一站式全基因組和外顯子組測序數(shù)據(jù)自動分析軟件(SeqMule)

李 鑫，李 凱，李一佳*，馬 磊

(1.云南舜喜再生醫(yī)學工程有限公司，昆明 650000；2.昆明理工大學信息工程與自動化學院，昆明 650500)

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一站式全基因組和外顯子組測序數(shù)據(jù)自動分析軟件(SeqMule)

李 鑫1，李 凱2，李一佳1*，馬 磊2

(1.云南舜喜再生醫(yī)學工程有限公司，昆明 650000；2.昆明理工大學信息工程與自動化學院，昆明 650500)

SeqMule可根據(jù)調用的人類基因組和外顯子組數(shù)據(jù)自動調節(jié)變量，對所有測序數(shù)據(jù)的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)進行分析和注釋。目的：通過對兩名痛風患者的實驗數(shù)據(jù)進行分析，詳細地為生物信息學研究人員介紹了SeqMule軟件，以期為全基因組和外顯子組測序數(shù)據(jù)提供一站式的分析途徑。方法：基于SeqMule內置的BWA(Burrows-Wheeler Aligner)、GATK(The Genome Analysis Toolkit)、SAMtools、Freebayes比對和分析工具，以兩名痛風患者的DNA測序數(shù)據(jù)分析為例，本文詳細地論述了SeqMule的特點及操作，并對兩名患者的外顯子測序數(shù)據(jù)進行了自動化比對與SNP分析。發(fā)現(xiàn)SeqMule優(yōu)化了很多分析軟件存在的一些問題，可以對外顯子組和全基因組測序數(shù)據(jù)實現(xiàn)全面、靈活、高效地自動化分析，能更好地分析高通量測序數(shù)據(jù)，最終提升數(shù)據(jù)分析的一致性和準確性。

基因；測序；SeqMule；外顯子；SNP

隨著人類基因組計劃的勝利完成和后基因組時代的來臨[1]，DNA測序技術已成為人類探索生命秘密的重要手段之一， 對生物、生命科學、醫(yī)學等領域的技術發(fā)展起到了巨大的推動作用[2]。經(jīng)過三十多年的努力，DNA測序技術已經(jīng)取得巨大的進展，在第一代和第二代測序技術的基礎上，以單分子測序為特點的第三代測序技術已經(jīng)誕生。第三代測序技術雖然解決了第二代測序技術讀長短、速度慢等缺點，但由于其成本和錯誤率偏高、通量低，目前最常用的依然是以Illumina公司的Solexa技術[3]為標志的第二代測序技術。

第二代測序技術擁有相當高的測序通量，覆蓋度高。得到的reads不僅長度短，數(shù)量又極為巨大，這給序列拼接帶來了巨大的挑戰(zhàn)，而基因組測序中的一個關鍵的步驟就是序列拼接[4]。拼接后，還需要對所有的SNP進行分析和注釋。

針對SNP的分析，目前有一些基于云端的高通量測序數(shù)據(jù)分析平臺，比如Galaxy[5]。Galaxy等現(xiàn)行的生物信息學平臺，使大量的生物信息學工具易于操作，用戶上傳數(shù)據(jù)后可立即開始分析。但是，當用戶擁有超大數(shù)據(jù)量時，存儲限制了數(shù)據(jù)的傳輸速度，較長的工作排隊時間使其變得不切實際。除了平臺解決方案，還有其他獨立途徑可進行SNP的多樣分析。例如SeqMule[6]、HugeSeq[7]、Ngs_backbone[8]和Bcbio-nextgen[9]四款集成分析軟件，可以運用自帶的工具對SNP進行比對、注釋、分析等。但是，由于部分軟件集成某些專用工具，比如Bcbio-nextgen軟件專有的比對工具NovoAlign[10]，不是對所有研究人員免費開放。四款集成分析軟件相比，SeqMule軟件結合了5種SNP比對工具和5種SNP分析工具，其余三款分析軟件只有一種或兩種SNP比對工具和SNP分析工具。除此之外，只有SeqMule軟件擁有可選且開源的SNP比對工具，具有更高的靈活性和可用性。

