Preparation and characteristic comparison of two phase-transition multifunctional nanoparticles

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(1.Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing400016, China; 2.Institute of Ultrasound Imaging, Chongqing Medical University, Chongqing400010, China; 3.Chongqing Key Laboratory of Ultrasound and Engineering,Chongqing 400016, China; 4.Department of Obstetrics and Gynecology,Second Affiliated Hospital of Chongqing MedicalUniversity, Chongqing 400010, China)

?

·基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究·

Preparation and characteristic comparison of two phase-transition multifunctional nanoparticles

TANGQin1,2，3,ZHUShenyin1*,CHANGShufang4,CUIJianyu1,2,TIANZhonghua1,SUNJiangchuan4,WANGZhigang2,QIUFeng1

(1.DepartmentofPharmacy,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundandEngineering,Chongqing400016,China; 4.DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To prepare two multifunctional nanoparticles loaded with indocyanine green (ICG) and liquid fluorocarbon (perfluoropentane [PFP] or perfluorohexane [PFH]), and compare their physicochemical properties, stability phase-transition and imaging capacity in vitro. Methods The PLGA nanoparticles loaded with ICG and PFP or PFH (IPNPs or IHNPs) were prepared using a modified double emulsion technique, and then the physicochemical properties, stability and phase-transition under heating, laser irradiation, LIFU exposure and photoacoustic imaging capacity were compared. Results There were no significant differences between the IPNPs and IHNPs about their physicochemical properties, including size ([490.53±36.96]nm vs [512.23±38.52]nm), zeta potential ([-14.40±1.40]mV vs [-13.97±1.61]mV) and absorption spectrum, and both of them were stable within 24 h. The phase-transition energy under different situations was significantly lower in IPNPs group compared with IHNPs. In addition, the ultrasonic and photoacoustic imaging capacity obviously increased in IPNPs. The cell viability was higher in IPNPs phase-transition irradiation with laser energy than that in IHNPs ([95.34±7.96]% vs [54.92±6.11]%,P<0.05). Conclusion IPNPs might be a more promising multifunctional platform for theranostics.

Multifunctional nanoparticles; Fluorocarbons; Phase-transition; Imaging

近年來(lái)，納米醫(yī)學(xué)技術(shù)的多功能化，可將顯像診斷劑與治療藥物整合于同一給藥系統(tǒng)，形成一種新的治療診斷型多功能分子影像探針，實(shí)現(xiàn)醫(yī)學(xué)成像引導(dǎo)下的可視化診療[1-4]，且隨著該領(lǐng)域研究的深入，多功能造影劑可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像，以彌補(bǔ)現(xiàn)有成像方式的不足。傳統(tǒng)超聲微泡造影劑為診療一體化的發(fā)展起到了巨大推動(dòng)作用，但其粒徑過(guò)大、不易穿過(guò)血管內(nèi)皮間隙及不穩(wěn)定等性質(zhì)限制了其作為診療探針的應(yīng)用與發(fā)展[3]。相變型高分子納米粒的出現(xiàn)為診療一體化的發(fā)展提供了新的可能。目前常用的相變材料為液態(tài)氟碳化合物，其中以低沸點(diǎn)的液態(tài)全氟正戊烷(perfluoropentane, PFP)及全氟己烷(perfluorohexane, PFH)最為常用，沸點(diǎn)分別為29℃和56℃，在常溫下均為液態(tài)，外界壓力減小至氣化壓力閾值或溫度升高至沸點(diǎn)以上時(shí)，可發(fā)生液氣相轉(zhuǎn)變，可用于超聲、MRI等成像[5-6]。液態(tài)氟碳納米?？赏瑫r(shí)攜載治療藥物，轉(zhuǎn)運(yùn)至治療部位達(dá)到診療一體化的目的。吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)是美國(guó)及我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的顯像和診斷劑，其在近紅外光區(qū)有最大光吸收，可作為良好的熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)深部病變組織準(zhǔn)確靈敏的顯影。此外，ICG也作為光敏物質(zhì)廣泛應(yīng)用于光動(dòng)力療法及光熱療法的研究[7-9]。

