大豆5個(gè)新發(fā)現(xiàn)ERF基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

翟 瑩，張 軍，趙 艷，高士童，孫婉姝，張 闖，任巍巍，王秀文，王玉書

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

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大豆5個(gè)新發(fā)現(xiàn)ERF基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析

翟 瑩1，張 軍2，趙 艷1，高士童1，孫婉姝1，張 闖1，任巍巍1，王秀文1，王玉書1

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

ERF轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中并且參與植物對生物及非生物脅迫的響應(yīng)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得5個(gè)新的ERF基因，GmERFa/b/c/d/e。蛋白序列分析顯示，5個(gè)ERF基因均含有一個(gè)保守的AP2/ERF結(jié)合域。進(jìn)化分析表明，GmERFe與GmERF3和GmERF7同源性最高，GmERFb、GmERFc與GmERF5的同源性最高，GmERFd與GmEREBP1的同源性較高，而GmERFa與其他ERF蛋白的同源性均較低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，5個(gè)基因都主要在大豆的根和葉中表達(dá)。逆境處理后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，GmERFd/e主要對乙烯信號(hào)和低溫產(chǎn)生響應(yīng)，GmERFb主要對干旱產(chǎn)生響應(yīng)，而GmERFa主要對低溫產(chǎn)生響應(yīng)。

大豆；ERF轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

乙烯響應(yīng)因子(ethyleneresponsefactor，ERF)基因以家族形式廣泛存在于植物中，隸屬于AP2/ERF超家族。它們功能多樣，不僅在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮功能，更在植物應(yīng)對不良環(huán)境時(shí)發(fā)揮重要作用[1-3]。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員都含有一段由58或59個(gè)氨基酸殘基組成的保守序列，即ERF的DNA結(jié)合域。ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別并結(jié)合GCC-box、DRE/CRT等順式作用元件就取決于DNA結(jié)合域中特定的氨基酸序列，而這些順式作用元件則通常位于脅迫相關(guān)的啟動(dòng)子中[4-7]。除此以外，ERF蛋白還可以與其他蛋白相互作用，包括bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白，共同調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[8-9]。多數(shù)ERF都是轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[10-12]，少數(shù)ERF則作為轉(zhuǎn)錄抑制子，它們不僅可以抑制相關(guān)基因的表達(dá)，還能夠降低其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性[10，13]。ERF抑制子的轉(zhuǎn)錄抑制活性通常與位于ERF蛋白C末端的EAR(ERF-associatedamphiphilicrepressor)元件相關(guān)，這是一段保守的L/FDLNL/F(X)P序列。EAR元件中的保守氨基酸若發(fā)生突變或整體失去，將導(dǎo)致抑制活性的喪失[14]。

研究表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子可以被多種逆境及逆境相關(guān)的信號(hào)分子誘導(dǎo)表達(dá)，例如高鹽、干旱、低溫、脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸和水楊酸等[12-13]。將它們在植物中過量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植株對多種生物及非生物脅迫的綜合抗性[12-13，15]。植物中存在大量的ERF基因，僅大豆中就發(fā)現(xiàn)了98個(gè)包含有完整AP2/ERFDNA結(jié)合域的獨(dú)立基因[16]。但這些基因在功能上存在冗余性，因此有必要對大豆ERF家族中其他成員作進(jìn)一步鑒定。本研究從基因數(shù)據(jù)庫中搜索到5個(gè)功能未鑒定的大豆ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，對它們進(jìn)行生物信息學(xué)分析并對它們在不同組織及逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行鑒定，以期揭示大豆中ERF的抗逆機(jī)制并豐富大豆抗逆基因資源，為后續(xù)植物ERF基因的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

