剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

趙磊，夏楊毅,2*，姬雯馨

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400700)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400700)

肉制品在加工過程中經(jīng)常會受到剪切作用，如絞肉、斬拌、拌料混合、打漿、擠壓等機械剪切，管道輸送過程中的速度梯度剪切等。流體食品受剪切作用后黏度減小，具有剪切稀化效應(yīng)，多認為是剪切作用打破了體系原有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，減少了分子間的相互纏結(jié)造成的[1]。剪切稀化現(xiàn)象是可逆的，即當剪切作用取消后，剪切稀化效應(yīng)會在放置的過程中逐漸減小，這是因為在放置過程中布朗運動使大分子重新恢復(fù)到其無取向的自然狀態(tài)，被破壞的結(jié)構(gòu)重新形成[2]。

肌原纖維蛋白凝膠是通過蛋白質(zhì)分子變性聚集、分子間相互作用而形成的[3]，不同程度的剪切稀化效應(yīng)下，肌原纖維蛋白可能具有不同的凝膠性質(zhì)。肌原纖維蛋白的凝膠性質(zhì)直接關(guān)系到肉制品的硬度、持水性、咀嚼性等，影響肉制品的口感[4]，凝膠特性受到很多因素的影響，如鹽離子濃度[5]、pH[6]、高靜水壓[7]等，但目前關(guān)于剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠特性影響的研究還很少。

本實驗將肌原纖維蛋白溶液進行充分剪切(10 000 r/min，5 min)，在獲得一致的剪切稀化效應(yīng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)剪切稀化效應(yīng)隨放置時間延長逐漸減小的特性，通過控制放置時間獲得不同的剪切稀化程度，探究肌原纖維剪切稀化效應(yīng)對蛋白凝膠特性的影響，以期為肉制品加工參數(shù)優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購于永輝超市。

牛血清蛋白，上海麥克林生化科技有限公司；乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid,EGTA)，上海麥克林生化科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；MCR302模塊化旋轉(zhuǎn)與界面流變儀，德國Anton公司；TGL-16醫(yī)用冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；FSH-Ⅱ高速剪切器，江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；Spectrum 100紅外光譜儀，美國Perkin-Elmer公司；Phenom Pro 掃描電鏡，荷蘭Phenom World 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設(shè)計

剪切稀化效應(yīng)最直觀的體現(xiàn)在流體的黏度變化上，因此本實驗以黏度作為剪切稀化程度的指標，剪切稀化程度越高的溶液黏度越低。將肌原纖維蛋白溶液充分剪切后(10 000 r/min，5 min)，用保鮮膜封裝，在4 ℃ 條件下保存。實驗組通過放置0、12、24、36、48、60和72 h，獲得不同剪切稀化程度，再分別進行凝膠制備和參數(shù)測定；對照組每隔12 h進行充分剪切(10 000 r/min，5 min)，在此剪切條件下溶液的黏度處在同一水平，即剪切稀化程度相同，制備凝膠和測定參數(shù)，以排除放置過程中無關(guān)因素如氧化，水分蒸發(fā)等對凝膠的影響。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取

參照GE等[8]的方法，以雞胸肉為原料，去除多余脂肪和結(jié)締組織后攪碎，加入4倍體積的緩沖液A(內(nèi)含0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，10 mmol/L 乙二醇雙四乙酸，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0)勻漿(10 000 r/min，1 min)，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)后去除上清液，重復(fù)上述操作3次；將所得沉淀分散于4倍體積的緩沖液B(內(nèi)含0.1 mol/L NaCl，pH 7.0)勻漿(10 000 r/min，1 min)，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)后收集沉淀物，重復(fù)操作2次；加入4倍體積的緩沖液C(內(nèi)含0.1 mol/L NaCl，pH 6.0)，勻漿后用4層紗布過濾，離心(8 000 r/min，15 min，4 ℃)，離心后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3 肌原纖維蛋白熱致凝膠的制備

以牛血清蛋白做標準曲線，雙縮脲法測定蛋白濃度，用緩沖液(內(nèi)含0.6 mol/L NaCl，20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.5)調(diào)節(jié)蛋白濃度到40 mg/mL，經(jīng)10 000 r/min剪切5 min后，實驗組和對照組按照以下順序在水浴鍋中煮制凝膠：25 ℃平衡30 min、升溫到75 ℃并加熱30 min、取出冰浴30 min后于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 肌原纖維蛋白流變性質(zhì)的測定

