懷府胎菊等五種中草藥不同組合體外抑菌效果比較

王玉姣，劉冰璇，董佳琦，金三俊，刁新平*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；

3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

懷府胎菊等五種中草藥不同組合體外抑菌效果比較

王玉姣1，劉冰璇2，董佳琦3，金三俊3，刁新平3*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；

3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

中草藥抗菌譜廣，毒副作用小，無殘留，可以聯(lián)合使用，選取懷府胎菊、紫花地丁、黃柏、甘草、蘆根5種中藥兩兩不同組合進行抑菌實驗。每種中草藥設(shè)置Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5組進行重復(fù)試驗，取其平均值，進行抑菌效果的分析。結(jié)果表明，在單味藥試驗中甘草對大腸桿菌活性的抑制效果最佳，黃柏次之；在兩兩不同組合中甘草+黃柏的抑菌圈直徑為12.86 mm，蘆根+甘草的抑菌圈直徑為12.42 mm，蘆根+黃柏11.8 mm，甘草+黃柏、蘆根+甘草和蘆根+黃柏對大腸桿菌的抑菌效果最佳，菊花+甘草、菊花+黃柏、地丁+甘草和地丁+黃柏對大腸桿菌的抑制效果次之，而菊花+地丁、菊花+蘆根和地丁+蘆根對大腸桿菌的抑制效果最弱。

中草藥；大腸桿菌；藥敏試驗；抑菌

近些年來，隨著大氣污染、水污染等環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，在各養(yǎng)殖場中因為養(yǎng)殖環(huán)境差等原因，造成家畜、家禽的健康出現(xiàn)了各種問題，因此在飼料中添加超劑量的抗生素藥物的現(xiàn)象非常普遍。抗菌藥物的濫用使細菌產(chǎn)生了耐藥菌株，在動物體內(nèi)及其產(chǎn)品中會有不等量的藥物殘留。隨著這種現(xiàn)象的日益發(fā)展，不僅動物體會受到影響，人類的健康也得不到保證。經(jīng)常攝入低劑量的抗生素殘留物，會在體內(nèi)逐漸累積，導(dǎo)致各種器官發(fā)生病變?？股氐臍埩粑飳θ梭w的影響主要表現(xiàn)在會發(fā)生過敏反應(yīng)、免疫抑制、致畸、致癌、致突變等作用[1-2]。要尋找一個更為健康有效的抗菌途徑，尋找減少藥物殘留和對動物體和人體危害較小的藥物成為當(dāng)今研究的熱點[3]。

中草藥作為中華民族的傳統(tǒng)文化遺產(chǎn)，在我國應(yīng)用于人畜疾病的防治已有幾千年的歷史，與中華民族的文明一樣悠久。中草藥取藥天然，起效方式全面，抗菌譜廣，毒副作用小，基本無殘留，可以聯(lián)合使用，因此中草藥越來越受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注[4]。采用中草藥能對抗多種病原微生物毒素，還能阻止毒素對機體的損害作用，對于一些已對抗生素產(chǎn)生耐藥性的細菌，中草藥對其仍然有良好的效果[5-6]。

中草藥作為飼料添加劑添加到飼料中具有無抗藥性、天然、資源豐富、減少藥物殘留和多種生物活性等優(yōu)點，在促進動物體生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率、增強機體免疫力、抗菌驅(qū)蟲、提高生產(chǎn)性能和繁殖力、減少動物的應(yīng)激反應(yīng)、改善動物性產(chǎn)品品質(zhì)等方面起到良好作用[3]。目前在飼料添加劑中廣泛使用化學(xué)合成藥物、抗生素等來預(yù)防動物腹瀉，促進動物生長，但是在飼料添加劑中長期使用抗生素會使各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，使治療效果下降。因此，在國內(nèi)外對中草藥的研究和開發(fā)越來越受到社會各界的關(guān)注。

1 中草藥的功能及其對大腸桿菌抑制作用

1.1 中草藥的功能

1.1.1 防治疾病

在西醫(yī)中，在諸多病毒性傳染病的治療過程中，都沒有較好的方法。疫苗似乎是個有效的預(yù)防途徑，但在實際生產(chǎn)過程當(dāng)中，疫苗在使用過程中可能會引起個別個體的過敏現(xiàn)象。中草藥防治疾病的基本作用就在于祛除病邪，消除病因，扶本固正，恢復(fù)和重建臟腑經(jīng)絡(luò)功能的協(xié)調(diào)，糾正陰陽不協(xié)調(diào)的病理現(xiàn)象，使機體在最大程度上能達到陰陽平衡的正常狀態(tài)[7]。

