馬鈴薯sgt3基因啟動子克隆及其功能鑒定

魏桂民，李德文，羅莉斯，王少銘，王軍，張金

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.貴州省油料(香料)研究所，貴州 貴陽 550006)

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馬鈴薯sgt3基因啟動子克隆及其功能鑒定

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.貴州省油料(香料)研究所，貴州 貴陽 550006)

【目的】 克隆馬鈴薯茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因(sgt3)的啟動子序列并對其進(jìn)行功能鑒定.【方法】 采用染色體步移技術(shù)(genome walking)進(jìn)行啟動子的克隆，構(gòu)建了該啟動子驅(qū)動報告基因gfp::gus的植物雙元表達(dá)載體p1304sgt3p，以pCAMBIA1304為陽性對照表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時表達(dá)及穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)合GUS組織化學(xué)染色對其進(jìn)行功能鑒定.【結(jié)果】 電泳圖表明為1條長約2 500 bp的特異擴(kuò)增條帶，瞬時表達(dá)和穩(wěn)定遺傳表達(dá)的煙草葉片的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果均顯示gus基因在轉(zhuǎn)化煙草葉片中高效表達(dá)，并且低于陽性對照，非轉(zhuǎn)化煙草葉片中無表達(dá).【結(jié)論】成功克隆到sgt3基因起始密碼子上游2 392 bp的啟動子序列并且該啟動子具有活性.

馬鈴薯；茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；啟動子克??；功能鑒定

堿糖苷生物堿(steroidal glycoalkaloids，SGAs)，又名馬鈴薯素或龍葵素，是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于茄科(Solanaceae)和百合科(Liliaceae)植物中.現(xiàn)已被認(rèn)為是人類食物中最嚴(yán)重的有毒物質(zhì)之一.它對病毒、真菌、細(xì)菌、昆蟲、原蟲、蠕蟲、其他植物以及哺乳動物和人都具有生物學(xué)作用[1-4].在馬鈴薯(Solanumtuberosum)栽培種中，95%的糖苷生物堿是以α-茄堿(α-solanine)和α-卡茄堿(α-chaconine)的形式存在[5-6].α-茄堿和α-卡茄堿有相同的糖苷配基—茄啶(solanidine )，但在碳水化合物組成結(jié)構(gòu)上有所不同[4].它密切關(guān)系著塊莖的食用和加工品質(zhì)、馬鈴薯自身的抗病蟲能力以及其遺傳育種[7].茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶(solanidine rhamnosyltransferase，SGT3)是SGAs生物合成過程末端代謝支路的關(guān)鍵酶之一，它催化β-卡茄堿和β-茄堿轉(zhuǎn)化為α-卡茄堿和α-茄堿[8-9].

啟動子是一段能與RNA聚合酶以及其轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件.一個典型的啟動子包括CAAT-box和TATA-box，它們分別是依賴DNA的RNA聚合酶的識別位點和結(jié)合位點，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游幾十個堿基處.啟動子上含有順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子與之結(jié)合，從而抑制或激活基因的轉(zhuǎn)錄.啟動子在一定程度上決定了基因表達(dá)的時間以

及空間順序[10-12].

為了研究茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因的調(diào)控特點，本研究從‘莊薯3號’中克隆了其上游調(diào)控序列，并用PLACE和PLANTCARE進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行瞬時表達(dá)，分析了該啟動子的活性.本研究有助于深入了解sgt3基因高表達(dá)并積累SGAs的分子機(jī)制，為進(jìn)一步開展糖苷生物堿合成的時空調(diào)控提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參考魏桂民等[13]的試驗材料，光敏感型馬鈴薯‘莊薯3號’，野生型(wild-type)煙草‘T12’，所用菌株均為本實驗室(甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室)保存，載體，Genome Walking Kit等均從公司購買.

