未名玫瑰葡萄秋水仙素誘導(dǎo)與鑒定

閆愛(ài)玲， 王慧玲，孫 磊，張國(guó)軍，王曉玥，徐海英*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所,北京100093；2.北京市落葉果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100093)

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未名玫瑰葡萄秋水仙素誘導(dǎo)與鑒定

閆愛(ài)玲1，2， 王慧玲1，3，孫 磊1，2，張國(guó)軍1，王曉玥1，徐海英1*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所,北京100093；2.北京市落葉果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100093)

[目的]研究未名玫瑰葡萄秋水仙素處理的最適濃度和時(shí)間，及適宜的倍性鑒定方法。[方法]以秋水仙素為誘變劑，利用不同濃度的秋水仙素浸泡種子不同時(shí)間，對(duì)二倍體葡萄未名玫瑰品種進(jìn)行加倍誘導(dǎo)，并采用流式分析儀對(duì)誘變植株的細(xì)胞 DNA 含量進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]從誘導(dǎo)成活率和四倍體誘變率綜合考慮，誘變四倍體未名玫瑰種子的適宜條件：當(dāng)種子胚根長(zhǎng)1.0 cm時(shí)，用0.5%秋水仙素處理96 h，其成活率和四倍體率分別為11.33%和5.12%。[結(jié)論]用倍性分析儀測(cè)定細(xì)胞倍性是一條簡(jiǎn)便快捷的鑒定方法。處理時(shí)間是影響成活率、四倍體率和變異率的主要因素。

葡萄；秋水仙素；四倍體；倍性分析

多倍體植物具有生物產(chǎn)量高、器官巨大性、抗病抗逆能力強(qiáng)等特性。多倍體葡萄的葉片、果粒性等比二倍體葡萄更大，抗逆能力更強(qiáng)，在生產(chǎn)上得到大面積的推廣(如巨峰葡萄)。但四倍體葡萄品種單一(主要為巨峰系及后代等歐美品種[1-2])，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。因此,對(duì)二倍體鮮食葡萄品種或育種親本進(jìn)行染色體加倍，經(jīng)篩選獲得四倍體品種，可獲得直接用于生產(chǎn)的四倍體品種，另一方面能獲得四倍體新種質(zhì)，為進(jìn)一步育種奠定基礎(chǔ)。

Dermen[3]在夏葡萄(Vitisaestivalis)、歐洲葡萄(V.vinifera)和圓葉葡萄(V.rotundifolia)上獲得了四倍體或嵌合體。我國(guó)許多育種工作者均采用秋水仙素處理二倍體葡萄品種的生長(zhǎng)點(diǎn)等獲得四倍體葡萄[4]。馬愛(ài)紅等[2]、張淑愛(ài)等[5]和盧炳芝等[6]利用組織培養(yǎng)的方法，用秋水仙素處理葡萄試管苗莖段和胚狀體，也獲得四倍體。但該方法獲得四倍體品種還需要經(jīng)過(guò)組培苗的培養(yǎng)、移栽、煉苗等過(guò)程，較麻煩。在有足夠種子的條件下，陳俊等[7]通過(guò)誘導(dǎo)葡萄種子，獲得的四倍體直接從種子發(fā)芽生長(zhǎng)成苗。筆者以秋水仙素為誘變劑，利用不同濃度的秋水仙素浸泡種子不同時(shí)間，對(duì)二倍體葡萄未名玫瑰品種進(jìn)行加倍誘導(dǎo)，并采用流式分析儀對(duì)誘變植株的細(xì)胞DNA含量進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 取二倍體葡萄品種未名玫瑰的種子，先將種子進(jìn)行催芽，待胚根長(zhǎng)0.5～1.0 cm時(shí)進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 種子浸泡法。將胚根長(zhǎng)0.5～1.0 cm的種子浸泡在不同濃度秋水仙素培養(yǎng)皿中，上面蓋一薄層脫脂棉，蓋上培養(yǎng)皿，放置于室溫(25±2)℃的培養(yǎng)間內(nèi)培養(yǎng)48～96 h。處理后統(tǒng)計(jì)各處理成活種子數(shù)；播種至營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，溫室發(fā)芽成苗。將成活的幼苗移入大田，待長(zhǎng)出幾片新葉后，將植株的幼嫩葉片取回，進(jìn)行DNA檢測(cè)。秋水仙素濃度分別為0.4%、0.5%、0.6%，處理時(shí)間分別為48、72、96 h，共9個(gè)處理。

