直流磁場對洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程的影響

宋健飛 劉 斌 關(guān)文強 張德權(quán)

(1天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室 天津 300134；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 北京 100193)

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直流磁場對洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程的影響

宋健飛1劉 斌1關(guān)文強2張德權(quán)2

(1天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室 天津 300134；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 北京 100193)

為探究不同場強的直流電磁場對植物組織細(xì)胞在凍結(jié)相變過程中細(xì)胞及冰晶形狀和大小的影響，本文取洋蔥第三層果肉為研究對象，切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，在低溫冷臺上放置樣品切片進行細(xì)胞凍結(jié)實驗，采用的降溫速率：0 ℃之前為10 ℃/min；0 ℃之后為3 ℃/min；終溫為-25 ℃。直流磁場強度分別為0 Gs(對比組)、4.6 Gs、18 Gs、36 Gs、72 Gs。實驗過程中觀察了不同場強作用下洋蔥細(xì)胞及冰晶形態(tài)的變化，并提出“細(xì)胞二維保持率ζ”這一指標(biāo)對果蔬細(xì)胞凍結(jié)效果進行評價，利用AutoCAD軟件對顯微圖像進行數(shù)據(jù)計算得出ζ值。結(jié)果表明：磁場輔助凍結(jié)洋蔥細(xì)胞冰晶形成趨向于霧化，沙?；?，抑制冰晶生長，從而減小冰晶尺寸，有利于保持細(xì)胞原有形態(tài)，使細(xì)胞損害率降低；隨著磁場強度的增強，洋蔥細(xì)胞相變時間逐漸縮短，過冷度逐漸降低，但始終高于無磁場下的過冷度。

食品加工技術(shù)；直流磁場凍結(jié)；冰晶及細(xì)胞形態(tài); 洋蔥

冷藏是保持食品品質(zhì)最有效方法，即將食品在低溫下貯藏[1]，但仍存在凍結(jié)及復(fù)溫條件下的細(xì)胞損傷問題，使食品品質(zhì)大打折扣，原因是食品凍結(jié)過程中存在“最大冰晶生成帶”，溫度區(qū)間約為：-1～-5 ℃[2-3]，在此溫度區(qū)間產(chǎn)生過大尺寸的冰晶會對細(xì)胞造成損害。同時，環(huán)境溫度和冷庫負(fù)荷的波動會造成凍結(jié)果蔬細(xì)胞組織發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象，使原本產(chǎn)生的冰晶尺寸繼續(xù)變大[4]，進而對凍存細(xì)胞組織產(chǎn)生破壞作用。大量研究表明：冰晶的大小與降溫速率、相變時間、過冷度大小等密切相關(guān)[5-8]。近幾年來，磁場的非熱效應(yīng)在生物材料和食品凍結(jié)過程中的影響受到廣泛關(guān)注。陳照章等[9]發(fā)現(xiàn)50 kHz交變磁場對該溶液中冰晶的生長具有顯著的抑制作用，并形成了含鹽冰；婁耀郟等[10]研究發(fā)現(xiàn)磁場對鯉魚不同冷凍階段的影響規(guī)律不同：磁場對鯉魚冷卻階段的影響較小，對相變階段有明顯的促進作用，對凍結(jié)階段有延緩作用；周子鵬等[11]發(fā)現(xiàn)直流磁場能夠降低水的最低不結(jié)晶溫度，增大過冷度，提高結(jié)晶生長速度；Xanthakis E等[12]在對里脊(豬肉)凍結(jié)過程中加入不同功率的微波輔助，發(fā)現(xiàn)在凍結(jié)過程中應(yīng)用微波導(dǎo)致溫度振蕩的削弱，并對結(jié)晶過程的過冷度有顯著影響；李文博等[13]研究發(fā)現(xiàn)對于去離子水，直流磁場會提高過冷度，延長過冷時間，不同強度的直流磁場對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖溶液過冷過程的影響呈現(xiàn)多極值的現(xiàn)象。這些研究多數(shù)是從宏觀角度來探究磁場的生物影響，而且磁場對冷凍過程中果蔬細(xì)胞及其冰晶的形態(tài)影響的相關(guān)研究很少。本文從微觀角度研究直流磁場于不同場強下對于洋蔥細(xì)胞相變過程中細(xì)胞以及冰晶形狀和大小、過冷度以及相變時間的影響，為磁場用于果蔬保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

