利用PCR技術(shù)鑒定異性孿生母牛留用價值

姬琳堡，楊永在，王長水，何 陽，梁藝洵，張興隆，曹兵海

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193）

利用PCR技術(shù)鑒定異性孿生母牛留用價值

姬琳堡，楊永在，王長水，何 陽，梁藝洵，張興隆，曹兵海

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193）

為鑒定異性孿生母牛是否具有留用價值，選取12頭異性孿生荷斯坦母牛，根據(jù)異性孿生不育母牛性染色體是嵌合體XX/XY，而正常母牛性染色體為XX，通過PCR技術(shù)擴增特異性存在于Y染色體上的SRY基因來確定異性孿生母牛是否具有留用價值。如果檢測出SRY基因則判定異性孿生母牛不育，不具有留用價值；如果未檢測出SRY基因，則判定異性孿生母牛具有留用價值。該方法快速準(zhǔn)確，便于早期決定異性孿生母牛的去留。

PCR技術(shù)；異性孿生母牛；性染色體嵌合體

近年來，隨著同期發(fā)情、超數(shù)排卵和人工授精等技術(shù)的大量使用，奶牛雙胎率從1983年的1.4%升高到1993年的2.4%［1］，目前中國荷斯坦奶牛的雙胎率3%～4%，特別是多胎次高產(chǎn)奶牛的雙胎率達5%以上［2］。按照概率計算，50%的雙胎是異性孿生，而95%以上的異性孿生母犢不孕。奶牛是價值較大的家畜，由于生長周期長，無繁殖力的母牛在經(jīng)濟上會帶來較大損失。如果將異性孿生母牛全部淘汰同樣會面臨經(jīng)濟上不必要的損失。因此，雙胎對生產(chǎn)的影響逐漸引起人們的重視，及時有效地鑒別出異性孿生不孕母牛是否具有留用價值也有利于降低生產(chǎn)成本。

鑒定異性孿生不育母牛的方法很多，主要是外部觀察法、探棒法以及分子學(xué)早期診斷方法。外部觀察法只適用于成年母牛，在犢牛時期很難看出異性孿生母牛與正常母牛的區(qū)別［3］。探棒法即制作一根標(biāo)有刻度的木棒，從犢牛陰道探入，通過探入長度來鑒定是否先天生殖器官發(fā)育不全［4］。分子學(xué)方法包括細胞遺傳學(xué)鑒定、H-Y抗原法、X染色體相關(guān)酶法、Y染色體特異DNA探針雜交法及PCR法。其中PCR技術(shù)具備準(zhǔn)確高效的特性，操作簡單，易于應(yīng)用［5］。

1990年人們克隆到Y(jié)染色體短臂上的性別決定區(qū)基因SRY，它是單拷貝基因，具有性別決定基因的性質(zhì)，是目前性別決定的最佳候選基因，該基因在哺乳動物中是高度保守的［6］。目前在畜禽性別控制研究領(lǐng)域，如胚胎性別早期鑒定、精子分離等方面人們主要利用SRY基因來確定研究對象的性別［7］。

異性孿生不育或自由馬丁是牛最常見的間性嵌合體形式［8］。異性雙胎的胎盤血管連接導(dǎo)致XX/XY間性嵌合體的發(fā)生，雌性生殖道發(fā)育異常，從而引發(fā)雌性不育［9］。本研究基于異性孿生不育母牛為性染色體嵌合體XX/XY，而正常母牛性染色體為XX，利用PCR技術(shù)鑒定異性孿生不育母牛是否有必要留養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品的采集

待鑒定動物為出生日齡相差不超過1周的異性孿生荷斯坦母牛。在2月齡時，采用頸靜脈采血方式，采集12頭待鑒定異性孿生不孕母牛的全血，并以相同方式采集3頭正常荷斯坦公牛和3頭正常荷斯坦母牛的全血。實驗共18個樣品，每個樣品10 mL，肝素鈉抗凝，-20℃保存。