1.2.2 植株倍性鑒定。采用倍性分析儀進(jìn)行細(xì)胞倍性鑒定。將10 mg新生幼嫩葉片在0.5 mL Pratec HR-A溶液中研磨。將樣品通過(guò)30 μmol Pratec Celltrics微孔膜過(guò)濾到測(cè)試管中，加入0.5 mL Pratec HR-B溶液于樣品中，將樣品上樣于德國(guó)Pratec公司生產(chǎn)的倍性分析儀，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定葡萄葉片單個(gè)細(xì)胞核的DNA含量。測(cè)定結(jié)果由儀器直接繪制出DNA曲線圖。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，確定處理植株的倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚根和植株的形態(tài)變化 從圖1可以看出，與對(duì)照相比，秋水仙素處理后胚根明顯粗壯，根尖處由于受秋水仙素毒害而變褐；處理時(shí)長(zhǎng)勢(shì)較弱的種子根部甚至整個(gè)種子死亡。

由圖2可看出，秋水仙素加倍后，植株在形態(tài)上發(fā)生了變化。正常二倍體植株的葉片顏色淺,葉緣鋸齒較圓(圖2a)；而秋水仙素加倍后的植株，葉片顏色為深綠色，葉緣鋸齒尖，葉片裂刻加深，表面光滑而有光澤(圖2b)。

2.2 葡萄植株的倍性鑒定 采用倍性分析儀對(duì)未經(jīng)處理的未名玫瑰二倍體對(duì)照植株及采用秋水仙素處理的植株進(jìn)行倍性分析，典型的二倍體、四倍體及二倍四倍嵌合體的DNA含量分布見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，二倍體對(duì)照植株僅在峰值 50 的位置出現(xiàn)1 個(gè)單峰，四倍體植株在峰值100的位置出現(xiàn) 1 個(gè)單峰，而部分植株具有 2 個(gè)峰，除峰值50附近有 1 個(gè)峰外，在峰值100附近還有 1 個(gè)峰，如加倍成嵌合體植株的第 1 個(gè)峰值為 49.04，第 2 個(gè)峰值為 98.53，兩者比值約為2，即為二倍體和四倍體的嵌合體，還有些植株在峰值約25處出現(xiàn)1個(gè)峰，此植株為單倍體植株。

圖1 0.4%秋水仙素處理96 h(a)和清水處理(b)Fig.1 Treatment of 0.4% colchicine for 96 h (a) and clean water control (b)

2.3 不同濃度秋水仙素和不同處理時(shí)間對(duì)誘變效果的影響 從表1可以看出，隨著處理濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，植株成活率逐漸降低。其中，在秋水仙素濃度為0.4%時(shí)，48 h成活率最高，72和96 h成活率差異不顯著；但變異率和四倍體率較低。不同濃度秋水仙素處理成活率由高到低依次為①、④、⑦，其中，處理⑦、②和③差異不顯著，處理⑤和⑧差異不顯著。極差分析表明，處理時(shí)間的貢獻(xiàn)率大于處理濃度，即處理時(shí)間對(duì)成活率的影響大于處理濃度對(duì)成活率的影響。變異率和四倍體率則隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)和處理濃度的增加而增加，變異率最高的是處理⑨，即濃度0.6%的秋水仙素處理96 h變異率最高(為7.63%)，其次是0.5%的秋水仙素處理96 h(變異率為6.37%)，變異率第3的是0.6%的秋水仙素處理72 h(變異率為5.76%)。極差分析表明，處理時(shí)間是影響變異率的主要因素。四倍體率最高的也是處理⑨，四倍體率從高到低依次為⑨、⑥、⑧、⑤，這與變異率不同；其中，處理⑨與⑥差異不顯著。極差分析表明，處理時(shí)間是影響四倍體率的主要因素。綜上所述，0.6%的秋水仙素處理96 h和0.5%的秋水仙素處理96 h未名玫瑰的發(fā)芽種子得到的四倍體后代最多，從成活率和四倍體率綜合考慮，選取0.5%的秋水仙素處理96 h為未名玫瑰種子的最佳處理時(shí)間和處理濃度。

圖2 對(duì)照二倍體未名玫瑰(a)和秋水仙素加倍后四倍體未名玫瑰(b)Fig.2 The control of diploid Weiming Meigui grape (a) and the tetraploid Weiming Meigui grape after processed by colchicine (b)

注：a.對(duì)照二倍體未名玫瑰，b.加倍為四倍體的植株，c.二倍體四倍體嵌合體，d.單倍體植株。Note:a.Diploid; b.Tetraploid; c.The chimera of diploid and tetraploid; d.Haploid.圖3 DNA含量分布Fig.3 Distribution of DNA content

表1 不同濃度秋水仙素和不同處理時(shí)間對(duì)未名玫瑰誘變效果的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。

Note:Different lowercases in the same column indicated significant difference at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

