白藜蘆醇對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血同型半胱氨酸和氧化應激指標的影響

王海敏 湯旭磊

·論著·

白藜蘆醇對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血同型半胱氨酸和氧化應激指標的影響

王海敏 湯旭磊

目的觀察白藜蘆醇對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血同型半胱氨酸(Hcy)和氧化應激指標的影響。方法32只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，按隨機數(shù)字表法分為4組：去卵巢組、乙烯雌酚組、白藜蘆醇組和假手術(shù)組，每組8只。去卵巢組、乙烯雌酚組和白藜蘆醇組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)復制骨質(zhì)疏松模型。術(shù)后1周開始灌胃給藥，假手術(shù)組和去卵巢組大鼠給予蒸餾水(每日一次)，其余兩組大鼠分別予乙烯雌酚0.03 mg·kg-1·d-1和白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1。治療10周后，測定大鼠血漿總Hcy(tHcy)、總抗氧化能力(TAC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛水平，取L5椎體和右股骨進行骨密度測定。結(jié)果與假手術(shù)組相比，去卵巢組血漿tHcy和丙二醛水平升高，TAC和 GSH-Px水平下降；與去卵巢組相比，乙烯雌酚組和白藜蘆醇組血漿tHcy和丙二醛濃度均明顯降低，TAC和GSH-Px水平顯著升高(F=19.709，117.219，7.020，20.544，P均<0.01)；白藜蘆醇組血漿丙二醛濃度較乙烯雌酚組升高(F=117.219，P<0.01)。與假手術(shù)組相比，去卵巢組腰椎和股骨骨密度均明顯降低；與去卵巢組相比，乙烯雌酚組腰椎和股骨骨密度明顯升高，接近假手術(shù)組水平(P>0.05)；白藜蘆醇組腰椎和股骨骨密度升高，但仍低于乙烯雌酚組和假手術(shù)組(F=48.518，43.263，P均<0.01)。血漿tHcy與腰椎和股骨骨密度呈負相關(guān)(r=-0.663，P<0.001；r=-0.520，P=0.002)， TAC與股骨骨密度呈正相關(guān)(r=0.539，P=0.001)。結(jié)論高Hcy血癥和氧化應激與去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松關(guān)系密切。白藜蘆醇可能通過降低血漿tHcy水平和改善氧化應激，對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)揮保護作用。

白藜蘆醇；骨質(zhì)疏松；同型半胱氨酸；氧化應激

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是一種以雌激素缺乏為主要病因，以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病。據(jù)報道，絕經(jīng)后雌激素缺乏與同型半胱氨酸(Hcy)代謝和氧化抗氧化失衡所致的氧化應激具有密切的聯(lián)系[1-2]。白藜蘆醇是一種結(jié)構(gòu)類似雌激素乙烯雌酚的天然多酚類化合物，具有雌激素樣的調(diào)節(jié)血脂、抗氧化和抗血小板聚集等多種重要生物學作用[3]。Schroecksnadel等[4]在體外培養(yǎng)人外周血單核細胞中發(fā)現(xiàn)，抗炎性復合物白藜蘆醇抑制活化的單核細胞內(nèi)Hcy的形成。但白藜蘆醇對去卵巢大鼠血Hcy及氧化應激指標的影響尚未見系統(tǒng)報道。為此，本研究擬觀察白藜蘆醇對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型血漿總Hcy(tHcy)和氧化應激指標的影響，進一步探討白藜蘆醇抗骨質(zhì)疏松的作用及機制，為開發(fā)抗骨質(zhì)疏松藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 3月齡清潔級(SPF)雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，使用許可證號為：SYXK(甘)2004-0006,批號：060510。SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按數(shù)字表法隨機分成4組：假手術(shù)組，去卵巢組，乙烯雌酚組(乙烯雌酚0.03 mg·kg-1·d-1)，白藜蘆醇組(白藜蘆醇20 mg·kg-1·d-1)，每組8只。

1.2 實驗用儀器及試劑 白藜蘆醇由陜西華昌生物工程有限公司生產(chǎn)，純度為 98.3%；己烯雌酚片劑由合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，0.5 mg/片； tHcy ELISA 試劑盒由美國USCN life science技術(shù)公司生產(chǎn)，產(chǎn)品編號：E0772r；總抗氧化能力(TAC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛測定試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；雙能X線骨密度儀為美國LUNAR公司產(chǎn)品。