1.2 DNA的提取

選用天根生化科技（北京）有限公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。具體提取步驟如下：

（1）將200μL血液樣品加入離心管中，再加入600μL紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5 min，期間再顛倒混勻幾次。10 000 r/min離心1 min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200 μL緩沖液GA，震蕩至徹底混勻。

（2）加入20 μLProteinase K溶液，混勻。

（3）加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃水浴至溶液變清亮。

（4）加入200 μL無水乙醇，充分震蕩混勻15 s。

（5）將所得溶液和沉淀都加入一個吸附柱CB3中，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（8）重復(fù)上一步。

（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。室溫放置數(shù)分鐘，晾干殘余漂洗液。

（10）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置3 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

1.3 目的基因的篩選

根據(jù)自由馬丁效應(yīng)的機理，異性孿生母牛不孕是因為性染色體是嵌合體XX/XY。正常母牛性染色體是XX。因此找到一個位于Y染色體上的基因，即可證明待測母牛是否是異性孿生不育母牛。SRY基因是特異性位于Y染色體上的基因，如果檢測出SRY基因則判定待測母牛不孕，如果未檢測出SRY基因則判定為待測母?？稍小?/p>

（1）從美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)找到牛的SRY基因組序列，并利用Primer Premier 6.0軟件根據(jù)引物設(shè)計規(guī)則，設(shè)計引物如下：F 5'-AGAGTATTGAACG ACGATGT-3'；R 5'-TGTGAGTATGTGGTCTTGG-3'；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

（2）檢測引物特異性，確定最佳退火溫度為57.7℃。

1.4 PCR擴增

PCR反應(yīng)在BIO-RADS1000型PCR儀上進行。

反應(yīng)體系共20 μL，其組成為：2 μL上游引物，2 μL下游引物，10 μLTaq酶，2 μLDNA模板，4 μLdd H2O。

循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，57.7℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共34個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳

取3 μLPCR擴增產(chǎn)物與2 μL Buffer混勻后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄。

1.6 PCR產(chǎn)物的序列測定

PCR產(chǎn)物序列由北京六合華大基因科技股份有限公司測定。

2 結(jié)果與分析

對18頭牛的SRY基因進行擴增，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，樣本1、5、8、11～13均沒有擴增產(chǎn)物。樣本2～4、6、7、9、10、14～17都擴增出了496 bp的片段。BLAST的結(jié)果表明，所擴增的片段與牛的SRY基因序列同源性為100%。說明本實驗擴增出的片段是牛的SRY基因片段。在所檢測的19個樣本中，1號為空白，樣本用ddH2O替代，沒有擴增出目的條帶。2、3、4號為陽性對照，是正常荷斯坦公牛，其性染色體為XY，所以擴增出SRY基因片段。11、12、13號為陰性對照，是正常荷斯坦母牛，其性染色體為XX，不存在Y染色體，所以沒有擴增出目的條帶。5～10、14～19為待測樣本，其中，樣本5、8、18沒有擴增出SRY基因片段。其余9頭待測母牛6、7、9、10、14～17、19均擴增出目的條帶。判定為XX/XY性染色體嵌合體母牛，不具備生育能力。

3 討論

異性雙生無繁殖力母牛的最佳鑒定時期是在性成熟以后，成年母牛時期，異性孿生不育母牛表現(xiàn)出與正常母牛不一樣的外部特征，因此通過外部特征也可以從側(cè)面印證實驗結(jié)果。曹德祥等［3］在異性雙生無繁殖力荷斯坦母牛的鑒定中提到，異性孿生不育母牛的特征包括：泌乳器官發(fā)育不正常，乳房組織沒有增生發(fā)育，乳頭非常小且緊貼腹壁。外生殖組織發(fā)育異常，異性孿生母牛陰蒂處多毛，且比正常母牛大，而且明顯外翻。為進一步驗證PCR技術(shù)的鑒定結(jié)果，在母牛成長過程中持續(xù)關(guān)注其外部特征，至14月齡時采集異性孿生母牛的圖片如圖2～4。