參照DAI等[9]的方法，使用MCR302模塊化旋轉(zhuǎn)與界面流變儀進行旋轉(zhuǎn)測試和溫度掃描。旋轉(zhuǎn)測試使用PP50探頭，間隙為0.5 mm，剪切速率范圍為0.1～100 s-1。

溫度掃描使用PP50探頭，間隙為1 mm，溫度掃描范圍25～75 ℃，升溫速率1 ℃/min，振蕩頻率1 Hz，應(yīng)力振幅0.01。

1.3.5 凝膠持水性的測定

將制得的凝膠稱重到離心管中，在8 000×g，4 ℃下離心10 min后，移去多余水分，按照公式(1)計算凝膠的持水性：

(1)

式中：m1，離心管質(zhì)量，mg；m2，離心前的離心管與凝膠總質(zhì)量，mg；m3，離心后的離心管與凝膠總質(zhì)量，mg。

1.3.6 凝膠強度的測定

使用P/0.5模具，測定模板為TPA，觸發(fā)類型為Stain，測前、測中、測后速度分別為2、1.0、1.0 mm/s，觸發(fā)力5 g，形變40%，凝膠強度定義為穿破凝膠的壓力，單位為g。

1.3.7 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將制好的肌原纖維蛋白凝膠在2.5%(體積分數(shù))的戊二醛中固定48 h，用磷酸緩沖液(pH 6.5)清洗3次后依次用體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液洗脫30 min進行梯度脫水，用叔丁醇置換3次后冷凍干燥48 h，噴金處理，放大10 000倍觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.8 凝膠化學作用力的測定

0.5 g凝膠分別與9.5 mL SA溶液(含0.05 mol/L NaCl)、SB溶液(含0.6 mol/L NaCl)、SC溶液(含0.6 mol/L NaCl，1.5 mol/L尿素)、SD溶液(含0.6 mol/L NaCl，8 mol/L尿素)混合，均質(zhì)(10 000 r/min)3 min后，在4 ℃冰箱內(nèi)保存3 h后離心(10 000×g，4 ℃，15 min，)以牛血清蛋白做標準曲線，采用福林酚法[10]對上清液的蛋白質(zhì)含量進行測定。離子鍵、氫鍵、疏水相互作用分別采用SB與SA、SC與SB、SD與SC溶液中蛋白質(zhì)濃度差表示。

1.3.9 肌原纖維蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)的測定

使用傅里葉紅外光譜儀對肌原纖維蛋白凝膠的二級結(jié)構(gòu)進行測定。凝膠冷凍干燥48 h后用瑪瑙研缽磨成粉末，在全波長400～4 000 cm-1下掃描，測定條件：掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。使用儀器自帶軟件進行自動基線校正、平滑、標準化處理后，導出數(shù)據(jù)。各二級結(jié)構(gòu)的定量使用Peakfit 4.12對蛋白質(zhì)酰胺Ι帶(1 600～1 700 cm-1)進行分析，將導出的數(shù)據(jù)依次進行基線校正、Gaussian去卷積、二階導數(shù)擬合，根據(jù)各子峰面積計算α-螺旋(1 650～1 657 cm-1)；β-折疊(1 612～1 640 cm-1)；β-轉(zhuǎn)角(1 680～1 696 cm-1)；無規(guī)則卷曲(1 640～1 650 cm-1)占總二級結(jié)構(gòu)的比例[11]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS Statistics軟件，采用Duncan′s多重比較和顯著性分析(P<0.05)。圖形通過Origin 2018軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放置時間下肌原纖維蛋白剪切稀化程度的變化

圖1中的黏度曲線變化趨勢相同，黏度隨剪切速率增加而減小，表明肌原纖維蛋白溶液具有明顯的剪切稀化特性。對照組中，不同放置時間下的肌原纖維蛋白溶液進行充分剪切后(10 000 r/min，5 min)，黏度在130～165 Pa·s內(nèi)波動，與實驗組(黏度從139.80 Pa·s增加到845.87 Pa·s)相比變化并不明顯，說明在此剪切條件下(10 000 r/min，5 min)，肌原纖維蛋白溶液的黏度處在同一水平，可以得到一致的剪切稀化程度。

a-實驗組；b-對照組圖1 不同放置時間下肌原纖維蛋白的黏度隨剪切速率的變化Fig.1 Change in viscosity of myofibrillar protein with shear rate under different storage time

