定量檢測人甲狀腺過氧化物酶抗體化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的臨床應(yīng)用

柴錦燕 方佩華 譚建 李寧

·論著·

定量檢測人甲狀腺過氧化物酶抗體化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的臨床應(yīng)用

柴錦燕 方佩華 譚建 李寧

目的應(yīng)用人甲狀腺過氧化物酶抗體(hTPOAb)的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)試劑盒，檢測正常人及各類甲狀腺疾病患者，探討該試劑盒在臨床應(yīng)用中的價值。方法用該試劑盒共測定333例樣品血清中的hTPOAb，包括正常人133名，各類甲狀腺疾病患者200例，其中橋本甲狀腺炎(HT)94例，Graves病68例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫19例，亞急性甲狀腺炎10例，單純性甲狀腺腫9例。結(jié)果確立本試劑盒hTPOAb陽性切限值為3.22 IU/ml，hTPOAb濃度以中位數(shù)表示，分別為HT5.48 IU/ml，陽性率為91.50%；Graves病1.88 IU/ml，陽性率為29.40%；結(jié)節(jié)性甲狀腺腫1.83 IU/ml，陽性率為10.50%，亞急性甲狀腺炎2.54 IU/ml，陽性率為20.00%；單純性甲狀腺腫2.21 IU/ml，陽性率為0。HT患者血清hTPOAb陽性率高于其他患者(χ2=67.22，60.13，35.49，49.89，P均<0.01)。結(jié)論該定量檢測hTPOAb的CLEIA試劑盒在HT中有很高的陽性率，可作為HT有效的診斷手段。

碘化物過氧化物酶； 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)； 自身抗體； 橋本甲狀腺炎

甲狀腺過氧化物酶位于甲狀腺濾泡上皮頂端細(xì)胞膜上,是甲狀腺激素合成過程中的關(guān)鍵酶,具有特殊的免疫學(xué)活性。自身免疫性甲狀腺疾病是臨床上常見的一類器官特異性自身免疫性疾病，主要包括橋本甲狀腺炎、Graves病、產(chǎn)后甲狀腺炎等。人甲狀腺過氧化物酶抗體(hTPOAb)在自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用[1-3]。本文利用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(CLEIA)技術(shù)構(gòu)建試劑盒，對正常人及各種甲狀腺疾病患者進(jìn)行臨床檢測。

1 對象和方法

1.1 對象及分組 選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年6月至2014年10月門診及住院的各類甲狀腺疾病患者200例。依據(jù)病史、臨床癥狀和體征、甲狀腺B超、病理診斷及實驗室檢查進(jìn)行診斷。其中，橋本甲狀腺炎患者94例，男14例，女80例，年齡11～81歲，平均(38.15±16.10)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：病程數(shù)月至數(shù)十年，多數(shù)有甲狀腺功能減退癥臨床表現(xiàn)，甲狀腺腫大，質(zhì)中、韌或硬，血清甲狀腺激素顯示低功能狀態(tài)，甲狀腺過氧化物酶抗體和甲狀腺球蛋白抗體陽性，B超提示甲狀腺回聲欠均勻，呈條索樣改變；少數(shù)橋本甲狀腺炎病例經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。Graves病患者68例，男14例，女54例，年齡12～73歲，平均(40.34±13.16)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：均有高代謝臨床表現(xiàn)，甲狀腺彌漫性腫大伴或不伴有突眼，血清甲狀腺激素顯示高功能狀態(tài)，促甲狀腺素受體抗體(TRAb)陽性。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者19例，男3例，女16例，年齡15～66歲，平均(41.14±10.45)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：B超提示有甲狀腺結(jié)節(jié)，血清甲狀腺激素顯示正常水平，甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體及TRAb均為陰性。亞急性甲狀腺炎患者10例，男2例，女8例，年齡20～64歲，平均(43.00±12.05)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：主要表現(xiàn)有低熱，頸部疼痛，B超提示甲狀腺片狀低回聲區(qū)，血清甲狀腺激素顯示略高于正常水平，甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體及TRAb均為陰性。單純性甲狀腺腫患者9例，男1例，女8例，年齡43～62歲，平均(51.90±6.48)歲；診斷標(biāo)準(zhǔn)：B超提示甲狀腺腫大，血清甲狀腺激素顯示正常水平，甲狀腺過氧化物酶抗體、甲狀腺球蛋白抗體及TRAb均為陰性。正常人組為20～30歲的男性133例，甲狀腺球蛋白抗體、甲狀腺過氧化物酶抗體及TRAb均陰性，無甲狀腺疾病個人史和家族史，未觸及甲狀腺腫，均無心臟、腎臟、肝臟疾病病史。

