TM7SF4對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH-4增殖、凋亡和侵襲的作用研究

周秦毅 陳雋 馮嘉麟 王家東

·論著·

TM7SF4對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH-4增殖、凋亡和侵襲的作用研究

周秦毅 陳雋 馮嘉麟 王家東

目的探討樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白(TM7SF4)的低表達(dá)對(duì)人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞IHH-4增殖、凋亡和侵襲的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法選取甲狀腺乳頭狀癌患者的手術(shù)標(biāo)本(癌組織及癌旁組織)及甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系IHH-4為對(duì)象。qRT-PCR法檢測(cè)病理組織和細(xì)胞系IHH-4中TM7SF4的mRNA表達(dá)量。分別用MTT法、流式細(xì)胞分析和Transwell法檢測(cè)TM7SF4表達(dá)量對(duì)IHH-4細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。Western印跡檢測(cè)IHH-4細(xì)胞中磷酸化與非磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)的表達(dá)。結(jié)果與癌旁組織相比，甲狀腺癌組織中TM7SF4的mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=52.31，P<0.05)。與正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori 3-1相比，IHH-4細(xì)胞系中TM7SF4的表達(dá)水平也顯著上升(t=34.35，P<0.05)。與對(duì)照組細(xì)胞相比，沉默TM7SF4的表達(dá)后，可誘導(dǎo)IHH-4細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞增殖和侵襲能力受到顯著抑制(F=8.32，7.55，846.40；P均<0.05)。此外，沉默TM7SF4的表達(dá)后可顯著降低磷酸化PI3K、磷酸化Akt、磷酸化mTORmRNA及蛋白的表達(dá)(F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12；P均<0.05)。結(jié)論低表達(dá)的TM7SF4可能通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路而抑制IHH-4細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡并抑制侵襲。

甲狀腺乳頭狀癌；樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞侵襲

甲狀腺癌是一種起源于甲狀腺的常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)的發(fā)病率呈增加趨勢(shì)[1]。分化型甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是甲狀腺癌多種臨床分型中最主要的分型，其發(fā)病率較高，占所有甲狀腺癌的80%左右[2-3]。已有報(bào)道表明化學(xué)治療、放射治療和手術(shù)切除是PTC的常規(guī)治療方法，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，各類治療效果都不夠理想[4-5]。近年來(lái)，很多研究致力于PTC的致病基因研究，以期從分子角度找到治療甲狀腺癌的有效手段。

樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白(Dendrocyte Expressed Seven Transmembrane Protein，DCSTAMP；又名Transmembrane 7 Superfamily Member 4，TM7SF4)是一種由TM7SF4基因編碼的主要存在于樹突狀細(xì)胞內(nèi)的7次跨膜蛋白，參與細(xì)胞融合、細(xì)胞分化和免疫穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程[6]。前期報(bào)道證明TM7SF4在人破骨細(xì)胞發(fā)生、融合與再吸收和骨Paget病等中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-8]。但在甲狀腺癌中的報(bào)道卻很少。目前，已有學(xué)者利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到TM7SF4在甲狀腺癌組織中的表達(dá)會(huì)發(fā)生異常[9-10]。新近研究中，Lan等[11]利用基因組測(cè)序法檢測(cè)到TM7SF4在PTC組織中的表達(dá)量顯著增加。但尚未有研究證明TM7SF4與PTC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。本研究利用人PTC細(xì)胞系IHH-4，研究了TM7SF4基因在該細(xì)胞系中的作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例樣本信息、細(xì)胞培養(yǎng) 選取2013年9月至2015年1月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院入院并被診斷為PTC的32對(duì)病理及其癌旁組織作為實(shí)驗(yàn)材料。PTC病理組織及鄰近正常組織置于-80℃中保存?zhèn)溆?。PTC細(xì)胞株IHH-4及正常細(xì)胞株Nthy-ori 3-1(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在 37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。本研究已被上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者都知情同意。

