǎn)兔，體重4.0kg左右，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 試劑盒：一氧化氮試劑盒、一氧化氮合酶試劑盒（均購于南京建成生物試劑研究所）。藥品：大腸桿菌內(nèi)毒素（Sigma公司）、滅菌生理鹽水、75%酒精。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 Varioskan 酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國(guó)）、血常規(guī)檢測(cè)儀、注射器、頭皮針、EP管、真空采血管、移液槍、96孔板、溫度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LPS灌注液的配制及灌注方法 LPS（Sigma公司）由O55：B5血清型大腸桿菌分離提純，滅菌生理鹽水配成1mg/mL，-20℃避光保存?zhèn)溆?。灌注LPS劑量按150μg/kg體重劑量從第三對(duì)乳腺乳頭管注入。灌注LPS之前的泌乳母兔作為對(duì)照組，灌注LPS之后的為實(shí)驗(yàn)組。母兔分娩后仔兔自然哺乳，于第7天將母兔與仔兔分離。用75%的酒精對(duì)第三對(duì)乳腺區(qū)域進(jìn)行消毒，然后用1mL的注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，注入一定量的LPS。

1.2.2 血樣的采集 采血的時(shí)間點(diǎn)為灌注LPS之前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h和5d。采集母兔耳緣靜脈血2mL，將全血分成2份，一份全血抗凝用于血常規(guī)的測(cè)定；另一份全血于2 000r/min離心15min分離血清，-20℃保存，用于血清NO含量和NOS活力的測(cè)定。

1.2.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

1.2.3.1 體溫的測(cè)定 在采血時(shí)間點(diǎn)灌注LPS前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h和5d，在采血前測(cè)直腸體溫，并觀察乳房局部變化。

1.2.3.2 血清一氧化氮NO含量測(cè)定 采用硝酸還原酶法，按南京建成生物工程研究所提供的NO試劑盒說明測(cè)定。

1.2.3.3 血清一氧化氮合酶（NOS）活力的測(cè)定 采用顯色反應(yīng)法，按南京建成生物工程研究所提供的NOS測(cè)定試劑盒說明測(cè)定。

1.2.3.4 母兔血液白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、單核細(xì)胞（MID）的總數(shù)的測(cè)定 每次采血后，用其中一份全血進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 在采血后立即做血常規(guī)檢測(cè)，NO和NOS的數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003軟件整理，SPSS1 3.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行一維方差分析、t檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)注差（X±SD）表示，組間用t檢驗(yàn)其差異顯著性[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 評(píng)價(jià)乳房炎模型指標(biāo)的變化

2.1.1 母兔的體溫變化 母兔均在灌注LPS后6～12h內(nèi)的溫度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），12h時(shí)體溫均上升到41℃，分別于24h、48h時(shí)體溫恢復(fù)到對(duì)照組水平（圖1）。

2.1.2 母兔血液白細(xì)胞（WBC）、淋巴細(xì)胞（LYM）、中間細(xì)胞（MID）的總數(shù)動(dòng)態(tài)變化 灌注LPS后6h，白細(xì)胞總數(shù)升高，72h后開始降低，到第5d是恢復(fù)到對(duì)照組水平（圖2）。淋巴細(xì)胞和中間細(xì)胞（包括單核細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞）在灌注LPS后6h總數(shù)逐漸降低，24h后逐漸升高，72h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平（圖3、圖4）。

2.2 NO含量和NOS活力的變化 乳頭管灌注LPS后，NO含量先稍有升高，24h時(shí)開始下降，72h時(shí)基本下降到接種前水平。NOS活力在6h時(shí)稍有上升趨勢(shì)，12h開始回降，48h時(shí)又開始增加（圖5、圖6、表1、表2）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 對(duì)乳房炎模型的評(píng)價(jià) 乳房?jī)?nèi)注入內(nèi)毒素后，動(dòng)物體溫升高，乳房局部的臨床變化等全身癥狀是急性期病理反應(yīng)的一種表現(xiàn)[16]。乳房局部變化先稍有腫脹，12h后變紅腫，48h變堅(jiān)硬，5d堅(jiān)硬降低。體溫的變化雖然不是乳房炎診斷的特征性指標(biāo)，但可反應(yīng)疾病發(fā)生時(shí)的全身反應(yīng)。血液中炎性細(xì)胞總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)一步證實(shí)乳房炎的發(fā)展過程及動(dòng)物機(jī)體對(duì)灌注LPS后的反應(yīng)及抵御能力。中性粒細(xì)胞增多常見于感染性疾病和一般炎性疾病，淋巴細(xì)胞減少見于中性粒細(xì)胞絕對(duì)增多的疾病，單核細(xì)胞減少見于急性傳染病的初期及各種疾病的垂危期[17]。本實(shí)驗(yàn)中的乳房炎模型各指標(biāo)的變化與文獻(xiàn)[1，10，12-13]中變化相同。