洋蔥購買于天津市物美超市(水木天成店)。選取干凈、完整、無機械損傷、新鮮的洋蔥若干。

1.2 實驗設(shè)備

磁場發(fā)生裝置，自主設(shè)計；PEX-045USB特斯拉計，力田磁電科技有限公司生產(chǎn)，精度：0.5%，數(shù)據(jù)采樣速度：2～10次/s(軟件可設(shè)定)；BX51低溫顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)，UIS2光學(xué)系統(tǒng)，放大范圍：100～1000倍；Micro Publisher 5.0 RTV攝像機，日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)，傳感器為Sony ICX282 Progressive Scan Interline CCD，分辨率為2560×1920@36bit；BCS196低溫臺，英國Linkam Scientific Instruments，液氮降溫，溫度范圍：-196～125 ℃，加熱/冷凍速率：0.01～150 ℃/min，溫度精度0.01 ℃；VT1000S型振動切片機，Leica Biosystems生產(chǎn)，振動頻率：0～100 Hz，進刀速度：0.025～2.5 mm/s,振幅：0.2～1 mm；圖象處理軟件：AutoCAD。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗臺的搭建

實驗裝置簡圖如圖1所示。本實驗裝置主要由磁場發(fā)生裝置、低溫控制臺和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)組成。首先磁場發(fā)生裝置由亥姆赫茲線圈和電源組成，亥姆赫茲線圈采用的是耐熱等級達(dá)到180 ℃，總共625匝的聚氨酯漆包圓銅線，線圈間距離及線圈內(nèi)徑均為80 mm。直流電源部分采用的是香港龍威公司生產(chǎn)的LW-6405KDS型連續(xù)可調(diào)直流穩(wěn)壓電源。其最大支持64 V，5 A的直流電源輸出。本電源采用PWM+線性調(diào)節(jié)技術(shù)，可以實現(xiàn)電壓和電流從最小值0到最大值之間的無級連續(xù)可調(diào)。進而通過控制輸出電壓的大小來控制磁場區(qū)域內(nèi)場強的大小。低溫控制臺由三部分組成：液氮杜瓦瓶、冷熱臺和控制系統(tǒng)(內(nèi)含液氮泵)。采用液氮降溫且降溫速率由程序嚴(yán)格控制，使得降溫過程能夠嚴(yán)格按照設(shè)定好的降溫曲線來進行，相比于文獻[10]、[14]中采用速凍庫(即用制冷機組)來進行冷卻更精確，因為采用制冷機組不可避免庫內(nèi)會有溫度波動，影響實驗過程。溫度的采集由A級的Pt100鉑電阻進行實時測量。圖像采集系統(tǒng)選用Micro Publisher 5.0 RTV型攝像機，通過數(shù)據(jù)線與實驗用計算機相連接，將拍攝到的實驗數(shù)據(jù)圖像實時傳送至計算機端。

1計算機2直流穩(wěn)壓電源3交流電源4 Linkam控制臺 5液氮杜瓦瓶6亥姆霍茲線圈7奧林巴斯BX51顯微鏡 8 Micropublisher攝像機(CCD)9 Linkam BCS196冷熱臺 10特斯拉計圖1 實驗系統(tǒng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of the experimental system

1.3.2 對照組(無磁場)實驗具體步驟

1)選取市售干凈、完整、無機械損傷、新鮮的洋蔥若干。

2)將上述洋蔥取第三層果肉，切成0.5 cm×0.5 cm的方塊，厚度根據(jù)所選洋蔥本身厚度不再進行切割。

3)將上述處理過的洋蔥材料再用切片機VT1000S進行切片，切片厚度約為60 μm，舍棄外層果肉，在切片過程中可能會破壞細(xì)胞或造成一定擠壓，在細(xì)胞的選取上要注意選取完整、飽滿、清晰的細(xì)胞進行觀察。

4)將上述切片置于蓋玻片上，移液器滴定一滴蒸餾水(20 μL)到蓋玻片上對細(xì)胞進行引流以消除氣泡的存在，細(xì)胞會吸取少量水到細(xì)胞內(nèi)，稀釋細(xì)胞內(nèi)液濃度，此時細(xì)胞內(nèi)濃度低于細(xì)胞外濃度，一部分細(xì)胞外液會滲透到細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞體積一定程度的增大，再用鑷子夾持放置于低溫臺中央圓形基座上，蓋好冷臺的密封蓋。