1.2 材料 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素G418、TM7SF4抗體和磷酸化與非磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕酶素靶蛋白(mTOR)抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；pcDNA3.1過(guò)表達(dá)載體和siRNA沉默載體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Lipofectamine 2000、細(xì)胞MTT增殖試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒與Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒和蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將濃度為5×107/L的IHH-4細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后(細(xì)胞貼壁生長(zhǎng))，按照Lipofectamine 2000試劑盒的操作步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用10 μl的Lipofectamine 2000包被4 μg質(zhì)粒(含TM7SF4編碼序列的沉默siRNA載體或過(guò)表達(dá)pcDNA-TM7SF4載體)轉(zhuǎn)入IHH-4細(xì)胞。6～8 h后更換新鮮的含抗生素G418的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入的空siRNA載體作為對(duì)照組。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照MTT試劑盒操作步驟檢測(cè)TM7SF4基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。轉(zhuǎn)入不同類型載體的細(xì)胞經(jīng)過(guò)抗生素篩選并繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將該細(xì)胞接種于96孔板上并用新鮮培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/孔。在不同觀察時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μl MTT，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。在波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定吸光度A值，然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用流式細(xì)胞法檢測(cè)TM7SF4基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。將1 ml的IHH-4培養(yǎng)液平鋪到24孔板上并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度約至1×105個(gè)/孔。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后用胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，于12 000 g離心5 min收集細(xì)胞體。接著調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109個(gè)，使用凋亡試劑盒進(jìn)行避光染色，染色1 h后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算活細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。細(xì)胞總凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 用Transwell法檢測(cè)TM7SF4基因沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。取對(duì)數(shù)期的IHH-4細(xì)胞用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋制成濃度為1×109/L的單細(xì)胞懸液。用100 μl/孔上室凝膠液(融化的Matrigel原液和預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)基混合液)包被24孔板的Transwell上室，37℃下放置2 h使其凝固。每孔加入200 μl IHH-4單細(xì)胞懸液。將500 μl含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基加入 Transwell下室，置于含 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，取出Transwell小室，去除液體培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗后置于4%的甲醛中固定15 min， PBS漂洗 2 min，結(jié)晶紫染色 5 min。于400倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)(選取5個(gè)視野計(jì)算平均值)。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)TM7SF4基因及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路蛋白PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達(dá)用Trizol法從甲狀腺癌組織及IHH-4細(xì)胞系中分別提取總RNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。提取的總RNA經(jīng)過(guò)RNse-free Dnase Ⅰ處理后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度和濃度。用不含核酸降解酶的雙蒸水調(diào)節(jié)RNA濃度為0.5 μg/μl，作為cDNA合成的模板，具體操作參照PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。參考SYBR ExScript RT-qPCR Kit試劑盒操作步驟進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μl(1 μl cDNA, 10 μl SYBR Premix EX Taq, 1 μl primer, 7 μl ddH2O)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃預(yù)變性2 min； 95℃變性10 min；退火10 s，60℃延伸1 min，45個(gè)循環(huán)。2-△△Ct表示mRNA的表達(dá)水平。選擇GAPDH作為內(nèi)參(表1)。

1.8 Western印記檢測(cè)TM7SF4蛋白及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路蛋白PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化和非磷酸化的表達(dá) 收集培養(yǎng)24 h后的IHH-4細(xì)胞溶解于RIPA裂解液中，于4℃下以12 000 g離心5 min。收集離心后上清以獲得總蛋白，利用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。將50 μg的總蛋白上樣至12%的聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，置于含5%牛血清蛋白的TBST緩沖液中室溫下封閉1 h。然后加入兔抗人一抗(TM7SF4，磷酸化PI3K，磷酸化Akt，磷酸化mTOR，1∶100)4℃下過(guò)夜孵育。加入二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h。ECL檢測(cè)蛋白條帶。選擇GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究中所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±平均標(biāo)準(zhǔn)誤，所有數(shù)據(jù)均用Graph Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間差異性統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法，多組間比較采用方差分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，當(dāng)IHH-4細(xì)胞轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4載體時(shí)，細(xì)胞活力(OD值)隨培養(yǎng)時(shí)間增加而顯著升高(F=6.62，P<0.05)。但是當(dāng)IHH-4細(xì)胞轉(zhuǎn)入si-TM7SF4載體時(shí)，細(xì)胞活力隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而顯著下降(F=8.32，P<0.05，圖1)。

注：Control：轉(zhuǎn)入siRNA空載體的IHH-4細(xì)胞；pc-TM7SF4：轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；si-TM7SF4：轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；TM7SF4：樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白；與對(duì)照組相比，aP<0.05圖1 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4的細(xì)胞凋亡率沒(méi)有顯著變化(6.20%vs. 4.04%)，而轉(zhuǎn)入si-TM7SF4的IHH-4細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著升高(15.5%，F(xiàn)=6.87，P<0.05)，而且同時(shí)轉(zhuǎn)入沉默和過(guò)表達(dá)載體后的IHH-4細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)(5.15%)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異(圖2A，2B)。