圖2 性染色體嵌合體母牛外陰發(fā)育情況

圖3 性染色體嵌合體母牛乳腺發(fā)育情況

圖4 未檢出SRY基因的母牛乳腺發(fā)育情況

無論是否檢測為性染色體嵌合體的異性孿生母牛，在14月齡時的乳腺發(fā)育情況都不及正常單胎荷斯坦母牛。如圖3～4所示，未被檢測出SRY基因的異性孿生母牛與被檢測為性染色體嵌合體的異性孿生母牛乳腺發(fā)育情況相比有明顯區(qū)別。3頭未檢測出SRY基因的母牛乳腺發(fā)育如圖4，更接近于正常母牛的發(fā)育特征。而被檢測為性染色體嵌合體的9頭母牛如圖3，符合乳頭小，且緊貼腹壁的特征。

通過持續(xù)觀察，3頭未檢測出SRY基因的異性孿生母牛均有發(fā)情表現(xiàn)，經(jīng)自然交配后，請獸醫(yī)進行直腸檢查，結(jié)果顯示，3頭母牛中有2頭已經(jīng)懷孕，目前已經(jīng)有1頭母牛于24月齡產(chǎn)下1頭公犢。郭彬等［10］報道，在33頭異性孿生母牛中留養(yǎng)的6頭異性孿生母牛經(jīng)驗證可以懷孕并產(chǎn)犢。該結(jié)果表明，經(jīng)適當(dāng)方法驗證后留用的異性孿生母牛確實可以懷孕并產(chǎn)犢，與本研究結(jié)果一致。在被檢測為性染色體嵌合體的9頭異性孿生母牛中，3頭有發(fā)情表現(xiàn)，經(jīng)直腸檢查，普遍存在生殖道發(fā)育不全，與傅春泉等［11］的實驗結(jié)果相符，且9頭異性孿生母牛均未懷孕。

外部觀察及直腸檢查的結(jié)果均與早期利用PCR技術(shù)鑒定異性孿生母牛是否可以留用的結(jié)果相符。臨床檢查、核型分析、血型鑒定、熒光原位雜交等方法都曾被用于異性孿生母牛的鑒定［12］，這些方法有的準(zhǔn)確性不高，有的需要長時間的高投入，有的需要公牛和母牛的樣品都具備才可以檢驗，因此這些方法的實用性不強。PCR方法快速準(zhǔn)確、簡單實用，適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。早期決定異性孿生母牛的去留可以有效避免不必要的經(jīng)濟損失，因此具有很高的應(yīng)用價值。

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［4］ 祁生旺，呼日查畢力格，田志，等.探棒法診斷奶牛犢先天性生殖器官發(fā)育不全［J］.中國獸醫(yī)雜志，2008（4）：74.

［5］ 張傳生，杜立新.哺乳動物性別決定機理及性別鑒定方法研究進展［J］.黃牛雜志，2001，27（3）：38-42.

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Identification on the Retained Value of Heterosexual Twin Heifers by PCR Technology

Ji Linbao，YangYongzai，CaoBinghai，et al
（State KeyLaboratoryofAnimal Nutrition，College ofAnimal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing100193，China）

In order toidentifythe retained value ofheterosexual twin heifer，SRY gene in the Ychromosome oftwelve heterosexual twin Holstein heifers were determined by PCR Technology.The heterosexual twin heifer with SRY gene is infertile，while the heterosexualtwin heifer without SRY gene is fertile.The results showed that this method was rapid，accurate and helpful.

PCRtechnology；heterosexualtwinheifer；sexchromosomechimerism

S823.2

A

2095-3887（2016）03-0014-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.004

2016-02-29

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-38）；南方地區(qū)草食家畜育肥與高品質(zhì)肉生產(chǎn)技術(shù)研究項目（201303144）

姬琳堡（1992-），女，碩士研究生。

曹兵海（1963-），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛營養(yǎng)與肉品質(zhì)研究。