實驗組中，肌原纖維蛋白溶液在0～72 h的放置過程中，黏度隨放置時間逐漸增加，分別為139.80、557.80、708.18、761.06、798.72、824.20、845.87 Pa·s，表明剪切稀化程度隨放置時間的延長而逐漸減??；而且黏度隨時間變化的幅度越來越小，當時間從60 h增加到72 h時，黏度不再明顯增加，說明放置72 h的肌原纖維蛋白溶液已經(jīng)接近零剪切的狀態(tài)。

可以從兩方面來解釋剪切稀化效應(yīng)隨放置時間延長而減小的現(xiàn)象：一是剪切作用破壞了肌原纖維蛋白的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，在放置過程中被破壞的結(jié)構(gòu)重新形成，使黏度上升，剪切稀化程度逐漸減??；另一方面，剪切作用后使散亂的肌原纖維蛋白滾動旋轉(zhuǎn)而收縮成團，減少了相互的纏結(jié)，在放置過程中蛋白質(zhì)分子重新回到原來的自然狀態(tài)，相互勾掛纏結(jié)，使黏度上升，剪切稀化效應(yīng)逐漸減小[2]。

2.2 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白儲能模量的影響

儲能模量是指樣品在彈性形變中儲存能量的大小，其數(shù)值大小與被測物體的彈性相關(guān)[12]。如圖2所示，實驗組和對照組的儲能模量變化趨勢相似：在25～45 ℃儲能模量緩慢增加，因為升溫使肌原纖維蛋白開始熱聚集；在45～60 ℃儲能模量下降，這是由于輕酶解肌球蛋白和肌動球蛋白變性，使流動性增加[13]；在60～75 ℃儲能模量又逐漸增長，是因為高溫使蛋白質(zhì)劇烈變性，形成更為穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[14]。

實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的增加而逐漸減小，凝膠的最終儲能模量從75 Pa逐漸增加到375 Pa，而對照組在剪切稀化程度保持不變的情況下，最終儲能模量在60～120 Pa波動，與實驗組相比并未隨放置時間發(fā)生明顯變化；這表明是剪切稀化效應(yīng)的減小導致了肌原纖維蛋白凝膠儲能模量的升高。實驗組中，放置時間長的初始儲能模量高，這可能是因為剪切稀化效應(yīng)的減小使蛋白質(zhì)體系結(jié)構(gòu)恢復(fù)，彈性增加[15]；在加熱后期放置時間對儲能模量的影響越來越明顯，這可能是因為剪切稀化效應(yīng)會破壞肌球蛋白和肌動蛋白之間的疏水相互作用和二硫鍵[16]，不利于蛋白質(zhì)的展開和相互作用，造成了凝膠儲能模量偏低。

a-實驗組；b-對照組圖2 不同放置時間下肌原纖維蛋白的儲能模量隨溫度的變化Fig.2 Change in storage modulus of myofibrillar protein with temperature under different storage time

2.3 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠持水性的影響

肌原纖維蛋白相互聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并將水分填充在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中即形成凝膠，良好的凝膠結(jié)構(gòu)可以很好地固定凝膠中的水分[17]，持水性大小可以反映凝膠性能的優(yōu)劣。凝膠持水性隨放置時間的變化如圖3所示，隨著放置時間延長，實驗組的剪切稀化效應(yīng)逐漸減小，凝膠的持水性逐漸延長；前36 h內(nèi)凝膠的持水性變化較為顯著(P<0.05)，而在后36 h的放置條件下，凝膠的持水性雖然在延長，但是變化并不明顯。對照組在剪切稀化效應(yīng)保持一致的條件下，凝膠持水性并未隨著放置時間的延長發(fā)生顯著變化(P<0.05)，實驗組12～72 h放置時間下的凝膠持水性均顯著高于對照組(P<0.05)；這一結(jié)果說明是剪切稀化程度的降低造成了凝膠持水性的增加。

圖3 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠持水性的變化Fig.3 Change in water holding capacity of myofibrillar protein gels under different storage time注：字母A，B-實驗組和對照組之間具有顯著差異，字母a～d-實驗組和對照組在組內(nèi)具有顯著差異；顯著性水平(P<0.05)(下同)

隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸減小，肌原纖維蛋白溶液被打破的結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，使形成的凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，從而促進持水性的增加[17]，這可能是造成持水性隨剪切稀化程度減小而升高的原因。同時持水性還和氫鍵作用[18]相關(guān)，有研究表明高強度的剪切會弱化蛋白質(zhì)的相互作用[19]，而高強度的剪切代表著剪切稀化程度升高，因此可以推斷剪切稀化程度的升高會弱化蛋白質(zhì)與水的氫鍵作用，從而使凝膠持水性降低。

2.4 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響

肌原纖維蛋白的凝膠強度是影響肉制品加工特性、感官性質(zhì)的重要因素[20]。肌原纖維蛋白凝膠強度隨放置時間的變化如圖4所示，實驗組中，隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸降低；實驗組在前48 h內(nèi)，每隔12 h凝膠強度均顯著增加(P<0.05)，而在48～72 h，凝膠強度的增加并不顯著(P<0.05)，這與黏度在前面變化明顯，后面變化不明顯的現(xiàn)象相符合。對照組在保持剪切稀化程度一致的情況下，凝膠強度并未隨放置時間而發(fā)生顯著變化(P<0.05)，且實驗組12～72 h放置時間下的凝膠強度顯著高于對照組(P<0.05)；這表明是剪切稀化程度的降低導致了凝膠強度的增加。

圖4 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠強度的變化Fig.4 Change in the gel strength of myofibrillar protein gels under different storage time

隨著剪切稀化程度的降低，被打亂的大分子重新恢復(fù)到原有的取向，肌原纖維蛋白溶液體系逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，這可能會增加肌原纖維蛋白之間的相互作用程度，促進肌原纖維蛋白的聚集，而相互作用和聚集程度的增加有利于形成凝膠的三維結(jié)構(gòu)，使凝膠強度增加[21]。

2.5 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

凝膠微觀結(jié)構(gòu)隨放置時間的變化如圖5所示。隨著放置時間的延長，實驗組的剪切稀化程度逐漸減小，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)逐漸由松散變得緊湊，孔徑尺寸逐漸減小，孔徑分布逐漸變得均勻；在前48 h，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變化較為明顯，當放置時間為60 h時，凝膠的孔徑已經(jīng)變得細小而密集，放置時間再增加到72 h時，微觀結(jié)構(gòu)較60 h條件下的變化并不明顯，這與凝膠強度和持水性在前期變化明顯，后期變化不明顯的趨勢相同。對照組在保持剪切稀化程度相同的情況下，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)不隨放置時間發(fā)生顯著變化(P<0.05)，一直有較大且分布不均勻的孔徑，與實驗組中放置時間為0 h條件下的凝膠相似；這表明是剪切稀化效應(yīng)導致了凝膠微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即剪切稀化程度的降低會使凝膠結(jié)構(gòu)變得緊湊，凝膠孔徑變的小而質(zhì)密，有利于形成嚴密的凝膠結(jié)構(gòu)，這可能是因為隨著放置時間的延長，剪切稀化程度逐漸降低，肌原纖維蛋白體系逐漸向平衡方向發(fā)展，蛋白質(zhì)之間充分作用，使聚集程度增加，分布也更加均勻，形成的微觀結(jié)構(gòu)也更加質(zhì)密有序。研究表明，凝膠微觀結(jié)構(gòu)越松散粗糙，凝膠的持水性越差，密集且均勻的孔徑可以更好地束縛住凝膠中的水[22]，這與持水性隨放置時間延長而增加的結(jié)果一致。

a～g，A～G分別表示實驗組和對照組在放置時間為0、12、24、36、48、60、72 h條件下的凝膠微觀結(jié)構(gòu)圖5 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.5 Micro-structure observation of myofibrillar protein gels under different storage time

2.6 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠化學作用力的影響

由圖6可知，肌原纖維蛋白凝膠的疏水相互作用值明顯要高于氫鍵和離子鍵，這說明疏水相互作用是維持凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力[23]，可能是由于加熱的原因造成氫鍵和離子鍵作用力較小[24]；實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的延長逐漸降低，同時離子鍵、氫鍵和疏水相互作用均逐漸升高；離子鍵和疏水相互作用與凝膠持水性和質(zhì)構(gòu)特性的變化趨勢相同，先隨放置時間延長顯著增加(P<0.05)后變化不明顯；氫鍵作用隨放置時間延長持續(xù)顯著增加(P<0.05)。對照組的剪切稀化程度不變，與實驗組相比，3種化學作用力不隨放置時間延長發(fā)生明顯變化，12～72 h內(nèi)，實驗組的3種化學作用力均顯著(P<0.05)高于對照組；上述結(jié)論說明是剪切稀化程度的降低使肌原纖維蛋白凝膠的離子鍵、氫鍵以及疏水相互作用力升高。

a-離子鍵；b-氫鍵；c-疏水相互作用圖6 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠化學作用力的變化Fig.6 Change in chemical force of myofibrillar protein gels under different storage time