SeqMule軟件是以人類遺傳病研究為背景，專門針對外顯子組或全基因組序列分析設計的。它采用高度靈活的各種調用格式對SNP進行完全自動化的分析和注釋，支持Sun Grid Engine并行處理，可以進行測序質量的檢測、孟德爾錯誤率檢測、一致性評估，生成最終的HTML報告。相比之下，SeqMule是上述解決方案中較好的一款軟件，推薦生物信息學人員使用。

1 SeqMule軟件

1.1 基本介紹

對測序數(shù)據(jù)進行分析的時候，除了測序平臺的差異[11]，仍要考慮算法間的差異。例如，5種生物信息學算法(SOAP、BWA-GATK、BWA-SNVer、GNUMAP、BWA-SAMtools)分析SNV(Single Nucleotide Variants)的一致性只有57.4%，而每種計算途徑間的變異數(shù)為0.5%～5.1%[12]。在不同的測序錯誤率和indel標記下，校準也存在差異[13]。目前，公開發(fā)表的計算方法幾乎沒有提供兩種或更多的比對和SNP分析方法。

分析軟件的安裝和配置是首要問題，而且這個問題的重要性已經(jīng)被許多試圖去使用它的人所證實，像Bioconductor、Bioperl和Web-based三款軟件[14-16]。理論上，來自一個程序的輸出結果很難被輸入另一個和它類似的程序中。例如，GATK不能接受來自SOAP2的輸出。此外，軟件的不同步更新，可能導致軟件的不兼容。虛擬機和虛擬化技術為用戶解決了該問題[17-19]，然而，虛擬機系統(tǒng)不可避免地限制了客戶系統(tǒng)可用的計算資源，減少了軟件工具的靈活性。因此，對于沒有計算機背景的普通用戶來說，部署軟件成為了一個很大的難題。針對普通用戶，迫切需要一種易于執(zhí)行和整合多種工具的分析途徑。

在不影響易用性、高效性和重復性的前提下，由南加州大學的王凱實驗室開發(fā)了一個全能的解決方案——SeqMule，能夠執(zhí)行一系列自動化的命令來分析高通量測序數(shù)據(jù)。它結合了5種比對工具：BWA(包括BWA-backtrack和BWA-MEM)、Bowtie、Bowtie2、SOAP2、SNAP[20-24]，5種不同SNP分析工具：GATK(包括GATKLite 和version 3)、SAMtools、VarScan 2、Freebayes、SOAPsnp[25-28]和一些配件程序：FastQC、Picard、tabix、VCFtools 30，而且可以通過修飾配置文件來獲得多種組合。通過不同工具結合而設置變量形成交叉，從而獲得更高的準確性、敏感性和特異性。SeqMule能提供建立在不同調用者之上的并行功能，還能夠更好地分析高通量測序數(shù)據(jù)，提升分析的一致性和準確性。針對目前主流服務器(CPU:2 Intel Xeon X5650, 內存48GB)，只需24小時，SeqMule可從設置好的全基因組數(shù)據(jù)生成帶注釋的VCF文件。

SeqMule的工作流程如圖1所示，分析過程中有很多可利用的工具。其中，先使用FastQC進行質量控制，再采用BWA-backtrack、BWA-MEM、Bowtie等工具進行初始校準，校準后可使用Picard Tools對質量控制進行評估，再使用GATK、SAMtools、SOAPsnp、VarScan工具進行突變調用和過濾，最后采用GATK CombineVariants交叉或合并。

1.2 SeqMule安裝方法

SeqMule可在如下網(wǎng)址下載：http://seqmule.openbioinformatics.org.