1.3 骨質(zhì)疏松動物模型制備和干預措施 各組大鼠在SPF環(huán)境下，以戊巴比妥鈉40 mg/kg體重腹腔注射麻醉后，于下腹部正中切口，切開皮膚、肌肉，進入腹腔，假手術(shù)組只切除卵巢周圍的與其大小相似的一小脂肪團，保留雙側(cè)卵巢，其余3組大鼠切除雙側(cè)卵巢。所有大鼠在SPF環(huán)境下常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后1周開始灌胃給藥，白藜蘆醇由溶媒、乙烯雌酚片劑由蒸餾水配成相應濃度的混懸液用于灌胃，假手術(shù)組和去卵巢組灌服蒸餾水，每天1次。每周稱體重1次調(diào)整給藥劑量，共給藥10周。

1.4 標本采集 用藥10周末，心臟采血，置于肝素抗凝管內(nèi)，于30 min內(nèi)3 000 r/m(r=79.407 cm)，離心10 min，取上清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；大鼠處死后，快速分離雙側(cè)股骨和L5椎體，剔除周圍附著的肌肉及結(jié)締組織，去除椎體棘突和關(guān)節(jié)突，用生理鹽水紗布包裹并作好標記，用于骨密度檢測。

1.5 血漿tHcy及氧化應激指標的測定 血漿tHcy測定采用酶聯(lián)免疫吸附法，血漿TAC、GSH-Px和丙二醛測定采用化學比色法。

1.6 腰椎和股骨骨密度測定 使用雙能X線骨密度儀測定離體的腰椎和股骨骨密度(g/cm2)，掃描距離0.1 mm。

2 結(jié)果

2.1 血漿tHcy和氧化應激指標的變化 與假手術(shù)組相比，去卵巢組血漿tHcy和丙二醛水平明顯升高(P均<0.01)，TAC和GSH-Px水平均顯著降低(P均<0.01)；與去卵巢組相比，乙烯雌酚組和白藜蘆醇組血漿tHcy和丙二醛水平均明顯降低(P均<0.01)，TAC和GSH-Px水平顯著升高(P均<0.05)；白藜蘆醇組血漿丙二醛水平較乙烯雌酚組升高(P<0.01)，血漿tHcy、TAC和GSH-Px水平，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠腰椎和股骨骨密度的變化 與假手術(shù)組相比，去卵巢組腰椎和股骨骨密度均明顯降低(P均<0.01)；與去卵巢組相比，乙烯雌酚組腰椎和股骨骨密度明顯升高(P均<0.01)，接近假手術(shù)組水平(P>0.05)；白藜蘆醇組腰椎和股骨骨密度升高(P均<0.01)，但仍低于乙烯雌酚組和假手術(shù)組(P均<0.01)，見表2。

2.3 血漿tHcy、TAC與腰椎和股骨骨密度的直線相關(guān)性 直線相關(guān)分析顯示，血漿tHcy濃度與腰椎和股骨骨密度呈負相關(guān)(r=-0.663，P<0.001;r=-0.520，P=0.002)；血漿TAC與股骨骨密度呈正相關(guān)(r=0.539，P=0.001)，TAC與腰椎骨密度無關(guān)(P>0.05)。

3 討論

絕經(jīng)、雌激素缺乏、Hcy代謝與骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松性骨折的關(guān)系，已成為近年來研究的熱點問題。Gjesdal等[5]通過大樣本橫斷面調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中老年女性血漿tHcy水平與髖部骨密度呈負相關(guān)，提示血漿tHcy水平升高可能是女性骨質(zhì)疏松的一個潛在危險因素。Bahtiri等[1]對139名絕經(jīng)后女性進行的一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女血Hcy水平與骨密度具有相關(guān)性，高水平的血Hcy是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的獨立危險因素。為進一步探討Hcy與骨質(zhì)疏松的因果關(guān)系，Herrmann等[6]利用富含蛋氨酸和Hcy的飲食，誘導高Hcy血癥大鼠動物模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高Hcy血癥是骨質(zhì)疏松的發(fā)病因素。Koh等[7]在細胞及分子水平上，通過小鼠骨髓細胞模型研究發(fā)現(xiàn)，接近生理濃度的Hcy通過增加細胞內(nèi)活性氧簇的產(chǎn)生，直接刺激破骨細胞的形成和活性，從而增強骨吸收作用，該研究結(jié)果也提示，即輕、中度的高Hcy血癥個體，也可能因破骨細胞增多，骨吸收增強，而發(fā)生骨質(zhì)疏松，補充適量的抗氧化劑，可能會對抗骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