3.1.2 乳頭管灌注LPS對(duì)家兔血液中NO含量和NOS活力有影響 通過本試驗(yàn)，乳頭管灌注LPS后，NO含量和NOS活力均在灌注后6h達(dá)到最高值，NO含量先稍有升高，24h時(shí)開始下降，72h時(shí)基本下降到接種前水平，灌注后6h與灌注前2h和灌注后12h差異顯著（P<0.05）。NOS活力在6h時(shí)稍有上升趨勢(shì)，12h開始回降，48h時(shí)又開始增加，灌注后6h與灌注前2h和灌注后12h差異顯著（P<0.05）。與文獻(xiàn)[5，18-19]報(bào)道相同。由試驗(yàn)結(jié)果可見，血液中NO含量和NOS活力的變化對(duì)急性乳腺炎有一定的治療作用。NO是獨(dú)立存在于血管、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)中的生理性調(diào)節(jié)因子[20]。NO由NOS催化生成，適量NO可發(fā)揮舒張血管、抑制血小板凝集和黏附以及PMN的聚集等作用；還可彌散作用于突觸前、后膜上的受體，發(fā)揮神經(jīng)信號(hào)傳遞功能；而過量NO可破壞酶活性，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。一氧化氮合酶（NOS）包括結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（TNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），TNOS可源源不斷的產(chǎn)生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激是才產(chǎn)生[9]。在許多組織中NOS活性有其組織特異性，某一種組織以表達(dá)一種類型測(cè)同工酶為主，如神經(jīng)元主要表達(dá)（NOS-Ⅰ），內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)特異性地表達(dá)（NOS-Ⅲ）等[21]。內(nèi)毒素可直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO[22]。

微血管內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，可以激活白細(xì)胞，使進(jìn)入組織的循環(huán)白細(xì)胞增加，并趨化白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位。而血管內(nèi)皮分泌的NO可以維持血管動(dòng)態(tài)平衡，抑制白細(xì)胞貼壁，控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展[23]。

NOS是生成NO的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一方面在結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（TNOS）的作用下參與生理性調(diào)節(jié)血管張力過程，另一方面它又在其他一些細(xì)胞因子的刺激下，激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，參與機(jī)體的病理反應(yīng)[24]。

通過本試驗(yàn)結(jié)果可見，乳頭管灌注LPS后6h時(shí)NOS活力顯著升高，之后開始降低，48h時(shí)又有升高趨勢(shì)。乳頭管灌注LPS后，機(jī)體馬上做出反應(yīng)，促使NOS的活性提高，NOS的活性提高之后可以催化產(chǎn)生更多的NO，一氧化氮生成量的增加可加快血流速度[22]，血流速度的加快，加快炎性物質(zhì)的帶走，帶來更多的抗炎物質(zhì)，有利于快速的抗炎。NO含量在6h與12h組間差異顯著，可見NO含量的升高速度很快，NO的含量在6h時(shí)達(dá)到最高值[19]，說明此時(shí)機(jī)體的抗炎達(dá)到最大程度，NO對(duì)急性炎癥有較大效果。NO達(dá)到一定含量是反而抑制了NOS的活力，使NOS的活力下降[8]。TNOS可源源不斷的產(chǎn)生，而iNOS只有在受到感染或其他刺激是才產(chǎn)生。至于乳頭管灌注LPS后機(jī)體所產(chǎn)生的NO主要由TNOS還是iNOS催化合成，還尚待探究。

3.2 結(jié)論 通過本試驗(yàn)可得出，乳頭管灌注LPS造成家兔的急性乳腺炎后，家兔血液中NO含量和NOS活力明顯增加，隨著NO含量和NOS活力的變化，說明NO和NOS在乳腺炎的發(fā)展過程中有一定的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]曹隨忠，楊德英，余樹民，等.乳頭管灌注脂多糖誘發(fā)兔實(shí)驗(yàn)性乳房炎模型的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（11）：26-27.