1)筆者使用的是CentOS 7系統(tǒng)，安裝SeqMule之前要先安裝必要的軟件和環(huán)境，相關命令如下：

sudo yum install-y gcc gcc-c++ make cmake ncurses-devel ncurses R unzip automake autoconf git-core gzip tar

圖1 SeqMule的工作流程圖Fig. 1 Scheme of SeqMule workflow

2)下載SeqMule程序 git clone https://github.com/WGLab/SeqMule.git,如果Https不支持也可以用git模式git clone git://github.com/WGLab/SeqMule.git。

3)進入SeqMule文件夾，利用./Build freshinstall進行初始安裝。

4)安裝一次后，利用./Build installexes安裝missing的部分。

5)由于GATK要單獨安裝，利用./Build gatk看安裝命令，核心就是把GATK的jar文件拷貝到制定文件夾。

6)把環(huán)境變量寫到用戶的bashrc里面，然后用source命令更新以下環(huán)境變量，這樣Seqmule就可以不制定他的絕對位置來使用了，否則會出現(xiàn)command找不到的情況。

echo ’export PATH=$PATH:absolute_path_to

_seqmule/bin’ >> ～/.bashrc source ～/.bashrc

7)下載Seqmule要使用到的Database，seqmule download -down hg19all。

此部分利用terminal下載很緩慢，建議使用專用下載工具下載，大概有40 G左右。將下載的文件放到SeqMule的database文件里，再利用SeqMule download-down hg19all命令進行解壓縮，然后把文件再按名稱放到指定文件夾。另外，筆者已將下載好的database文件夾都放置到百度云，讀者可以通過shunxirm@163.com獲取下載秘鑰。

1.3 SeqMule軟件的運行

SeqMule軟件運行在Linux系統(tǒng)平臺下，命令簡單且易于掌握。根據(jù)測序方法不同，SeqMule的分析方式也不同。SeqMule主要包括三種分析方式，分別是：典型的外顯子組分析、快速轉換的全基因組分析和基于家系的三人外顯子組分析。此外，SeqMule軟件可以一次性分析多個樣本，大大簡化了生物信息學研究人員的操作。

1.3.1 SeqMule軟件的使用命令

在存放需要分析的FASTQ格式文件的文件夾下，打開系統(tǒng)終端，輸入以下命令運行SeqMule：

seqmule pipeline-a normal_R1.fastq.gz-b normal_R2.fastq.gz-prefix example-N 2-capture default-threads 4-e

其中，normal_R1.fastq.gz和normal_R2.fastq.gz是DNA經(jīng)過測序儀測序后產(chǎn)生的FASTQ格式的壓縮文件，分別是一條DNA上兩條鏈的基因數(shù)據(jù)。參數(shù)“-prefix example”是告訴SeqMule軟件你的樣本名稱是example；“-capture default”是讓SeqMule軟件使用默認的區(qū)域定義文件——hg19外顯子區(qū)，對應文件可從安捷倫SureSelect工具包中下載；“-threads 4”是令SeqMule軟件在運行時使用該計算機的四個線程；“-e”的意思是這個數(shù)據(jù)集是外顯子組數(shù)據(jù)或者捕獲的測序數(shù)據(jù)，而不是全基因組數(shù)據(jù)。

1.3.2 典型的外顯子組分析命令

通過測序儀對外顯子組測序后，得到四個FASTQ文件的壓縮文檔，在終端下運行以下命令進行典型外顯子組分析：

seqmule pipeline-a sample_lane1_R1.fq.gz, sample_lane2_R1.fq.gz-b sample_lane1_R2.fq.gz, sample_lane2_R2.fq.gz-capture seqmule/database/hg19-

nimblegen/nexterarapidcapture_exome_targetedregions_v1.2.bed-m-e-advanced seqmule/misc/predefined_con-

fig/bwa_gatk_HaplotypeCaller.config-quick-t 4-prefix mySample

命令中“-advanced seqmule/misc/predefined_config

/bwa_gatk_HaplotypeCaller.config”表示使用BWA和GATK這兩個可選工具包進行SNP的比對和分析。參數(shù)中-quick是使軟件使用更多的計算機內存來進行快速分析；“-t 4”表示分析時使用計算機的四個CPU；“-m”是合并兩個數(shù)據(jù)集。