大豆品種合豐46由齊齊哈爾大學(xué)遺傳研究室保存。對盆栽的四葉期大豆幼苗進(jìn)行以下逆境處理。參照Zhai等[13]的方法用ET和ABA處理大豆幼苗；將大豆幼苗置于含20%PEG8000的MS營養(yǎng)液中進(jìn)行干旱處理；置于含200mmol·L-1NaCl的MS營養(yǎng)液中進(jìn)行高鹽處理；置于4 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。分別在處理0、1、2、5、10和24h取樣，剪取0.1g葉片并迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)剪取大豆的根、莖、花和未成熟胚置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生物信息學(xué)分析

用已知的ERF基因保守序列[12]搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得功能未知的大豆ERF基因完整序列；用在線軟件PSORT(http://psort.hgc.jp/)進(jìn)行核定位信號(hào)的預(yù)測；用DNAMAN軟件構(gòu)建ERF蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 表達(dá)模式分析

根據(jù)5個(gè)ERF的基因序列，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)。在BIO-RADCFX96Real-TimePCR儀上，以大豆組成型表達(dá)基因β-Tubulin (GenBank登錄號(hào)為GMU12286)作為內(nèi)參，以大豆不同組織的cDNA和不同處理時(shí)間點(diǎn)葉片cDNA為模板。反應(yīng)體系為2×SYBRPremixExTaq (TaKaRa) 10μL、cDNA2μL、10μmol·L-1正反向引物各0.4μL、ROXReferenceDyeⅡ 0.2μL，補(bǔ)水至總體積20μL。

表1 所用引物序列

Table 1 Sequences of primers

基因Gene引物1Primer1引物2Primer2GmERFa5'-TCGCTGTTCCAAAGAAGACC-3'5'-CGAAGGTTCCGAGCCAAA-3'GmERFb5'-ACAGCGATTGCGACTCTTCT-3'5'-CGGATGGTGGGAGGTTTAG-3'GmERFc5'-ACTTTCTCCGCCGTTCTACC-3'5'-CGTCTCCGTCGTCCACAA-3'GmERFd5'-CCAAAGAATTTAAGTTAAACC-3'5'-GGTGTTGAATTGAATATTGGA-3'GmERFe5'-CCAAAGTTAGCGAGCAGGTT-3'5'-GGTGTTGTGGAGCGAAAGG-3'β-Tubulin5'-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3'5'-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3'

反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性 20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。所有處理均做3次重復(fù)，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算出基因的相對表達(dá)量。利用BIO-RAD CFX Manager軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五個(gè)ERF基因的生物信息學(xué)

用ERF基因保守序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索獲得5條功能未知的大豆ERF基因序列，它們都包含完整的開放閱讀框(open reading frame， ORF)，將它們分別命名為ERFa/b/c/d/e。GmERFa(GenBank登錄號(hào)：HM219231) ORF全長828 bp，編碼275個(gè)氨基酸，蛋白序列中部含有一個(gè)由59個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)合域(圖1)，結(jié)合域外含有2個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)(R203KRRR和P219VVKKEK)。GmERFb(GenBank登錄號(hào)：BT096447) ORF全長648 bp，編碼215個(gè)氨基酸，蛋白序列中部含有一個(gè)由58個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)合域(圖1)，結(jié)合域內(nèi)含有兩個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)(R31KRP和P45WKKQRV)。GmERFc(GenBank登錄號(hào)：XM003551818) ORF全長639 bp，編碼212個(gè)氨基酸，靠近蛋白序列N端含有一個(gè)由58個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)合域(圖1)，結(jié)合域內(nèi)含有2個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)(R32KRP和P46LKKARV)。GmERFd(GenBank：XM003538704) ORF全長810 bp，編碼269個(gè)氨基酸，靠近蛋白序列C端含有一個(gè)由59個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)合域(圖1)，結(jié)合域外含有1個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)(K262KRKK)。GmERFe(GenBank登錄號(hào)：NM001254494) ORF全長903 bp，編碼300個(gè)氨基酸，靠近蛋白序列N端含有一個(gè)由58個(gè)氨基酸組成的AP2/ERF結(jié)合域(圖1)，結(jié)合域外含有1個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)(P66VKRQRK)。