若將液態(tài)氟碳及ICG同時(shí)包載于乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)carboxyl, PLGA)]中制備成納米級(jí)微球，體外給予激光輻照，ICG吸收光能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，使液態(tài)氟碳發(fā)生相變，可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)成像，同時(shí)產(chǎn)生活性氧和熱效應(yīng)發(fā)揮治療作用，是一種非常有前景的多功能診療制劑。目前已有研究[5,10-12]報(bào)道了載ICG及PFH的PLGA納米粒，可用于增強(qiáng)光聲及超聲顯影，但缺乏載ICG及不同相變材料的相變型多功能納米粒在理化性質(zhì)、體外相變特性、光聲及超聲雙模態(tài)成像等方面的比較研究。本研究擬通過(guò)制備IPNPs及IHNPs，體外比較二者的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、相變能力、光聲及超聲雙模態(tài)成像情況，為納米粒優(yōu)化構(gòu)建及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 ICG(Sigma)，PLGA(聚合比50∶50,濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)，PFP及PFH(Sigma)，聚乙烯醇(poly vinyl alcohol, PVA, Sigma)，Malvern粒徑測(cè)定儀(Malvern)，Visual Sonics Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)，UV-Vis分光光度計(jì)(Thermo Scientific, 260-Bio)，Nd：YAG脈沖激光儀。

1.2 方法

1.2.1 IPNPs及IHNPs的制備 采用改良的雙乳化法制備納米粒[13-14]。將50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷，0.5 mg ICG溶于超純水中備用。取200l PFP或PFH加入ICG溶液中混合聲振20 s；將聲振后的乳濁液及0.5% PVA溶液加入到PLGA二氯甲烷溶液中聲振2 min，得到一級(jí)乳化液；然后將5% PVA 水溶液加入到一級(jí)乳化液中再次混合聲振2 min，得到二級(jí)乳化液；磁力攪拌4 h，使二氯甲烷充分揮發(fā)，離心洗滌至上清液澄清后重懸于超純水中，4℃保存?zhèn)溆?。全程冰浴并避光。不包裹ICG的PFP或PFH納米粒(PNPs，HNPs)不加入ICG溶液，其余步驟同前。

1.2.2理化性質(zhì)檢測(cè) 用超純水稀釋IPNPs及IHNPs后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)及分布，Malvern粒度測(cè)定儀檢測(cè)粒徑和電位；UV-Vis分光光度計(jì)檢測(cè)ICG水溶液及PNPs、HNPs、IPNPs及IHNPs在 600～850 nm的吸收光譜。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3納米粒穩(wěn)定性檢測(cè) 將兩種納米粒用超純水稀釋后保存于37℃恒溫水浴鍋中，24 h后測(cè)定二者的粒徑及電位，光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.2.4 相變及光聲成像與超聲成像觀察 將相同濃度的IPNPs及IHNPs滴于載玻片，置于加熱板中，光鏡實(shí)時(shí)觀察比較加熱條件下各納米粒的熱致相變情況；532 nm激光器激發(fā)，光鏡下觀察比較各納米粒的光致相變情況。將二者分別置于凝膠孔洞模型，用5 W低強(qiáng)度聚焦超聲(low-intensity focused ultrasound， LIFU)輻照，觀察并采集LIFU輻照前后超聲造影模式圖像；808 nm脈沖激光(20 Hz)輻照，光聲成像系統(tǒng)采集光聲及超聲信號(hào)。

1.2.5激發(fā)能量對(duì)細(xì)胞損傷作用 將MH7A滑膜成纖維細(xì)胞種于96孔板，分為陰性對(duì)照組、低能量激光組與高能量激光組，用532 nm激光器激發(fā)IPNPs及IHNPs發(fā)生相變的臨界能量作用于細(xì)胞，24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1一般特性及穩(wěn)定性 制備后重懸的納米粒呈均一的淡綠色，光鏡下觀察均呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小均一，分散度好(圖1A～1C)。激光粒徑儀測(cè)得IPNPs-IHNPs的平均粒徑分別為(490.53±36.96)nm和(512.23±38.52)nm，電位分別為(-14.40± 1.40)mV和(-13.97±1.61)mV，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。紫外分光光度計(jì)測(cè)得PNPs及HNPs在600～850 nm范圍內(nèi)均無(wú)明顯吸收峰，而IPNPs、IHNPs及ICG水溶液在780 nm左右均有明顯吸收峰(圖1D)。37℃儲(chǔ)存24 h，再次測(cè)定二者平均粒徑分別為 (497.70±76.24)nm及(548.93±73.80) nm，電位分別為 (-13.7±4.01) mV及(-13.6±1.78)mV，與24 h前無(wú)明顯變化。光鏡觀察IPNPs只有少量相變，IHNPs未見(jiàn)明顯相變，且二者分散度均良好(圖1E、1F)。

2.2熱致相變 溫度達(dá)43℃時(shí)，IPNPs開(kāi)始相變，加熱至47℃時(shí)觀察到大量相變(圖2A、2B)。而IHNPs相變發(fā)生溫度需達(dá)到70℃，加熱至75℃可觀察到大量相變(圖2C、2D)，兩種納米粒相變后均成為微米級(jí)的氣泡，并逐漸漂浮聚集，部分膨脹破裂。