本研究經(jīng)過受檢者知情同意，并通過醫(yī)院倫理委員會的審批。受檢者早晨空腹抽取靜脈血并通過4℃，4 000 r/min(r=5 cm)，離心10 min，所得血清于-80℃冰箱儲存。

1.2 試劑和儀器 本室研制的用96孔板定量測定hTPOAb的CLEIA試劑盒。Fluoroskan Ascent FL化學(xué)發(fā)光分析儀為美國Thermo公司生產(chǎn)，辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人抗體IgG購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，其他均為進(jìn)口或國產(chǎn)優(yōu)級純、分析純試劑，實驗用水為超純?nèi)ルx子水。

1.3 檢測方法

1.3.1 抗原包被 以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的，經(jīng)分離純化所得的人甲狀腺過氧化物酶膜外區(qū)抗原決定簇?zé)狳c區(qū)基因表達(dá)的融合蛋白為包被抗原，以中國藥品生物制品檢定所的WHO Anti-hTPOAb RS(66/387)為對照品,經(jīng)協(xié)作標(biāo)定后的標(biāo)準(zhǔn)品為本方法的參考標(biāo)準(zhǔn)，通過一系列試驗條件優(yōu)化篩選，建立了用96孔板定量測定hTPOAb的CLEIA技術(shù)并組裝成試劑盒。96孔板4℃過夜，漂洗封閉后分別加入待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人抗體IgG，漂洗后加入魯米諾發(fā)光底物，經(jīng)過Fluoroskan Ascent FL儀器測量其發(fā)光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以計算出樣品中hTPOAb的濃度。

1.3.2 相關(guān)性分析 采用本室研制的hTPOAb CLEIA試劑盒及雅培公司的AXSYM System的Anti-hTPOAb試劑盒, 從上述200例甲狀腺疾病患者血清中隨機(jī)抽取76份血清進(jìn)行hTPOAb檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 檢測結(jié)果經(jīng)過Kolmogorov-Smirnov檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，結(jié)果以中位數(shù)表示,采用秩和檢驗進(jìn)行比較(兩組之間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗)，率的比較用χ2檢驗。所用統(tǒng)計軟件為SPSS 17.0。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)性分析 本室研制的hTPOAb CLEIA試劑盒與雅培公司的Anti-hTPOAb試劑盒，這兩種檢測方法的結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.80,P<0.01),見圖1。

注：橫坐標(biāo)為本室研制的hTPOAb CLEIA試劑盒檢測的濃度，縱坐標(biāo)為雅培公司AXSYM System的hTPOAb試劑盒檢測的濃度；hTPOAb：人甲狀腺過氧化物酶抗體圖1 兩種檢測試劑盒相關(guān)性分析

2.2 精密度 本室研制的hTPOAb CLEIA試劑盒測定陽性、陰性對照血清的批內(nèi)變異分別為5.32%、13.17%；批間變異兩個月連續(xù)測定6次，陽性、陰性對照血清的批間變異分別為7.53%、14.87%。