5)開啟Linkam低溫臺控制系統(tǒng)，打開顯微鏡燈光，調(diào)焦至視野清晰，放大倍數(shù)選擇200倍，選取最佳觀察視野。

6)在實驗系統(tǒng)計算機上打開Linkam低溫控制軟件，設(shè)定降溫曲線和相關(guān)拍照設(shè)置，由于凍結(jié)相變過程均發(fā)生在0 ℃以下，為節(jié)省時間，溫度降到0 ℃以前凍結(jié)速率較快，而相變過程又太快，為了放慢以便于觀察整個相變過程，選用如表1所示降溫曲線，然后開始凍結(jié)并錄像。

7)重復(fù)上述實驗10次。

表1 實驗所采用的降溫曲線

1.3.3 實驗組(磁場組)具體操作步驟

1)～5)同對照組。

6)將已經(jīng)制作好的亥姆霍茲線圈安裝在顯微鏡冷臺兩側(cè)，固定高度和水平位置，打開磁場系統(tǒng)相關(guān)開關(guān)和電源，用特斯拉計檢測目標(biāo)區(qū)域磁場強度，調(diào)節(jié)直流電源直至目標(biāo)區(qū)域磁場強度達(dá)到要求。本實驗選取的磁場強度為4.6 Gs，9 Gs，18 Gs，36 Gs，72 Gs。

7)將上述磁場開機預(yù)熱10 min，由于漆包銅線溫度上升達(dá)到熱平衡，電阻減小，勢必會造成場強下降，因此此時需對磁場電源進行再調(diào)節(jié)，以滿足所設(shè)目標(biāo)區(qū)域磁場強度要求。

8)～9)同對照組6)～7)。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程中的圖像分析

2.1.1 對照組洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程顯微圖像分析

圖2所示為對照組洋蔥細(xì)胞組織凍結(jié)過程的顯微圖像。將樣品切片放到低溫冷臺上，利用顯微鏡自帶攝像機拍攝圖片自動記錄當(dāng)前的時間和溫度。上述顯微圖片中，第一張是實驗開始時的細(xì)胞狀態(tài)，第二張代表相變過程開始的狀態(tài)，第三張到第五張代表相變過程中的細(xì)胞和冰晶的變化狀態(tài)，最后一張為相變過程結(jié)束時的狀態(tài)。從上述凍結(jié)過程可知：相變過程開始時細(xì)胞圖像會突然變暗，很容易判斷冰點溫度，然后圖中會出現(xiàn)很多小的“冰種”，呈現(xiàn)圓形或橢圓形，慢慢生長漸漸變大，隨后與相鄰的“冰種”相結(jié)合匯成大的冰晶。期間冰晶體積膨脹會擠壓細(xì)胞組織，導(dǎo)致細(xì)胞間隙的水分和細(xì)胞內(nèi)被擠出的水分在組織間流動，并慢慢凝固，最終使圖像變暗。

圖2 洋蔥凍結(jié)過程(無磁場)Fig.2 The freezing process of onion (no MF)

2.1.2 不同場強作用下洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程顯微圖像分析

對于磁場作用下的凍結(jié)過程，兼顧篇幅限制，現(xiàn)只列出洋蔥細(xì)胞在不同場強作用凍結(jié)終了時的顯微圖像。觀察圖2和圖3可知，無磁場作用下，細(xì)胞相變過程產(chǎn)生的冰晶較大，呈現(xiàn)刀片狀，冰晶長度基本和顯微圖像上細(xì)胞的寬度相當(dāng)；有磁場作用下所產(chǎn)生的冰晶大小普遍比無磁場作用下小，直流磁場作用下多呈現(xiàn)輕薄繁密而且很小的鱗片狀；隨著場強的增大，鱗片狀的程度更明顯，且鱗片減小。這表明：在細(xì)胞凍結(jié)過程中，磁場能夠抑制核化過程中冰晶生長，相對于對照組(無磁場作用)避免形成過大的冰晶。在果蔬冷藏保鮮過程中，磁場表現(xiàn)出來的抑制冰晶生長的作用能夠保護細(xì)胞膜，從而有利于保持果蔬營養(yǎng)成分和水分，保持果蔬新鮮感和高品質(zhì)。