本實驗研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，去卵巢組血漿tHcy濃度明顯升高，腰椎和股骨骨密度顯著降低；血漿tHcy濃度與腰椎和股骨骨密度呈負相關(guān)。乙烯雌酚和白藜蘆醇可顯著降低去卵巢大鼠血漿tHcy濃度，同時增加去卵巢大鼠腰椎和股骨骨密度，不同的是白藜蘆醇組腰椎和股骨骨密度低于乙烯雌酚組，而兩組大鼠血漿tHcy濃度差異無統(tǒng)計學意義。該實驗研究結(jié)果也印證了Hcy與雌激素缺乏及雌激素缺乏相關(guān)的骨質(zhì)疏松有一定的聯(lián)系。雌激素乙烯雌酚和植物雌激素白藜蘆醇抗骨質(zhì)疏松的作用機制之一，可能與其降低去卵巢大鼠血漿tHcy濃度有關(guān)。同時也提示植物雌激素白藜蘆醇的抗骨質(zhì)疏松作用略低于雌激素乙烯雌酚。Koz等[8]利用蛋氨酸飲食復制高Hcy血癥大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可降低模型大鼠血Hcy，對抗Hcy誘導的大鼠動脈和海馬細胞的氧化應激、細胞凋亡，對模型大鼠的血管、神經(jīng)細胞損傷及認知功能障礙發(fā)揮保護作用。本研究首次提出了白藜蘆醇抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的機制之一與其降低血Hcy水平有關(guān)，為白藜蘆醇抗骨質(zhì)疏松的機制探討提供了一條新思路。

另外，絕經(jīng)雌激素缺乏所伴發(fā)的氧化應激與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)，Sharma等[2]對95名21～65歲女性進行的一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組較絕經(jīng)后健康組，血GSH-Px、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、TAC明顯降低，該項研究結(jié)果表明，氧化應激在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的病理過程中發(fā)揮著重要的作用。李明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑維生素C、維生素E及谷胱甘肽顯著增加去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度，阻止血清抗氧化成分(超氧化物歧化酶、GSH-Px)減少，提高血清抑制OH-能力，降低脂質(zhì)過氧化物丙二醛水平，提示抗氧化在骨質(zhì)疏松治療中可能具有重要作用。

表1 白藜蘆醇對去卵巢大鼠血漿tHcy和氧化應激指標的影響

注：tHcy:總同型半胱氨酸；TAC:總抗氧化能力；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；MDA:丙二醛；與假手術(shù)組相比,aP<0.01； 與去卵巢組相比,bP<0.05，cP<0.01；與乙烯雌酚組相比,dP<0.01

表2 白藜蘆醇對去卵巢大鼠腰椎和

注： 與假手術(shù)組相比,aP<0.01； 與去卵巢組相比,bP<0.01；與乙烯雌酚組相比,cP<0.01

本研究結(jié)果顯示，去卵巢組大鼠血漿TAC和GSH-Px 活性明顯降低，丙二醛濃度顯著升高，血漿TAC與股骨骨密度呈正相關(guān)。提示去卵巢大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化防御能力降低，從而使活性氧簇堆積，導致脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物丙二醛濃度增加，造成氧化應激。與去卵巢組比較，白藜蘆醇組大鼠血漿TAC和 GSH-Px 活性明顯升高，丙二醛濃度明顯降低，腰椎和股骨骨密度顯著增加，但仍低于假手術(shù)組和乙烯雌酚組。提示白藜蘆醇可以提升去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi)的抗氧化酶活性，改善其體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)，從而對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)揮保護作用，與傅松波等[10]研究結(jié)果相似。

綜上所述，高Hcy和氧化應激與去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松關(guān)系密切；白藜蘆醇可能通過降低血漿tHcy水平和改善其氧化應激狀態(tài)，而對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)揮保護作用。

[1] Bahtiri E,Islami H,Rexhepi S,et al. Relationship of homocysteine levels with lumbar spine and femur neck BMD in postmenopausal women[J].Acta Reumatol Port,2015, [Epub ahead of print]．

[2] Sharma T,Islam N,Ahmad J,et al. Correlation between bone mineral density and oxidative stress in postmenopausal women[J].Indian J Endocrinol Metab,2015,19(4):491-497.DOI:10.4103/2230-8210.159053.

[3] Chow SE,Hshu YC,Wang JS,et al. Resveratrol attenuates oxLDL-stimulated NADPH oxidase activity and protects endothelial cells from oxidativefunctional damages[J].J Appl Physiol (1985),2007,102(4):1520-1527.