2.3 hTPOAb陽性切限值的建立 以正常人組血清hTPOAb濃度值為代表，結(jié)果顯示hTPOAb為正偏態(tài)分布(P<0.01)，因此，所得結(jié)果以百分位數(shù)表示，以其hTPOAb濃度高于95百分位即3.22 IU/ml為陽性。

2.4 hTPOAb試劑盒檢測結(jié)果 測定結(jié)果以中位數(shù)表示，橋本甲狀腺炎為5.48 IU/ml；Graves病為1.88 IU/ml；結(jié)節(jié)性甲狀腺腫為1.83 IU/ml；亞急性甲狀腺炎為2.54 IU/ml；單純性甲狀腺腫為2.21 IU/ml。橋本甲狀腺炎患者血清hTPOAb陽性率高于其他患者，見表1。

表1 各類甲狀腺疾病患者血清hTPOAb檢測結(jié)果

注：a：橋本甲狀腺炎患者h(yuǎn)TPOAb陽性率與其他患者分別比較的值；hTPOAb：人甲狀腺過氧化物酶抗體

3 討論

我國hTPOAb的測定開始于20世紀(jì)80年代，主要是定性測定，經(jīng)歷了放射免疫分析法測定甲狀腺微粒體抗體(TMAb), 該方法本身存在的缺點使得它逐漸被新的無放射污染的方法所替代，同時由于該法測定的是TMAb，并非是純的hTPOAb，因此TMAb檢測技術(shù)的特異性低于hTPOAb的檢測。

近年來，國內(nèi)臨床上檢測hTPOAb多引進(jìn)國外定量測定試劑盒，其是以提取的高純度甲狀腺過氧化物酶為抗原，但是由于甲狀腺過氧化物酶是一種膜蛋白，純化困難，提取時可能會混雜其他甲狀腺自身抗原(如甲狀腺球蛋白)的污染，會影響結(jié)果的可靠性。雖然后來提取工藝得到了改善，與以前粗提的甲狀腺微粒體抗原相比減少了其他混雜的甲狀腺抗原的干擾幾率，但是來源仍然有限。目前國內(nèi)、外各個商家生產(chǎn)的hTPOAb發(fā)光免疫技術(shù)的試劑盒測定儀器昂貴，檢測費用較高，在國內(nèi)進(jìn)一步推廣較難。此外，每個商品試劑盒的陽性切限值均為生產(chǎn)廠家自行確定，尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)并且相差很大，范圍在4～60 IU/ml[4-5]。

本研究以人甲狀腺過氧化物酶膜外熱點區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物，并經(jīng)純化的融合蛋白GST-人甲狀腺過氧化物酶為抗原，建立CLEIA方法對常見的甲狀腺疾病進(jìn)行檢測，由于重組甲狀腺過氧化物酶來源幾乎不受限制，且又無其他甲狀腺抗原污染，特異性好，所以可以更好地應(yīng)用于hTPOAb的檢測，但至今尚未見用基因工程產(chǎn)品為抗原的定量檢測hTPOAb商品試劑盒的報道。

本實驗室前期的研究已經(jīng)建立了熒光酶免疫分析法檢測hTPOAb[6]。熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，必須提供光源去激發(fā)分子產(chǎn)生能級躍遷，進(jìn)而發(fā)光。化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量促使產(chǎn)生能級躍遷，從而發(fā)光[7-9]。使用上述兩種方法進(jìn)行免疫分析時，其區(qū)別很明顯，化學(xué)發(fā)光無需外加光源，背景干擾??；而熒光則需要外加光源，由于血清樣品中的蛋白質(zhì)、氨基酸等分子也會產(chǎn)生背景熒光，需要選擇合適的熒光試劑減少非特異性吸附蛋白的影響。熒光酶免疫分析法對酶催化的熒光底物有著嚴(yán)格的要求，而且在加入熒光底物后，如果不加任何干預(yù)，酶所催化的反應(yīng)過程很難達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，測量隨時間延長結(jié)果變化較大，所以還得加入終止液EDTA，1 h之內(nèi)測定，這樣使得測定的時間延長。