圖3 洋蔥在各種磁場下凍結(jié)終了時刻顯微圖像Fig.3 The images of onion cells at the end of freezing with different magnetic fields

2.2 細(xì)胞變形的理論計算

冷凍冷藏過程中果蔬的細(xì)胞大小和細(xì)胞形態(tài)隨著相變的進行必然會發(fā)生變化，而這種變化正是導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降的根本原因。針對上述細(xì)胞變化情況，在前人研究經(jīng)驗[15-17]的基礎(chǔ)上，提出了無量綱參數(shù)“細(xì)胞二維保持率ζ”的概念。

圖4 細(xì)胞變形的理論計算模型Fig.4 The theoretical computational model for cell deformation

如圖4所示，計算中將果蔬細(xì)胞近似為橢圓處理，僅考察二維平面內(nèi)的大小和形態(tài)變化，大小變化用當(dāng)量半徑(equivalent radius)rE的變化衡量；定義θ為形態(tài)變化參量，以橢圓半長軸rL和半短軸rS的比值衡量，即：

(1)

(2)

(3)

式中：rE和θ分別為相變過程結(jié)束后的當(dāng)量直徑和形態(tài)參量(即橢圓的半長軸與半短軸之比)，表征形態(tài)變化程度。那么如此定義下的細(xì)胞二維保持率ζ既和大小變化相關(guān)又和形態(tài)變化相關(guān)，無量綱參數(shù)ζ的數(shù)值就代表了不同凍結(jié)方式下果蔬細(xì)胞保持原來的形態(tài)和大小的能力。

由此定義無量綱評價參數(shù)Γ：

(4)

式中：Γ為針對某一種特定的磁場強度大量實驗下的凍結(jié)效果對細(xì)胞組織的損害程度；n為樣本容量，即獨立實驗進行的次數(shù)(n>0)。

表2 洋蔥細(xì)胞在各種磁場下凍結(jié)的無量綱參數(shù)

由表2可知：與無場強作用相比，實驗場強范圍內(nèi)細(xì)胞形態(tài)的保持率更好，損害程度更低。隨著磁場強度的增強，細(xì)胞形態(tài)保持率逐漸變小，無量綱評價參數(shù)逐漸變大，在4.6 Gs存在最優(yōu)極值，但在實驗場強范圍內(nèi)洋蔥細(xì)胞都始終優(yōu)于無磁場的狀況。目前做植物細(xì)胞體積計算研究的寥寥無幾，對于果蔬細(xì)胞體積計算方法還不太成熟，為減少大量的計算并快速計算，研究中將根據(jù)觀察到的細(xì)胞形態(tài)近似為橢球體來處理，已知兩個長短軸的大小，均小于或在兩個數(shù)量級左右，則橢球的第三空間軸可近似取為兩個數(shù)量級的大小，得出上述所示洋蔥細(xì)胞體積分別為：3.39×106μm3、2.64×106μm3。文獻[18]在研究10種甲藻類細(xì)胞體積后指出其細(xì)胞體積介于2.97×102～4.5×104μm3。文獻[17]在對胡蘿卜細(xì)胞進行體積計算時得出細(xì)胞體積為0.8×105～4×105μm3，由于植物細(xì)胞的品種、種類不同，細(xì)胞的大小肯定會有差異，計算所得細(xì)胞體積均在合理范圍內(nèi)，因此獲得二維橢圓模型的方法誤差在合理的范圍內(nèi)。

圖5 洋蔥細(xì)胞在不同磁場強度下凍結(jié)的過冷度Fig.5 The supercooling degree of onion cells frozen with different magnetic field strengths

圖6 洋蔥細(xì)胞在不同磁場強度下凍結(jié)的相變時間Fig.6 The phase-change duration of onion cells with different magnetic field strengths