化學作用力是維持蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要原因，剪切稀化效應(yīng)的減小使化學作用力增加，這是凝膠持水性、凝膠強度和儲能模量升高的直接原因[25]。剪切稀化效應(yīng)的減小伴隨著結(jié)構(gòu)的恢復(fù)和蛋白質(zhì)體系的平衡，這有利于蛋白質(zhì)充分暴露基團并相互作用，這可能是促使化學作用力增加的原因。

2.7 剪切稀化效應(yīng)對肌原纖維蛋白凝膠二級結(jié)構(gòu)的影響

如表1所示，在72 h內(nèi)，實驗組和對照組中α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量均未發(fā)生顯著變化(P<0.05)，α-螺旋的含量均維持在12%左右，無規(guī)則卷曲的含量均維持在21%左右，實驗組和對照組之間無顯著性差異(P<0.05)；α-螺旋和無規(guī)則卷曲對加熱較為敏感，長時間的加熱會造成α-螺旋持續(xù)向無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化[26]，本研究中凝膠加熱的條件一致，因此α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量無明顯變化。

表1 不同放置時間下肌原纖維蛋白凝膠各二級結(jié)構(gòu)的相對含量Table 1 Relative content of each secondary structure of myofibrillar protein gels under different storage time

實驗組的剪切稀化程度隨著放置時間的延長逐漸降低，同時β-轉(zhuǎn)角含量逐漸降低、β-折疊含量逐漸增加；放置時間為36 h時β-折疊含量達到最大值，而后不發(fā)生顯著變化(P<0.05)；β-轉(zhuǎn)角含量在60 h達到最低值，而且從24 h后就沒有發(fā)生顯著的變化(P<0.05)；β-折疊和β-轉(zhuǎn)角變化趨勢相同，在前24 h 內(nèi)變化顯著(P<0.05)之后變化不明顯。對照組的剪切稀化程度不變，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角的含量也不隨放置時間發(fā)生明顯變化；在12～72 h內(nèi)，實驗組的β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量與對照組均有顯著差異(P<0.05)。這表明是剪切稀化效應(yīng)的降低使肌原纖維蛋白凝膠的β-折疊含量增加、β-轉(zhuǎn)角含量降低。HAN等[27]指出，β-折疊含量的增加有助于凝膠彈性的形成；KANG等[28]的研究表明，β-折疊含量與其持水性正相關(guān)；這與本研究中得到的結(jié)果一致。剪切稀化效應(yīng)可能是通過改變凝膠中β-折疊的含量，來影響肌原纖維蛋白凝膠特性。

3 結(jié)論與討論

隨著放置時間的延長，實驗組的黏度逐漸增加，剪切稀化效應(yīng)逐漸減小，肌原纖維蛋白凝膠特性發(fā)生了明顯的變化，對照組的黏度處在同一水平，剪切稀化效應(yīng)不隨放置時間變化，則肌原纖維蛋白的凝膠特性不發(fā)生明顯的變化。這表明是剪切稀化效應(yīng)使肌原纖維蛋白的凝膠特性發(fā)生了變化：隨著剪切稀化效應(yīng)的減小，凝膠的持水性和凝膠強度顯著增加(P<0.05)，儲能模量明顯升高，形成凝膠的結(jié)構(gòu)更加質(zhì)密，孔徑更加小而密集；對肌原纖維蛋白凝膠化學作用力和二級結(jié)構(gòu)變化的探究表明，剪切稀化效應(yīng)的降低會使凝膠的離子鍵、氫鍵、疏水相互作用力顯著升高(P<0.05)，β-折疊含量顯著增加(P<0.05)，這可能是造成凝膠持水性，凝膠強度，儲能模量增加，凝膠結(jié)構(gòu)更質(zhì)密的原因。在凝膠類肉制品的加工過程中，應(yīng)當考慮剪切稀化效應(yīng)對產(chǎn)品品質(zhì)的影響，通過放置一段時間來降低剪切稀化程度，可以提高凝膠的持水性、彈性等，有利于提高產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量。