本化學(xué)發(fā)光法與熒光酶免疫分析法檢測hTPOAb相比，對橋本甲狀腺炎檢測陽性率更高(91.5%vs. 85.7%)，說明本法比熒光酶免疫分析法更靈敏[6]。在Graves病、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、亞急性甲狀腺炎患者中也有一定的陽性率，與熒光酶免疫分析法報道一致。

對于一種檢測方法來說，陽性切限值的確立非常重要。筆者按照美國國家臨床生化協(xié)會指南推薦的以年齡低于30歲、血清促甲狀腺激素濃度在0.5～2.0 mIU/L、無甲狀腺腫大、無個人及家族甲狀腺病史且無其他自身免疫疾病的男性青年為入選標(biāo)準(zhǔn)，篩選了133例基本符合上述條件的健康男性的血清標(biāo)本作為正常對照組[10]。30歲以下的男性青年血清抗體滴度最低，因為在該組健康人群中僅有少數(shù)出現(xiàn)hTPOAb大于3.22 IU/ml屬于陽性，而且滴度都較低(hTPOAb在3.5～4.0 IU/ml之間)，所占比例也不多(陽性率為5.26%)。所以以其測定值來制定陽性切限值，可以提高自身抗體的檢出率。

綜上所述，本技術(shù)用重組的人甲狀腺過氧化物酶膜外區(qū)蛋白為抗原建立的96孔板的定量CLEIA來檢測hTPOAb，橋本甲狀腺炎組hTPOAb水平與其他幾組甲狀腺疾病比較，其陽性率顯著升高(P<0.01)。因此，對橋本甲狀腺炎的診斷也具有特異的臨床意義[11]。由于重組的人甲狀腺過氧化物酶抗原純、來源穩(wěn)定、可靠，方法靈敏、特異、簡便，便于推廣，可常規(guī)用于臨床。

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Clinicalapplicationofchemiluminescenceenzymeimmunoassaytoquantitativelydetecthumanthyroidperoxidaseantibodies

ChaiJinyan,FangPeihua,TanJian，LiNing.

DepartmentofNuclearMedicine,TheGeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China

ObjectiveTo apply chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) kits of thyroid peroxidase antibodies (hTPOAb) on normal and all kinds of patients with thyroid diseases, and explore the clinical value of the kits.MethodsThe hTPOAb kits were used in 333 cases of serum samples, including 133 cases of healthy people, 94 cases of Hashimoto′s thyroiditis(HT),68 cases of Graves′ disease(GD), 19 cases of nodular goiter,10 cases of subacute thyroiditis and 9 cases of simple goiter.ResultsConcentration above 3.22 IU/ml was considered to be positive of the hTPOAb kits. The median concentration of hTPOAb was 5.48 IU/ml in HT(positive ratio was 91.50%),1.88 IU/ml in GD (positive ratio was 29.40%),1.83 IU/ml in nodular goiter(positive ratio was 10.50%),2.54 IU/ml in subacute thyroiditis(positive ratio was 20.00%),and 2.21 IU/ml in simple goiter(positive ratio was 0).The positive ratio of hTPOAb in patients with HT was higher than that of the other patients(χ2=67.22,60.13,35.49,49.89，allP<0.01).ConclusionThe CLEIA kits of hTPOAb has a high positive rate for HT, and is an effective method in diagnosing HT.

Iodide peroxidase；Chemiluminescence enzyme immuneassay；Autoantibodies； Hashimoto′s thyroiditis

國家臨床重點專科建設(shè)項目

Correspondingauther:FangPeihua,Email:fangpeihuali@163.com

FundprogramNational Specialty Construction of Clinical Projects

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.01.006

300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

方佩華， Email: fangpeihuali@163.com

2015-07-04)