表1 qRT-PCR引物序列及產(chǎn)物

注：TM7SF4: 樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白；PI3K: 磷脂酰肌醇3激酶；Akt：絲/蘇氨酸蛋白激酶；mTOR: 哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；GAPDH: 磷酸甘油醛脫氫酶

注：A：流式細(xì)胞分析法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡結(jié)果;si-NC:轉(zhuǎn)入siRNA空載體的IHH-4細(xì)胞；pc-TM7SF4:轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；si-TM7SF4:轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；TM7SF4：樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白；B：各組細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù);與對(duì)照組相比, aP<0.05圖2 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞凋亡的影響

注：A: 與甲狀腺癌旁組織相比，TM7SF4在乳頭狀甲狀腺癌組織中的相對(duì)mRNA表達(dá)水平；B：TM7SF4在甲狀腺癌細(xì)胞系IHH-4和正常細(xì)胞系Nthy-ori-3-1中的相對(duì)mRNA水平，與對(duì)照組(正常細(xì)胞系Nthy-ori-3-1)相比，aP<0.05；C-D：TM7SF4沉默與過(guò)表達(dá)后在不同組中的mRNA和蛋白水平檢測(cè)；si-NC：轉(zhuǎn)入siRNA空載體的IHH-4細(xì)胞；pc-TM7SF4：轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；si-TM7SF4：轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；PTC：甲狀腺乳頭狀癌；GAPDH：三磷酸甘油醛脫氫酶；與對(duì)照組相比，aP<0.05；TM7SF4：樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白圖4 TM7SF4在PTC病理組織及IHH-4細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞侵襲的影響 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4的IHH-4細(xì)胞侵襲的數(shù)目顯著增加，而轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞侵襲的數(shù)目顯著下降(F=846.40，P<0.01)。同時(shí)轉(zhuǎn)入沉默和過(guò)表達(dá)載體的組中，侵襲細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差別(圖3A，3B，封3)。

2.4 TM7SF4在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR方法檢測(cè)TM7SF4在PTC組織和癌旁臨近正常組織中的表達(dá)水平(圖4A)。與臨近正常組織相比，TM7SF4在癌組織中的表達(dá)顯著上升(t=52.31，P<0.01)。與正常細(xì)胞株Nthy-ori-3-1相比，TM7SF4在IHH-4細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著上升(t=34.35，P<0.01)，見(jiàn)圖4B。分別構(gòu)建TM7SF4基因沉默和過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入IHH-4細(xì)胞系中(圖4C, 4D)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞中的TM7SF4相對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降，而轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4的IHH-4細(xì)胞中其相對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高(F=49.00，42.25，P均<0.05)。當(dāng)沉默和過(guò)表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)入IHH-4細(xì)胞中時(shí)，TM7SF4的mRNA和蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。

2.5 TM7SF4基因沉默對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比，當(dāng)IHH-4細(xì)胞轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4過(guò)表達(dá)載體時(shí)，磷酸化的PI3K、Akt和mTOR的相對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，但當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)入si-TM7SF4載體時(shí)，磷酸化的PI3K、Akt、mTOR的相對(duì)mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12；P均<0.05；圖5A, 5B)。同時(shí)轉(zhuǎn)入沉默和過(guò)表達(dá)載體的細(xì)胞中，磷酸化的因子水平則與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異。

3 討論

利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)TM7SF4在甲狀腺癌中發(fā)生異常表達(dá)[9-10]。但關(guān)于TM7SF4對(duì)PTC細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的影響及其生物學(xué)機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。只有Nikolova等[10]采用生物信息預(yù)測(cè)法和RT-PCR法報(bào)道了TM7SF4在甲狀腺癌發(fā)生中高表達(dá)，可能是甲狀腺癌發(fā)生的一個(gè)重要靶基因。本研究結(jié)果顯示，TM7SF4在PTC組織和IHH-4細(xì)胞系中表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，與前期研究結(jié)果一致[10- 11]。表明TM7SF4與PTC的發(fā)病存在密切關(guān)系。

注：PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；p-PI3K：磷酸化PI3K；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化mTOR；A: 經(jīng)過(guò)不同TM7SF4表達(dá)水平處理后，p-PI3K，p-Akt和p-mTOR的相對(duì)mRNA表達(dá)水平；與對(duì)照組相比，aP<0.05；bP<0.01；B：不同處理組中p-PI3K，p-Akt和p-mTOR的蛋白表達(dá)水平；si-NC:轉(zhuǎn)入siRNA空載體的IHH-4細(xì)胞；pc-TM7SF4:轉(zhuǎn)入pcDNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；si-TM7SF4:轉(zhuǎn)入siRNA-TM7SF4載體的IHH-4細(xì)胞；TM7SF4：樹突表達(dá)特異性7跨膜蛋白圖5 TM7SF4對(duì)IHH-4細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR mRNA及蛋白表達(dá)的影響