陳俊等[7]用0.6 %的秋水仙素溶液在種子胚根長(zhǎng)0.5、1.0、1.3 cm 時(shí)進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)后胚根長(zhǎng)為1.0 cm 時(shí)誘導(dǎo)效果較好。該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胚根長(zhǎng)小于0.5 cm時(shí)耐藥性較弱，種子根部褐化死亡；當(dāng)胚根長(zhǎng)1.0 cm時(shí)，其耐藥性大大增強(qiáng)，根部褐化死亡的數(shù)量較少。這與陳俊等[7]的研究結(jié)果一致。因此，在選材時(shí)盡量用胚根長(zhǎng)約1.0 cm進(jìn)行處理。

常金華等[8]、楊曉明等[9]對(duì)染色體數(shù)目、氣孔特征和花粉粒特性等與倍性有關(guān)的性狀進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，這些方法操作復(fù)雜，且難度較大。倍性分析儀為植物染色體倍性的研究提供了一條便捷的途徑，鑒定快速方便，且準(zhǔn)確性較高[10]。筆者采用倍性分析儀分析細(xì)胞倍性，這與馬愛(ài)紅等[2]采用的方法相同，通過(guò)對(duì)誘變植株 DNA 含量變化進(jìn)行鑒定，在短時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，除檢測(cè)速度快外，還可檢測(cè)生長(zhǎng)點(diǎn)和葉片等非生長(zhǎng)點(diǎn)部位，結(jié)果可靠全面，并具有一定的代表性。對(duì)于未名玫瑰種子,0.5%的秋水仙素處理96 h為最佳處理時(shí)間和處理濃度。

[1] 賀普超.葡萄學(xué)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[2] 馬愛(ài)紅，范培格，孫建設(shè)，等.四倍體葡萄誘導(dǎo)技術(shù)的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005,38(8):1645-1651.

[3] DERMEN H. Colchiploidy in grapes[J]. The journal of heredity， 1954，45(4):159-172.

[4] 羅耀武，喬子靖，朱子英,等.人工誘變獲得四倍體玫瑰香葡萄的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，1997，24(2):125-128.

[5] 張淑愛(ài)，齊與樞， 魏寶發(fā)， 等. 用秋水仙素誘導(dǎo)葡萄試管苗獲得多倍體[J].中國(guó)果樹(shù)，1989(3):28-30，45.

[6] 盧炳芝，李佩芬，于向榮， 等.誘變葡萄體細(xì)胞胚獲得同質(zhì)四倍體植株的研究[J]. 果樹(shù)科學(xué)，1997，14(3):145-148.

[7] 陳俊， 李登科， 李太寶， 等. 誘導(dǎo)葡萄多倍體研究[J].果樹(shù)科學(xué)，1995，12 (3):151-155.

[8] 常金華,任清,羅耀武.人工誘變四倍體玫瑰香葡萄的倍性鑒定[J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2003,17(3):221-224.

[9] 楊曉明`,王翠玲.葡萄多倍體誘導(dǎo)及其特征特性研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,12(6):741-474.

[10] 張俊娥，劉繼紅，鄧秀新. 采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(2):169-174.

Identification and Induction of Weiming Meigui Grape with Colchicine

YAN Ai-ling1，2，WANG Hui-ling1，3，SUN Lei1，2，XU Hai-ying1*et al

(1.Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100093; 2.Beijing Deciduous Fruit Tree Engineering Research Center，Beijing 100093; 3.Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops (North China)，Ministry of Agriculture，Beijing 100093)

[Objective] To research the optimal concentration and time of colchicine treatment for Weiming Meigui Grape，and the optimal ploidy identification method.[Method] With colchicine as the mutagenic agent，seeds were soaked in different concentrations of colchicine for different time，so as to induce theVitisvinifera.Cell DNA of the induced plants were identified by flow cytometry.[Result] Considering the induction survival rate and tetraploid mutation rate，the optimal condition for tetraploid induction (Weiming Meigui seeds) was when seed radical was 1 cm in length，it was treated by 0.5% colchicine for 96 h,the rate of tetraploid was 5.12% and the survival rate was 11.33%.[Conclusion]The ploidy analyzer is a simple,rapid method for determining cell ploidy.Treatment time is the main factor affecting the survival rate，tetraploid rate and mutation rate.

Grape (Vitisvinifera); Colchicines; Tetraploid; Analysis of ploidy

國(guó)家葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-30-YZ-3)。

閆愛(ài)玲(1972- )，女，新疆阿克蘇人，副研究員，碩士，從事葡萄資源與育種研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事葡萄育種研究。

2016-08-19

S 663.1

A

0517-6611(2016)28-0106-03