1.3.3 快速轉換的全基因組分析命令

通過測序儀對全基因組測序后，得到兩個FASTQ文件的壓縮文檔，在終端下運行以下命令進行快速轉換的全基因組分析：

seqmule pipeline-a sample_R1.fq.gz-b sample_R2.fq.gz-advanced seqmule/misc/predefined_c-onfig/snap_freebayes.config-quick-t 12-g-prefix mySample

命令中“-advanced seqmule/misc/predefined_config/snap_freebayes.config”表示使用SNAP和FreeBayes這兩個可選工具包進行全基因組SNP的比對和分析。參數(shù)“-g”表示全基因組分析；“-t 12”是令SeqMule使用計算機的12個CPU進行比對分析，因為SNAP工具使用時非常消耗內存，因此采用多個CPU來提高軟件運行速度。

1.3.4 三人外顯子組分析命令

對同一個家庭的三個人進行外顯子組測序后，使用SeqMule軟件對三人的測序數(shù)據(jù)進行分析來發(fā)現(xiàn)致病基因，命令如下：

seqmule pipeline-a fa_R1.fq.gz,mo_R1.fq.gz,son

_R1.fq.gz-b fa_R2.fq.gz,mo_R2.fq.gz,son_R2.fq.gz-ms-e-q-t 4-prefix father,mother,son-capture default-sge "qsub-V-cwd-pe smp XCPUX"

命令中“-sge "qsub-V-cwd-pe smp XCPUX””表示使用SG工具包來進行分析。參數(shù)中“-ms”表示針對多樣本的基因突變識別，可以更加準確地分析來自同一家庭的三個人的外顯子組數(shù)據(jù)。

2 使用SeqMule軟件進行SNP分析

2.1 數(shù)據(jù)準備

患者數(shù)據(jù)來自舜喜再生醫(yī)學工程有限公司。昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院的兩名痛風患者在云南舜喜再生醫(yī)學工程有限公司抽血并提取DNA后，使用Illumina公司的Hiseq3000測序儀進行外顯子組測序。測序后得到FASTQ格式文件的壓縮文件，作為實驗前準備數(shù)據(jù)。使用SeqMule軟件進行基因的比對、拼接并進行SNP分析。

2.2 分析報告

SeqMule分析完成后，生成HTML格式的詳細分析報告(SeqMule Report)。分析報告網(wǎng)頁上有分析總結、樣本分析報告、分析途徑、分析參數(shù)和幫助文件按鈕，點開后即可查看詳細信息。

樣本分析結果展示了統(tǒng)計資料、SNV與NON-SNV韋恩圖和覆蓋度圖。統(tǒng)計資料里包含基因校準數(shù)據(jù)表、基因覆蓋率統(tǒng)計數(shù)據(jù)表和基因突變數(shù)據(jù)表。其中，表1是SeqMule軟件對該患者的基因數(shù)據(jù)進行初始校準得到的校準統(tǒng)計表，包含通過的質量控制讀長數(shù)、失敗的讀長數(shù)、比對的讀長數(shù)及和數(shù)據(jù)庫匹配上的讀長數(shù)等數(shù)據(jù)。表2是該患者的基因覆蓋率度統(tǒng)計數(shù)據(jù)表，包括總的長度、目標區(qū)域的平均覆蓋度等數(shù)據(jù)。表3是該患者的基因突變數(shù)據(jù)表，包含該患者的所有突變位點數(shù)、SNV突變位點數(shù)和插入/缺失位點數(shù)等數(shù)據(jù)。