圖1 兩種納米粒的一般特性及穩(wěn)定性 A.IPNPs及IHNPs大體圖； B.IPNPs光鏡圖(×600)； C.IHNPs光鏡圖(×600)； D.游離ICG及各納米粒光譜圖； E.IPNPs于37℃水浴鍋中放置24 h光鏡圖(×100)； F.IHNPs于37℃水浴鍋中放置24 h光鏡圖(×100)

圖2 熱致相變圖 A.IPNPs加熱前； B.IPNPs加熱后； C.IHNPs加熱前； D.IHNPs加熱后

2.3光致相變 激光(頻率3 Hz，強(qiáng)度160 mJ)輻照10 s，IPNPs即發(fā)生大量相變，停止激光輻照，可見(jiàn)相變后的IPNPs逐漸增大，部分未相變的納米粒開(kāi)始增大轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑴?圖3A、3B)。而IHNPs需將強(qiáng)度增至400 mJ才可大量相變(圖3C、3D)。

2.4 LIFU致相變 當(dāng)LIFU能量增至5 W，輻照 5 min時(shí)，IPNPs開(kāi)始發(fā)生相變(圖4A、4B)，液體液面上層可見(jiàn)一層漂浮氣泡。將時(shí)間延長(zhǎng)至15 min，也未能觀察到IHNPs明顯的造影信號(hào)(圖4C、4D)。定量結(jié)果顯示IPNPs輻照前后平均灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而IHNPs激發(fā)前后平均灰度值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖4E)。

2.5光聲及超聲成像觀察 光聲成像系統(tǒng)以光聲模式激發(fā)2 min后，IPNPs可檢測(cè)到明顯的造影信號(hào)，且光聲信號(hào)顯著增強(qiáng)，繼續(xù)激發(fā)至4 min，仍可觀察到明顯的光聲及造影信號(hào)。而IHNPs在激發(fā)2 min后未見(jiàn)造影信號(hào)及光聲信號(hào)增強(qiáng)，激發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)至5 min，觀察到明顯的造影信號(hào)及光聲信號(hào)。見(jiàn)圖5。

圖3 光致相變圖 A.IPNPs激發(fā)前； B.IPNPs激發(fā)后(160 mJ，10 s)； C.IHNPs激發(fā)前； D.IHNPs激發(fā)后(400 mJ，10 s)

圖4 LIFU致相變圖 A.IPNPs輻照前二維超聲及諧波圖像； B.IPNPs輻照后二維超聲及諧波圖像； C.IHNPs輻照前二維超聲及諧波圖像； D.IHNPs輻照后二維超聲及諧波圖像； E.輻照前后平均灰度定量測(cè)量結(jié)果

圖5 納米粒光聲圖 IPNPs分別激發(fā)0、2、4 min的超聲模式(A～C)、造影模式(G～I(xiàn))及光聲模式圖(M～O)； IHNPs分別激發(fā)0、2、5 min的超聲模式(D～F)、造影模式(J～L)及光聲模式圖(P～R)

圖6 單純脈沖激光對(duì)MH7A細(xì)胞的細(xì)胞毒性 A～C.分別為對(duì)照組、低能量激光組、高能量激光組光鏡圖(×100)； D.低能量激光組與高能量激光組細(xì)胞存活率

2.6 細(xì)胞毒性 低能量激光組(致IPNPs大量相變)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，而高能量激光組(致IHNPs大量相變)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性，存活率分別為(95.34±7.96)%、(54.92±6.11)%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

3 討論

本研究采用改良的雙乳化法制備的IPNPs和IHNPs，發(fā)現(xiàn)在外觀形態(tài)、粒徑、電位方面均無(wú)明顯差別；吸收光譜結(jié)果示IPNPs及IHNPs在780 nm左右有強(qiáng)吸收，與ICG的紫外分光光譜一致，提示ICG在形成納米粒的過(guò)程中光學(xué)特性未發(fā)生改變；37℃放置 24 h，IPNPs只有少量發(fā)生相變，且粒徑及電位未見(jiàn)明顯改變，可能是這部分納米粒粒徑較大，內(nèi)部拉普拉斯壓力較小所致(該壓力與半徑呈反比)[12]，IHNPs未見(jiàn)明顯相變，二者分散度均良好，未發(fā)生明顯聚集。提示兩種納米粒均較穩(wěn)定。