圖1 五個(gè)ERF蛋白的AP2/ERF結(jié)合域Fig.1 AP2/ERF binding domains of 5 ERF proteins

將這5個(gè)ERF蛋白與GenBank中功能已經(jīng)鑒定的6個(gè)大豆ERF蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果如圖2所示，GmERFe與GmERF3和GmERF7同源性最高，在它們蛋白的N端均含有一個(gè)功能未知的MCGGAI(I/L)元件，推測GmERFe功能上與GmERF3和GmERF7相似，均為轉(zhuǎn)錄激活子；GmERFb、GmERFc與GmERF5的同源性最高，在它們蛋白的C端均含有一個(gè)EAR抑制元件，推測GmERFb和GmERFc功能上與GmERF5相似，均為轉(zhuǎn)錄抑制子；此外，GmERFd與GmEREBP1的同源性較高，而GmERFa與其他ERF蛋白的同源性均較低。

2.2 五個(gè)ERF基因的組織表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測5個(gè)ERF基因在大豆不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，5個(gè)基因都主要在大豆的根和葉中表達(dá)，其中GmERFb/c/e在根中的表達(dá)量高于葉，而GmERFa/d在葉中和根中的表達(dá)量無明顯差異(圖3)。此外，GmERFb在胚中基本不表達(dá)；GmERFc在花中的表達(dá)量也比較高，僅次于根中的表達(dá)量。以上結(jié)果表明ERF轉(zhuǎn)錄因子基因可能主要在大豆的根部和葉片中行使一定的調(diào)控功能。

GmEREBP1: AAM45475; GmERF3: NP001238300; GmERF4: ACE76905; GmERF5: AEX25891; GmERF6: AEQ55267; GmERF7: AEQ55266圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree

圖3 五個(gè)ERF基因在大豆不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of 5 ERF genes in soybean tissues

2.3 五個(gè)ERF基因在逆境處理?xiàng)l件下的表達(dá)

用ABA、ET、干旱、高鹽和低溫處理大豆幼苗，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測5個(gè)ERF基因在逆境下的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果顯示，ABA處理后，除了GmERFa和GmERFc在1 h有升高外，其他均有所下降(圖4-A)；ET處理后，5個(gè)基因的表達(dá)量均有所升高，GmERFa/b/c的表達(dá)量升高不明顯，GmERFd和GmERFe的表達(dá)量升高較為明顯，均在處理2 h達(dá)到最大值，分別是對照的20倍和11倍(圖4-B)；干旱處理后，5個(gè)基因的表達(dá)趨勢較為一致，均是先降低后升高，在處理24 h時(shí)達(dá)到最大值(圖4-C)；高鹽處理后，5個(gè)基因的表達(dá)量均隨時(shí)間延長有所下降(圖4-D)；低溫處理后，5個(gè)基因均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，GmERFa/b/c的表達(dá)量在1 h達(dá)到最大值，GmERFd和GmERFe的表達(dá)量在2 h達(dá)到最大值(圖4-E)。

3 討論

植物在一生中總會(huì)遇到各種各樣的生物及非生物脅迫(例如病原侵染、干旱、極端溫度和鹽堿等)。作為對不良環(huán)境的應(yīng)答，植物會(huì)在染色體DNA、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后3個(gè)水平上精確調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[17]。轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子中順式作用元件的特異結(jié)合可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控下游基因的表達(dá)。ERF轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)龐大的基因家族，不同的ERF轉(zhuǎn)錄因子對于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控既存在差異，又存在功能冗余。

圖4 五個(gè)ERF基因在ABA(A)、ET(B)、干旱(C)、鹽分(D)、低溫(E)處理下的表達(dá)Fig.4 Expression of 5 ERF genes in ABA (A)， ET (B)， drought (C)， salt (D) and low temperature (E) treatment