已有研究證實(shí)細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-14]。前期研究證明TM7SF4在骨形成或骨炎性反應(yīng)相關(guān)疾病中都呈高表達(dá)，但在腫瘤中的作用報(bào)道較少[15-16]。在Tu等[17]研究中，TM7SF4高表達(dá)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖與侵襲，參與前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。Kim等[9]采用基因組測(cè)序的方法證明了TM7SF4參與PTC的細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究結(jié)果顯示TM7SF4低表達(dá)(基因沉默后)可以顯著抑制IHH-4細(xì)胞增殖和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)低表達(dá)的TM7SF4可能在PTC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，而Akt是其下游關(guān)鍵蛋白[21]。PI3K/Akt/mTOR被激活時(shí)可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄腜I3K/Akt/mTOR，Akt能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲。mTOR可以直接或間接被磷酸化Akt激活而發(fā)生磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡，在腫瘤發(fā)生中起促進(jìn)作用[22]。另一方面，Santarpia等[23]證明在甲狀腺癌中，Akt被激活后，可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。同時(shí)，Miyakawa等[24]研究證明，磷酸化Akt在PTC組織中的表達(dá)量顯著上升，而且100%的PTC中都能檢測(cè)到高表達(dá)水平的磷酸化Akt。與前人研究結(jié)果一致，本研究中TM7SF4高表達(dá)時(shí)，磷酸化PI3K、磷酸化Akt和磷酸化mTOR的水平都顯著上升。然而，當(dāng)TM7SF4基因表達(dá)被沉默時(shí)，上述3種因子的磷酸化水平則顯著下降，表明低表達(dá)的TM7SF4參與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活。

本研究表明，TM7SF4低表達(dá)可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活進(jìn)而抑制PTC細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡并抑制其侵襲。TM7SF4可能是PTC的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制及其臨床應(yīng)用潛在能力尚有待進(jìn)一步研究。

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EffectsofTM7SF4onproliferation,apoptosisandinvasionofhumanpapillarythyroidcancerIHH-4cells

ZhouQinyi,ChenJun,FengJialin,WangJiadong.

DepartmentofHeadandNeckSurgery,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200001,China

Correspondingauthor:WangJiadong,Email:drjiadongw@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of dendrocyte expressed seven transmembrane protein (TM7SF4) on proliferation, apoptosis and invasion of human papillary thyroid cancer (PTC) cell IHH-4.MethodsPTC tumor tissues and the adjacent normal tissues, as well as the human PTC IHH-4 cells were used in this study. TM7SF4 mRNA in tissues and in IHH-4 cells were analyzed using qRT-PCR analysis. The effects of TM7SF4 on proliferation, apoptosis and invasion of IHH-4 cells were analyzed using MTT assay, flow cytometry and Transwell assay, respectively. Furthermore, Western blotting was used to detect the expression of TM7SF4，phosphorylated and non-phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), mammalian target of rapamycin (mTOR) protein.ResultsCompared with adjacent normal tissues, TM7SF4 mRNA and protein were significantly increased IHH-4 in PTC tissues (t=52.31,P<0.05). TM7SF4 was also significantly increased in cells compared with that in Nthy-ori 3-1 cells (t=34.35,P<0.05). Consequently, silencing TM7SF4 significantly induced IHH-4 cells apoptosis, inhibited proliferation and suppressed invasion compared with controls (F=8.32, 7.55， 846.40；allP<0.05). Moreover, the mRNA and protein levels of phosphorylated-PI3K, phosphorylated-Akt and phosphorylated-mTOR were significantly decreased by silencing TM7SF4 (F=1 014.88，1 121.29，985.22，720.14，854.63，4 563.12, allP<0.05).ConclusionDown-regulated TM7SF4 may be an inhibitor of PTC development and metastasis through suppressing PI3K/Akt/mTOR pathway.

Papillary thyroid cancer; Dendrocyte expressed seven transmembrane protein; Cell proliferation; Cell apoptosis; Cell invasion

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.04.08

200001 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院頭頸外科

王家東，Email: drjiadongw@aliyun.com

2015-08-29)