研究[11,14-15]表明，溫度、超聲、激光等因素均可引起液態(tài)氟碳納米粒的相變，因此，本研究從這幾個(gè)方面比較兩種納米粒的相變特性。熱致相變結(jié)果提示，IPNPs及IHNPs發(fā)生大量相變的溫度分別為47℃和75℃，相變后成為微米級(jí)微泡。液氣相變的溫度高于沸點(diǎn)溫度，與陳澄等[13,15]的研究結(jié)果一致，原因可能是由于內(nèi)部拉普拉斯壓力的影響而使相變溫度增高。光致相變結(jié)果顯示，激光致IPNPs及IHNPs發(fā)生大量相變的強(qiáng)度分別為160 mJ、10 s和400 mJ、10 s，停止激光激發(fā)，仍有大量納米粒相變，相變后的納米粒逐漸增大，部分發(fā)生膨脹爆裂，相變的原因可能是ICG吸收光能，轉(zhuǎn)化為熱能使納米粒迅速升溫所致。光致相變結(jié)果提示IPNPs納米粒相變所需能量較低，更易激發(fā)。LIFU時(shí)5 W輻照5 min可觀察到IPNPs發(fā)生相變，而輻照時(shí)間即使延長(zhǎng)至15 min，IHNPs仍不能相變，同樣提示IPNPs納米粒的易激發(fā)相變特性。體外光聲成像結(jié)果顯示二者在808 nm激光輻照下(20 Hz)均可發(fā)生大量相變，增強(qiáng)超聲造影信號(hào)及光聲信號(hào)，但I(xiàn)HNPs信號(hào)增強(qiáng)的激發(fā)時(shí)間明顯長(zhǎng)于IPNPs，同時(shí)，在相同激發(fā)條件下，IPNPs增強(qiáng)光聲及超聲成像的能力高于IHNPs。此外，本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)和光鏡觀察測(cè)定了光致IPNPs相變 (160 mJ， 10 s)及IHNPs相變(400 mJ， 10 s)的激光能量對(duì)細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果提示，光致IPNPs相變能量無(wú)明顯的細(xì)胞損傷作用，而光致IHNPs相變能量能夠明顯抑制細(xì)胞活性，因此，IPNPs可能有更高的安全性。

綜上所述，包裹ICG及PFP或PFH的相變型多功能納米粒理化性質(zhì)無(wú)明顯差別，體外有較好的穩(wěn)定性，但I(xiàn)PNPs比IHNPs有更好的相變特性，具有更強(qiáng)的成像增強(qiáng)能力和更高的安全性。因此，IPNPs可能是一種更有前景的多功能診療一體化納米粒。

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國(guó)家自然科學(xué)基金(81572558、81372799)、重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(2015-139)。

唐琴(1991—)，女，四川成都人，在讀碩士。研究方向：多功能微泡/光動(dòng)力療法。E-mail: tangqin0212@sina.com

朱深銀，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，400016。E-mail： zhushenyin0486@sina.com

2016-05-31

2016-07-15

兩種相變型多功能納米粒的制備及體外特性比較

唐 琴1,2，3，朱深銀1*，常淑芳4，崔健毓1,2，田中華1，孫江川4，王志剛2，邱 峰1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400010)

目的 制備包裹吲哚菁綠(ICG)及不同相變材料[全氟正戊烷(PFP)或全氟己烷(PFH)]的兩種相變型多功能納米粒，比較其理化性質(zhì)、穩(wěn)定性及體外相變特性。方法 采用改良的雙乳化法制備包裹ICG及液態(tài)PFP或PFH的乳酸-羥基乙酸(PLGA)納米粒(分別稱為IPNPs、IHNPs)，比較兩者的一般特性、穩(wěn)定性及熱致相變、光致相變、聲致相變和光聲成像能力，采用MTT法檢測(cè)光致相變所需能量的細(xì)胞毒性。結(jié)果 IPNPs及IHNPs粒徑分別為(490.53±36.96)nm及(512.23±38.52)nm，電位分別為(-14.40±1.40)mV及(-13.97±1.61)mV，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；二者形態(tài)、吸收光譜也均無(wú)明顯差異，于37℃儲(chǔ)存24 h均較穩(wěn)定；IPNPs熱致相變、光致相變及聲致相變所需能量均低于IHNPs，且IPNPs光聲及超聲成像增強(qiáng)能力高于IHNPs。經(jīng)能使IPNPs及IHNPs發(fā)生相變的激光能量輻照后，MH7A細(xì)胞存活率分別為(95.34±7.96)%，(54.92±6.11)%,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IPNPs是更適于診療一體化應(yīng)用的多功能納米粒。

多功能納米粒；氟碳化合物；相變；成像

R445.2

A

1672-8475(2016)10-0636-06

10.13929/j.1672-8475.2016.10.013