1.2 試驗方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計、合成 根據(jù)在NCBI網(wǎng)站中查詢的馬鈴薯sgt3基因的cDNA序列(登錄號為GI：82590366)，在5′端上游保守序列處設(shè)計3條特異性引物(SP1、SP2、SP3，表1)用Primer Primer 5.0軟件，SP3的位置在SP2、SP1的內(nèi)側(cè)，隨機(jī)引物由試劑盒提供.

表1 啟動子PCR擴(kuò)增特異引物

1.2.2 馬鈴薯sgt3基因啟動子序列的克隆 參考魏桂民等[13]方法，分別以上述合成的特異引物SP1、SP2、SP3和隨機(jī)引物AP1的組合為引物，采用染色體步移技術(shù)進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增.

PCR產(chǎn)物的回收純化及連接和轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選參考魏桂民等[13]的方法，將鑒定為陽性的菌液送測序公司進(jìn)行測序，目的序列命名為sgt3p.

1.2.3 馬鈴薯sgt3基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析 參考魏桂民等[13]的方法對測序得到的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點、潛在的順式元件等進(jìn)行預(yù)測分析.

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 選用pCAMBIA1304為基本雙元載體.根據(jù)1.2.2中的測序結(jié)果設(shè)計特異引物sgt3F:5′-GTTGTATGGACC TTTTGGTTTGGAT-3′，sgt3R:5′-GTTCCTTCACTTCAGTTGACTCGTA-3′，以1.2.2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增起始密碼子上游DNA序列，正向引物的5′端引入KpnⅠ酶切位點,反向引物的5′端引入NcoⅠ酶切位點.將PCR產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上，得到pMD19-sgt3p克隆，雙酶切pMD19-sgt3p質(zhì)粒和pCAMBIA1304載體，連接回收產(chǎn)物，使起始密碼子上游DNA序列替換pCAMBIA1304載體上的CaMV35S啟動子，得到植物雙元表達(dá)載體p1304sgt3p (圖3)，含sgt3p::gfp::gus融合基因.以pCAMBIA1304為陽性對照表達(dá)載體，由CaMV35S啟動子驅(qū)動gus基因表達(dá).

1.2.5sgt3p::gfp::gus在煙草葉片中的瞬時表達(dá) 參考魏桂民等[14]的方法進(jìn)行瞬時表達(dá)，參考Jefferson等[15]的方法，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色.以表達(dá)載體pCAMBIA1304轉(zhuǎn)化的煙草葉片為陽性對照，非轉(zhuǎn)化煙草葉片作為陰性對照.

1.2.6sgt3p::gfp::gus在煙草中的穩(wěn)定表達(dá) 參考魏桂民等[13]的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，以潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因煙草，所獲得的抗性植株以hpt-F(5′-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3′ )及hpt-R(5′-ATCTTAGCCAGACGAGCGGG-3′ )引物進(jìn)行核基因組DNA為模板的PCR檢測，擴(kuò)增589 bp的hpt基因片段，取陽性植株頂部第3個葉片參考Jefferson等[15]的方法，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色.以表達(dá)載體pCAMBIA1304轉(zhuǎn)化的煙草為陽性對照，非轉(zhuǎn)化煙草作為陰性對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯sgt3基因啟動子序列的克隆

擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1，電泳圖表明為1條長約2 500 bp的特異擴(kuò)增條帶(圖1).

2.2 馬鈴薯sgt3基因啟動子序列的生物信息學(xué)分析

將克隆得到的茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子序列，通過在線分析軟件PLACE分析程序和PLANTCARE分析程序，分析核心啟動子區(qū)域和順式調(diào)控元件.發(fā)現(xiàn)該序列具有核心啟動子元件CAAT-box和TATA-box(圖2)，起始密碼子上游17 位點處的G為可能的轉(zhuǎn)錄起始位點，啟動子序列存在大量的與光響應(yīng)有關(guān)的元件，還有一些與環(huán)境及植株發(fā)育相關(guān)的元件(表2，圖2).表明，所克隆的sgt3基因起始密碼子上游2 392 bp序列為啟動子區(qū)域序列，它包含各種響應(yīng)馬鈴薯植株發(fā)育信號及外界環(huán)境刺激的順式作用元件.