根據(jù)Tournier等[18]的分類方法，ERF轉(zhuǎn)錄因子分4個(gè)亞類，第Ⅱ亞類中的ERF均為轉(zhuǎn)錄因抑制子，都含有EAR抑制元件。所以推測本研究中GmERFb和GmERFc應(yīng)為轉(zhuǎn)錄抑制子，而GmERFa/d/e不含EAR元件，應(yīng)為轉(zhuǎn)錄激活子。核定位預(yù)測結(jié)果顯示5個(gè)ERF基因均含有1～2個(gè)預(yù)測的核定位信號(hào)，這與以往鑒定的ERF轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中的結(jié)果相一致[7，19]。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子雖在細(xì)胞質(zhì)中合成，但卻在細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

植物在遭受生物和非生物脅迫時(shí)最先感知的就是根和葉片，所以逆境相關(guān)的基因主要在根和葉片中發(fā)揮作用，這與本研究中5個(gè)ERF主要在根和葉中表達(dá)相一致。本文中的5個(gè)ERF基因?qū)δ婢趁{迫的應(yīng)答并不一致，這與前人發(fā)現(xiàn)的擬南芥中不同的ERF成員在脅迫下具有不同表達(dá)模式的研究結(jié)果相一致[10]。表明不同的ERF基因?qū)ο嗤虿煌哪婢尘嬖诓煌膽?yīng)答機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子之所以會(huì)對不同的逆境信號(hào)產(chǎn)生不同的響應(yīng)，可能是由于DNA結(jié)合特性不同或者是存在翻譯后水平調(diào)控， 也有可能是與不同蛋白相互作用的結(jié)果[20]。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果，5個(gè)ERF基因中，GmERFd/e主要對乙烯信號(hào)和低溫產(chǎn)生響應(yīng)，GmERFb主要對干旱產(chǎn)生響應(yīng)，而GmERFa主要對低溫產(chǎn)生響應(yīng)，可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Bioinformaticsandexpressionanalysisof5newfoundERFgenesinsoybean

ZHAIYing1，ZHANGJun2，ZHAOYan1，GAOShi-tong1，SUNWan-shu1，ZHANGChuang1，RENWei-wei1，WANGXiu-wen1，WANGYu-shu1

(1. College of Life Science and Agro-forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， China；2. Heilongjiang Institute of Veterinary Science， Qiqihar 161005， China)

ERFtranscriptionfactorsarewidespreadinplants，whicharewidelyinvolvedinplantresponsetobioticandabioticstress.Inthisstudy，fivenovelERFgenesequences， ERFa/b/c/d/e，wereobtainedbyblastfromNCBIdatabase.ProteinsequencesanalysisshowedthatthefiveERFproteinsallcontainedatypicalAP2/ERFbindingdomain.PhylogeneticanalysisindicatedthatGmERFewashighlyhomologoustoGmERF3andGmERF7;GmERFbandGmERFcwerehighlyhomologoustoGmERF5;GmERFdwashomologoustoGmEREBP1;whileGmERFahadlowerhomologywithotherERFproteins.TheexpressionpatternsoffiveERFgenesinsoybeantissuesandunderstresstreatmentswereanalyzedbyreal-timequantitativePCR.TheresultsshowedthatthefiveERFgenesexpressedhighlyinrootandleaf.GmERFd/erespondedmainlytoethylenesignalandlowtemperature，GmERFbrespondedmainlytodrought，andGmERFarespondedmainlytolowtemperature.

soybean;ERFtranscriptionfactor;bioinformaticsanalysis;expressionanalysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.10.03

2016-02-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301335)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541889);黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C201458)

翟瑩(1982—)，女，吉林吉林人，講師，博士，主要從事植物分子育種研究。E-mail: fairy39809079@126.com

S

A

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(10): 1644-1649

翟瑩，張軍，趙艷，等. 大豆5個(gè)新發(fā)現(xiàn)ERF基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(10)： 1644-1649.