由圖5和圖6可知：洋蔥細(xì)胞凍結(jié)過程中，磁場都使洋蔥細(xì)胞的過冷度增大，相變過程推遲，相變時間縮短。在實驗磁場強度范圍內(nèi)，隨著磁場強度的增大，洋蔥細(xì)胞凍結(jié)的過冷度逐漸降低，但最終都沒有低于無磁場作用下的過冷度，相變時間逐漸縮短。磁場對洋蔥細(xì)胞相變過程的推遲作用及相變時間的縮短均利于洋蔥細(xì)胞通過最大冰晶生成帶的時間縮短，使果蔬細(xì)胞快速通過最大冰晶生成帶，在此情況下細(xì)胞組織中產(chǎn)生的冰晶尺寸會偏小，分布更均勻，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞作用就越小，有利于果蔬營養(yǎng)和風(fēng)味的保持。

3 結(jié)論

1)在實驗磁場強度范圍內(nèi)，不同強度直流磁場輔助凍結(jié)作用下發(fā)現(xiàn)：洋蔥細(xì)胞冰晶的形成多呈現(xiàn)輕薄繁密而且很小的鱗片狀；而且隨著場強的增大，鱗片狀的程度更明顯，鱗片減小。在細(xì)胞凍結(jié)過程中，避免形成過大的冰晶，利于保持果蔬營養(yǎng)成分和水分。

2)在實驗場強范圍內(nèi)，隨著磁場強度的增大，洋蔥細(xì)胞的相變時間逐漸縮短，過冷度也逐漸變現(xiàn)小，但都始終高于無磁場的洋蔥過冷度。

3)在實驗結(jié)果處理過程中提出了“無量綱參數(shù)Γ”和“細(xì)胞二維保持率ζ”兩個參數(shù)來判斷凍結(jié)對細(xì)胞的影響，在實驗強度范圍內(nèi)，在整個實驗場強內(nèi)的“細(xì)胞二維保持率ζ”始終大于無磁場中的“細(xì)胞二維保持率ζ”。

本文受四川省科技支撐(2015N20071)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(201303083-1-4)和天津市科技支撐(142CZDNC00016)項目資助。(The project was supported by the Science and Technology of Sichuan Province of China (No. 2015N20071), the Public Welfare Industry (Agriculture) (No. 201303083-1-4) and the Science and Technology of Tianjin(No. 142CZDNC00016).)

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About the corresponding author

Liu Bin, male, professor, Department of Refrigeration Technology, Tianjin University of Commerce, +86 22-26667502, E-mail: lbtju@tjcu.edu.cn. Research fields: logistics technology of cold chain.

Effect of DC Magnetic Field on Freezing Process of Onion Cells

Song Jianfei1Liu Bin1Guan Wenqiang2Zhang Dequan2

(1.Tianjin Key Laboratory of Refrigeration Technology, Tianjin University of Commerce, Tianjin, 300134, China；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agriculture Science, Beijing, 100193，China)

In order to explore the effect of DC electromagnetic field of different field strengths on the shape and size of cells and ice crystals during the freezing phase transformation process of plant tissue cells, the third layers of onion cut into squares of 0.5 cm×0.5 cm were studied. Put the onion slices on the cold platform and the cooling rate of the experiment was: 10 ℃/min before 0 ℃, 3 ℃/min after 0 ℃, and the final temperature was -25 ℃, the DC magnetic field strengths were 0 Gs (the control group) , 4.6 Gs, 18 Gs, 36 Gs, 72 Gs respectively. In the experiment, the changes of morphology of the cells and ice crystals under different strengths were observed, and the index of "two-dimensional cell retention rate ζ" was put forward to evaluate fruit and vegetable cells′ freezing effect. AutoCAD software was used to calculate the micrograph and the value of ζ. The results show that the magnetic field assisted freezing of the onion cells can make the formation of ice crystals tend to atomization and sand grains, which can inhibit the growth of ice crystals, thus reduce the size of the ice crystals, and it will also be more conducive to maintain the original cell morphology and decrease the cell damage rate. With the increasing of the magnetic field strength, phase transformation time of the onion cells decreases, supercooling degree decreases gradually, but it is always higher than that of non magnetic field.

food processing technology; DC magnetic field freezing; morphology of ice crystals and cells; onion

0253- 4339(2016) 02- 0107- 06

10.3969/j.issn.0253- 4339.2016.02.107

2015年8月27日

TQ028.6+1; TS255.3

A

簡介

劉斌，男，教授，天津商業(yè)大學(xué)制冷與空調(diào)工程系，(022)26667502， E-mail: lbtju@tjcu.edu.cn。研究方向：低溫物流技術(shù)。