M：DNA marker DL5000；1-2： sgt3啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物.圖1 sgt3啟動子的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplications of sgt3 promoter

2.3 p1304sgt3p雙元表達(dá)載體的構(gòu)建

按圖3-A的流程構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體.構(gòu)建的p1304sgt3p載體用KpnⅠ和NcoⅠ雙酶切檢測，結(jié)果可切下相應(yīng)大小的DNA片段(圖3-B).

2.4 Sgt3p驅(qū)動gus基因在煙草葉片中的瞬時表達(dá)

將上述構(gòu)建的植物表達(dá)載體p1304sgt3p和陽性對照pCAMBIA1304表達(dá)載體分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草， GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖4)，sgt3p驅(qū)動gus基因在煙草葉片中達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度低于CaMV35S啟動子的表達(dá)強(qiáng)度，非轉(zhuǎn)基因煙草葉片中無GUS表達(dá).

2.5 Sgt3p驅(qū)動gus基因在煙草葉片中的穩(wěn)定表達(dá)

將檢測為陽性植株的煙草，取頂部第3個葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖5，sgt3p驅(qū)動gus基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度低于CaMV35S啟動子的表達(dá)強(qiáng)度，非轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片中無GUS表達(dá).

3 討論

本研究采用染色體步移技術(shù)首次克隆了馬鈴薯sgt3基因起始密碼子上游2 392 bp的啟動子區(qū)域序列(圖2).利用PLACE分和PLANTCARE進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中存在大量的與光響應(yīng)有關(guān)的元件，如Ⅰ-box，GA-motif，G-Box，Box4，-10PEHVPSBD，Sp1等，還有一些與環(huán)境相關(guān)的元件如ACGTATERD1，ABRELATERD1，ARE，Box-W1，GAREAT(圖2，表2).表明該啟動子可能為誘導(dǎo)型啟動子，特別受光誘導(dǎo)，還受水分脅迫、逆境、厭氧、赤霉素、脫落酸等誘導(dǎo).而前人研究結(jié)果也表明：光照條件下，馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿會快速合成，其含量比沒有光照的條件時增加將近1倍[16]；而王旺田等[17]，季彥林等[18]的報道也表明，紅光是誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖糖苷生物堿積累的重要信號；除受遺傳因子決定外，多樣的環(huán)境因素亦使馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿的含量差異顯著[19]，這與本研究分析結(jié)果相一致.

表2 sgt3啟動子區(qū)域中的調(diào)控基序

黑色加粗字母為預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點，被定義為+1，各種順式調(diào)控元件用下劃線標(biāo)出并在在序列的上方注明圖2 ‘莊薯3號’sgt3基因的啟動子序列Fig.2 Nucleotide sequence of the sgt3 promoter region