1.1.2 增強機體的免疫力

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，中草藥的成分復(fù)雜多樣，這些成分在動物體內(nèi)能夠全面調(diào)整和充分發(fā)揮動物體自身的免疫功能和適應(yīng)力。中藥中的多糖能激活機體的免疫細胞，能影響機體的補體系統(tǒng)，誘導(dǎo)細胞因子的產(chǎn)生[8]。試驗表明，板藍根多糖可使正常小鼠脾臟的重量增加，并可使被氫化可的松影響導(dǎo)致質(zhì)量變小的小鼠脾臟恢復(fù)到正常水平[9]。

1.2 大腸桿菌

1.2.1 大腸桿菌的流行病學(xué)

大腸桿菌病是由大腸桿菌埃氏菌的某些致病性血清型菌株引起的疾病總稱。病原性大腸桿菌的許多血清型都能引起家畜和家禽發(fā)病。大腸桿菌病一年四季都可以發(fā)生，以幼齡畜、禽最易感染。犢牛和羔羊多發(fā)生在冬天、春天舍飼期間。大型集約化養(yǎng)殖廠畜（禽）養(yǎng)殖密度過大、換氣通風(fēng)不良、飼養(yǎng)用具和環(huán)境消毒不徹底是加快本病流行的原因。

1.2.2 大腸桿菌對動物體的危害

仔豬發(fā)生黃痢時候，潛伏期較短，出生后12 h以內(nèi)即可發(fā)病，會波及一窩仔豬的90%，死亡率很高[10]。體溫正常、突然發(fā)生脫水、水腫、消瘦。發(fā)生白痢時，整窩仔豬的發(fā)病率會達到80%，但死亡率比較低，能自然康復(fù)。

1.2.3 中草藥在大腸桿菌防治中的意義

近年來，由于在養(yǎng)殖場中抗生素等化學(xué)藥物的濫用，致病性大腸桿菌對于土霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，而且這種耐藥性的比率有逐年升高的趨勢[4]。中草藥是中華民族的傳統(tǒng)文化遺產(chǎn)，在我國用于人畜疾病的預(yù)防和治療已有幾千年的歷史。中草藥具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、可以聯(lián)合使用等優(yōu)點。

本試驗選取焦作懷府胎菊、黃柏、紫花地丁、蘆根和甘草來對大腸桿菌進行體外抑菌實驗。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 中草藥

本次試驗使用的中藥為焦作懷府胎菊、黃柏、紫花地丁、甘草、蘆根。懷府胎菊購自焦作市武陟縣焦作懷盛懷藥保健品有限公司，生產(chǎn)批號20140516；蘆根，由安徽省亳州市永剛飲片廠有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號140821；黃柏、甘草、紫花地丁購于洛陽市張仲景大藥房。

2.1.2 試驗試劑

普通營養(yǎng)瓊脂，由北京奧博星生物技術(shù)公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20130208、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、緩沖液、蒸餾水。

2.1.3 試驗用具

三角瓶、燒杯、玻璃棒、培養(yǎng)皿、試管、電爐（電磁爐）、濾紙片、鑷子、電熱恒溫兩用培養(yǎng)箱、超凈工作臺（SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺）、無菌紗布、天平、直尺、火柴、酒精燈、打孔器、消毒棉簽、接種環(huán)、砂鍋、無菌注射器、pH試紙、大腸桿菌（大腸桿菌由河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院微生物試驗室提供）。

2.2 試驗方法

2.2.1 大腸桿菌的復(fù)蘇與培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基的制備：用電子天平分別稱取牛肉膏1 g，蛋白胨3.3 g，氯化鈉1.7 g，倒入燒杯中，用量筒量取蒸餾水333 mL倒入燒杯中，在電爐上邊加熱邊攪拌（燒杯下放置石棉網(wǎng)），使其完全溶解，形成透明溶液，待其冷卻后，調(diào)節(jié)pH，使其pH為7.2～7.4，倒入錐形瓶中，加塞子，在高壓滅菌鍋中121℃滅菌15 min，取出備用。

2.2.2 藥敏片的制備和培養(yǎng)基的制備

藥敏片的制備：取濾紙用7 mm打孔器進行打孔制備藥敏片。將藥敏片裝入清潔的青霉素瓶中，高壓滅菌鍋121℃滅菌15 min備用。

培養(yǎng)基的配制：按照營養(yǎng)瓊脂的說明，每33 g普通營養(yǎng)瓊脂粉加1 000 mL蒸餾水，按照1:1.3的比例，要稱取奧博星普通營養(yǎng)瓊脂42.9 g，加蒸餾水1 300 mL。