[4] Schroecksnadel K,Winkler C,Wirleitner B,et al. Anti-inflammatory compound resveratrol suppresses homocysteine formation in stimulated human peripheralblood mononuclear cellsinvitro[J].Clin Chem Lab Med,2005,43(10):1084-1088.

[5] Gjesdal CG,Vollset SE,Ueland PM,et al. Plasma total homocysteine level and bone mineral density: the Hordaland Homocysteine Study[J].Arch Intern Med,2006,166(1):88-94.

[6] Herrmann M,Wildemann B,Claes L,et al. Experimental hyperhomocysteinemia reduces bone quality in rats[J].Clin Chem,2007,53(8):1455-1461.

[7] Koh JM,Lee YS,Kim YS,et al. Homocysteine enhances bone resorption by stimulation of osteoclast formation and activity through increasedintracellular ROS generation[J].J Bone Miner Res,2006,21(7):1003-1011.

[8] Koz ST,Etem EO,Baydas G,et al. Effects of resveratrol on blood homocysteine level,on homocysteine induced oxidative stress,apoptosis andcognitive dysfunctions in rats[J].Brain Res,2012,1484:29-38.DOI:10.1016/j.brainres.2012.09.026.

[9] 李明,白曉春,劉俊,等.抗氧化劑對去卵巢大鼠骨密度和血清生化指標的影響[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2008,24(4):368-371．DOI:10.3321/j.issn:1000-6699.2008.04.006.

[10] 傅松波,湯旭磊,楊曉梅,等.白黎蘆醇對糖尿病腎損害大鼠超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國老年學雜志,2012,32(18):3965-3967.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2012.18.046.

Effectsofresveratrolonplasmahomocysteineandoxidativestressinovariectomizedosteoporoticrats

WangHaimin，TangXulei．

DepartmentofEndocrinology，TheFirstHospitalofLanzhouUniversity，Lanzhou730000，China

TangXulei,Email:xulei_tang@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of resveratrol on plasma homocysteine and oxidative stress markers in ovariectomized(OVX) osteoporotic rats．MethodsThirty-two three-month-old female Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups according to the random number table, which were OVX group, diethylstilbestrol group, resveratrol group and sham-operated group, with eight rats in each group. The osteoporotic models were established by bilateral ovariectomy in OVX group，diethylstilbestrol group and resveratrol group. Gastric gavage was started from one week after surgery. Rats in sham-operated group and OVX group were given distilled water once a day. Rats in the other two groups were given diethylstilbestrol (0.03 mg·kg-1·d-1)and resveratrol( 20 mg·kg-1·d-1), respectively．After treatment for 10 weeks,levels of total homocysteine (tHcy), total antioxidant capacity (TAC)，glutathione peroxidase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) were measured. The 5th lumbar vertebrae and right femur were removed to determine bone mineral density (BMD)．ResultsCompared with sham-operated group, plasma levels of tHcy and MDA were significantly increased, whereas levels of TAC and GSH-Px were remarkably decreased in OVX group. Compared with OVX group, plasma levels of tHcy and MDA were significantly decreased, but levels of TAC and GSH-Px were increased(F=19.709, 117.219,7.020,20.544, allP<0.01) in diethylstilbestrol group and resveratrol group. Plasma level of MDA in resveratrol group was higher than that in diethylstilbestrol group(F=117.219，P<0.01).Compared with sham-operated group, BMD of lumbar vertebrae and femur were decreased in OVX group.Compared with OVX group, BMD of lumbar vertebrae and femur were remarkably improved in diethylstilbestrol group, which were similar to sham-operated group(P>0.05). BMD of lumbar vertebrae and femur were remarkably increased in resveratrol group, but were still lower than those of diethylstilbestrol group and sham-operated group (F=48.518,43.263, allP<0.01). Plasma tHcy was negatively correlated with BMD of lumbar vertebrae and femur (r=-0.663,P<0.001;r=-0.520,P=0.002). A positive correlation was observed between plasma TAC and BMD of femur(r=0.539,P=0.001).ConclusionsHyperhomocysteinemia and oxidative stress are closely related to osteoporosis in OVX rats. Resveratrol may protect against osteoporosis by decreasing plasma level of tHcy and improving oxidative stress in OVX rats．

Resveratrol；Osteoporosis； Homocysteine；Oxidative stress

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.01.005

730000 蘭州大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌科(第一作者現(xiàn)在濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院內(nèi)分泌科)

湯旭磊， Email:xulei_tang@126.com

2015-06-24)