瞬時表達(dá)是指引入細(xì)胞的外源 DNA和宿主細(xì)胞染色體 DNA 并不發(fā)生整合，而是隨載體進(jìn)入細(xì)胞后12 h左右就可表達(dá)，基因產(chǎn)物在2～4 d內(nèi)即可被檢測出.因此具有簡單、快速、周期短、準(zhǔn)確等優(yōu)點，彌補(bǔ)了常規(guī)轉(zhuǎn)基因方式周期長、轉(zhuǎn)化效率低等缺點[20-21].它不受基因位置效應(yīng)、基因沉默的影響，表達(dá)效率較穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高.本研究采用這一技術(shù)，將構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體p1304sgt3p(圖3)導(dǎo)入煙草葉片，以pCAMBIA1304為陽性對照表達(dá)載體，由CaMV35S啟動子驅(qū)動gus基因的表達(dá)，結(jié)合GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明gus基因在轉(zhuǎn)化p1304sgt3p的煙草葉片中高效表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度低于強(qiáng)啟動子CaMV35S驅(qū)動的gus基因的表達(dá)強(qiáng)度，而非轉(zhuǎn)化煙草葉片中無gus基因的表達(dá)(圖4).這與穩(wěn)定遺傳表達(dá)結(jié)果相一致，本研究將構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體p1304sgt3p(圖3)采用農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，以pCAMBIA1304為陽性對照表達(dá)載體，以潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因煙草，將所獲得的抗性植株進(jìn)行PCR檢測后，取陽性植株頂部第3個葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果同樣(圖5)表明gus基因在轉(zhuǎn)化p1304sgt3p的煙草植株中的葉片高效表達(dá)，并且低于強(qiáng)啟動子CaMV35S驅(qū)動的gus基因的表達(dá)強(qiáng)度，非轉(zhuǎn)化煙草植株葉片中無gus基因的表達(dá).這表明了瞬時表達(dá)具有一定的可靠性.本研究瞬時表達(dá)和穩(wěn)定遺傳表達(dá)結(jié)果共同表明了所克隆的啟動子具有活性，能驅(qū)動gus基因在煙草葉片中高效表達(dá)，為今后開展SGAs生物合成的時空調(diào)控，利用基因工程技術(shù)培育出馬鈴薯新型品種奠定基礎(chǔ).

A：表達(dá)載體構(gòu)建流程圖；B：表達(dá)載體p1304sgt3p的酶切檢測；M：DNA marker DL2000；1：KpnⅠ和NcoⅠ雙酶切檢測.圖3 馬鈴薯sgt3基因啟動子驅(qū)動報告基因的p1304sgt3p雙元表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.2 Fig.3 Construction of binary vector p1304sgt3p harboring reporter gene driven by sgt3 gene promoter

A：sgt3p::gfp::gus；B：CaMV35S::gfp::gus；C：wild-type.圖4 sgt3p::gfp::gus在煙草葉片中瞬時表達(dá)的GUS組織化學(xué)分析Fig.4 Transient expression of gus gene driven by sgt3p in tobacco leaves

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(責(zé)任編輯 李辛)

Cloning and functional identification of potatosgt3 gene promoter

WEI Gui-min1,2LI De-wen2,LUO Li-si2,WANG Shao-ming2,WANG Jun2,

(1.Gansu Key Lab of Crop Improvement & Germplasm Enhancement，College of Agronomy,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China；2.Guizhou Institute of Oil (Spice) Crops,Guiyang 550006,China)

【Objective】 To clone the promoter sequence of 5′ upstream of initial codon of the potato gene of solanidine galactosyltransferases (sgt3) and identify its function.【Method】 The promoter sequence was cloned by using the Genome walking and then was fused withgfp::gusgene originated from pCAMBIA1304 to construct a binary vector p1304sgt3p.The vector pCAMBIA1304 was used as a positive control expression vector.And they were introduced into wild type tobacco leaves through Arobacterium mediated instantaneous expression and stable genetic transformation to identify the function of the promoter sequence.【Result】 Electrophoregram shows that a pecific amplification bands about 2 500 bp was cloned.The GUS staining showed that gus gene was highly expressed both in transgenic tobacco leaves and instantaneous expression blade,and the expression was lower than that in positive control,and there was no epression in the wild type tobacco leaves.【Conclusion】 The 2 392 bp promoter sequence of 5′ upstream of initial codon of sgt3 gene cloned was successfully cloned,and the promoter had activity.

solanum tuberosum；solanidine rhamnosyltransferase；promoter cloning；functional identification

魏桂民(1986-)，女，研究實習(xí)員，碩士，主要從事香料研究.E-mail：wgm6204@126.com

張金文，男，教授，博導(dǎo)，主要從事作物改良研究.E-mail:jwzhang305@163.com

國家自然科學(xué)基金項目(31260343)；科技部國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)前期項目(2010CB13400)；甘肅省自然科學(xué)基金項目(0710RJZA088).

2015-12-03；

2016-01-13

S 532

A

1003-4315(2016)05-0032-07