[2]包紅朵，王恬.乳腺炎病原菌的致病機(jī)理與防治的研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2009，1：34-36.

[3]倪俊，于寶軍，顧海峰，等.一氧化氮在中性粒細(xì)胞與激活的內(nèi)皮細(xì)胞間黏附中介導(dǎo)的作用[J].中國(guó)微循環(huán)，2006，10（6）：419-420.

[4]Moncada S，Palmer RMJ.Nitric oxide[J].pathophysiology and pharmacology，1991，43：109-142.

[5]段慧琴，喬健，張永東，等.LPS對(duì)大鼠腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（9）：974-976.

[6]Ishibashi Y，Takahashi N，Tokumaru A，et al.Activation of Inducible NOS in peripheral vessels and Outcomes in Heart Failure Patients[J].Journal of Cardiac Failure，2008，9（14）：724-731.

[7]周健.安君康心膠囊對(duì)冠心病患者ET、NO、NOS、SOD及血液流變學(xué)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2006，13（3）：139-140.

[8]鄭榮梁，黃中洋.自由基生物學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2007：27-30.

[9]侯麗.一種特殊的生物信使分子一氧化氮[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，20（4）：402-403.

[10]孫忠人.王振宇，華金雙.艾灸預(yù)處理對(duì)全腦缺血再灌注大鼠模型一氧化氮合酶活性的影響[J].針灸臨床雜志，2011，27（1）：52-54.

[11]聞平，王平，溫旺榮，等.一氧化氮在細(xì)菌脂多糖促成纖維細(xì)胞增殖中的作用[J].世界感染雜志，2001，1（2）：112-114.

[12]伍杰，劉娟，陳躍紅，等.家兔臨床型乳腺炎病理模型的制備[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：223-225.

[13]鐘凱，王艷玲，鄒思湘，等.乳頭管灌注內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠實(shí)驗(yàn)性乳房炎模型的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（5）：654-658.

[14]張勤.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：289-293.

[15]朱永平.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].昆明：云南科技出版社，2006：17-20：762-766.

[16]李楚杰.急性期反應(yīng)的病理生理[J].中國(guó)病理生理雜志，1997，13（6）：762-766.

[17]王俊東，劉宗平.獸醫(yī)臨床診斷學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009：200-204.

[18]苗晉鋒，馬海田，鄒思湘，等.內(nèi)毒素對(duì)山羊乳腺組織中與乳腺炎相關(guān)的酶和細(xì)胞因子的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36（6）：608-613.

[19]張永東，李玉冰，魏曉軍，等.不同劑量?jī)?nèi)毒素對(duì)小鼠血漿中NO分泌的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，1：95-96.

[20]張翠華，鄭永芳.血管內(nèi)皮舒張因子與一氧化氮[J].生理科學(xué)進(jìn)展，1995，26（2）：172-174.

[21]陳晉文，孫長(zhǎng)凱，黃遠(yuǎn)桂.一氧化氮合酶的若干研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23（4）：297-293.

[22]王新，譚建華，劉金玲，等.內(nèi)毒素對(duì)腸粘膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌一氧化氮和內(nèi)皮素的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（1）：4-6.

[23]厲曉，蔡英年，宿雙寧.脂多糖誘導(dǎo)地鼠肺泡巨噬細(xì)胞中一氧化氮對(duì)腫瘤壞死因子的調(diào)節(jié)作用[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2000，20（2）：41-43.

[24]張弘，劉建華，查冬青，等.慢性腎炎血清SOD、NO/NOS和T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)意義[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2008，6（11）：1145-1146.

（責(zé)編：張宏民）