表1 患者1的校準統(tǒng)計表

表2 患者1的覆蓋率統(tǒng)計數(shù)據(jù)表

表3 患者1的突變數(shù)據(jù)表

SNV與NON-SNV韋恩圖是SeqMule結合3種不同的SNP分析工具得出的SNV和NON-SNV突變重疊圖。圖2是兩名患者的SNV與NON-SNV韋恩圖。從圖中可以得出，基于3種分析工具單獨分析出的基因突變結果、兩兩之間分析出的相同突變基因的結果以及三種分析工具分析出的相同突變基因的個數(shù)。患者1的數(shù)據(jù)中，GATK、SAMtools和freebayes三種分析工具的分析結果中都出現(xiàn)SNV突變的位點有22 011個，NON-SNV突變的位點有2 291個?；颊?的數(shù)據(jù)中，三種分析工具的分析結果中都出現(xiàn)SNV突變的位點有29 111個，NON-SNV突變的位點有2 269個。

圖2 兩名患者的SNV與NON-SNV韋恩圖Fig. 2 Venn Diagram (SNV and NON-SNV) of two patients

3 結 語

從實驗結果可以看出，SeqMule可對外顯子組測序數(shù)據(jù)實現(xiàn)全面、簡易、靈活、高效的一站式自動化分析。分析結果采用HTML報告的方式，展示出詳細、美觀的圖表，簡單易讀。除了外顯子組測序，SeqMule還支持對全基因組測序進行一站式自動分析，更加多元化。SeqMule解決了大部分分析軟件存在的軟件兼容性、配置復雜及不能訪問高性能計算設施等問題，能更好地分析高通量測序數(shù)據(jù)，提升基因數(shù)據(jù)分析的一致性和準確性。該軟件的5種比對方式、5種SNP分析工具和多種多樣的配件程序給用戶提供了眾多選擇，內置的并行處理能力可加快分析的進程。除了上述特點外，SeqMule使用單行命令完成復雜的任務，使其成為易于下載、安裝、配置和運行的生物信息學的工具。

筆者已經(jīng)用SeqMule來分析測序數(shù)據(jù)，并且獲得了有意義的結果。隨著新一代測序技術的快速發(fā)展和部署，我們期望SeqMule能夠促進即將來臨的大量測序數(shù)據(jù)分析，從而為人類遺傳病研究奠定基礎，并促進人類遺傳病的診斷方法的完善。

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A one-stop analytic software for sequencing data of whole genome and exome: SeqMule

LI Xin1, LI Kai2, LI Yijia1*, MA Lei2

(1.StemCellAndRegenerativeMedicineResearchCenter,YunnanSunsRegenerativeMedicineEngineeringCo.Kunming650000,China;2.SchoolofInformationEngineeringandAutomation,KunmingUniversityofScienceandTechnology,Kunming650500,China)

SeqMule can adjust variables automatically according to the data of the invoked human genomes and the exomes, and also can analyze and annotate SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Objectives: This paper introduces SeqMule software to researchers on bioinformatics in detail by analyzing the experimental data of two patients with gout, with the hope of providing a one-stop analytical approach for the whole genomes and exomes. Methods: This paper discusses the features and operations of the SeqMule taking the analysis of DNA data of two patients with gout using the BLAST and analysis softwares such as BWA, GATK, SAMtools, Freebayes embedded in SeqMule, and also we have carried out BLASTs for the their exomes automatically and analyzed SNPs for them. Conclusions: SeqMule has resolved some questions present in many softwares. It also can analyze the data from the whole genomes and the exomes automatically in a comprehensive, flexible and efficient way, better analyze the data from high throughput sequencing, and finally improve the consistency and accuracy of the data analysis.

Gene; Sequencing; SeqMule;Exome;SNP

2016-04-05；

2016-06-12.

李鑫，男，本科生，研究方向：二代測序技術；E-mail: 281528209@qq.com；

李凱，男，碩士研究生，研究方向：生物信息學；E-mail: 553234748@qq.com.

10.3969/j.issn.1672-5565.03.10

Q343.1

A

1672-5565(2016)03-188-07

*通信作者：李一佳，男，博士，研究方向：干細胞和基因臨床轉化；E-mail: yijia.tsinghua@gmail.com.