2.2.3 中藥的熬制

用傳統(tǒng)煎煮方法進行中藥熬制。用電子天平分別稱取懷府胎菊、紫花地丁、甘草、蘆根、黃柏各30 g，用清水洗去泥沙，放入燒杯中分別加200 mL蒸餾水，浸泡30min后，分別加入不同的砂鍋中，加蒸餾水100 mL煎煮，在電爐上加熱至沸騰后小火維持30 min，用四層紗布過濾倒入小燒杯中，將過濾過的藥渣再加蒸餾水約100 mL，按先前的方法進行熬制過濾，將兩次濾液合并，高溫濃縮至30 mL（即為1 mL藥液中含有1 g生藥），用瓶子分裝好后高壓滅菌15 min，放入4℃冰箱備用[4]。

2.2.4 藥敏實驗

本試驗采用平板紙片瓊脂擴散法（抗菌藥物紙片瓊脂擴散法敏感試驗）。

5種單味中草藥對大腸桿菌的抑菌實驗：將滅過菌的濾紙片（直徑為7 mm）在懷府胎菊、紫花地丁、黃柏、甘草、蘆根單味水煎劑中浸泡5min，每味藥物水煎劑中的藥敏片不少于5片，自然瀝干，貼在瓊脂平板表面，蓋嚴(yán)培養(yǎng)皿，此操作均在酒精燈火焰附近進行，防止培養(yǎng)基被其他菌污染。每個平板上均勻地放置5個藥敏片，保持相鄰兩孔的距離≥2 cm，分別做好標(biāo)記。每種藥物做Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5個對照。放入培養(yǎng)箱中34℃培養(yǎng)14～24 h后取出，用直尺測量各紙片周圍無菌圈直徑，算其平均值。

5種中藥兩兩不同組合對大腸桿菌的抑菌試驗：5種中藥水煎劑體積1∶1兩兩混合，即得到A組懷府胎菊+紫花地丁、B組懷府胎菊+甘草、C組懷府胎菊+蘆根、D組懷府胎菊+黃柏、E組紫花地丁+甘草、F組紫花地丁+蘆根、G組紫花地丁+黃柏、H組甘草+蘆根、I組甘草+黃柏、J組蘆根+甘草這十種不同組合，放至于不同滅過菌的燒杯中，與上述方法相同，進行藥敏實驗，測量抑菌圈直徑，算其平均值。抑菌圈直徑≤10 mm抑制強度為弱，抑菌圈直徑界于10～11 mm抑制強度為中，抑菌圈直徑≥12 mm抑制強度為強。

3 試驗結(jié)果

3.1 5種單味中藥對大腸桿菌活性的影響

3.1.1 觀察藥敏片周圍細菌的生長情況

在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿上大腸桿菌的生長情況，在培養(yǎng)基表面沒有放藥敏片及離藥敏片較遠的地方可以看到，均勻地布滿了圓形凸起、表面光滑、邊緣整齊、半透明、近似灰白色的菌落。全部的藥敏片周圍都出現(xiàn)了大小不等的邊界較為清晰的抑菌圈。

3.1.2 測量并記錄藥敏片周圍無菌圈直徑的大小

全部的藥敏片周圍都出現(xiàn)了大小不等的邊界較為清晰的抑菌圈，測量抑菌圈直徑，求其平均值得到甘草和黃柏的抑菌圈較大，依次為10.42 mm和10.16 mm，而另外3種中草藥的抑菌圈相對較小，蘆根的抑菌圈大小為9.18 mm，菊花的抑菌圈大小為8.14 mm，紫花地丁的抑菌圈大小為7.38 mm。由以上試驗數(shù)據(jù)可得到結(jié)論，5種單味中草藥的水煎劑對大腸桿菌都能產(chǎn)生不同程度的抑制作用，其對大腸桿菌的抑制強弱排序為：甘草＞黃柏＞蘆根＞菊花＞紫花地丁。甘草和黃柏對大腸桿菌的抑制效果較強，蘆根和菊花對大腸桿菌的抑制效果次之，紫花地丁對大腸桿菌的抑制效果最弱。

3.2 5種中藥的不同組合對大腸桿菌活性的影響3.2.1觀察藥敏片周圍細菌的生長情況

同樣在培養(yǎng)箱中34℃培養(yǎng)14 h后，取出培養(yǎng)皿，觀察培養(yǎng)皿上大腸桿菌的生長情況。

3.2.2 測量并記錄藥敏片周圍無菌圈直徑的大小

5種中草藥兩兩不同組合對大腸桿菌的敏感性測試見表1。

表1 5種中草藥兩兩不同組合對大腸桿菌的敏感性測試

由表1可知，這5種中草藥兩兩不同組合對大腸桿菌的敏感性試驗敏感程度不同，但相對于單味中藥對大腸桿菌的抑制效果來說，兩兩不同組合的中藥提取物對大腸桿菌的抑制效果都有不同程度的增加，其中，甘草+黃柏和甘草+蘆根組合的抑菌圈直徑增加最為明顯。5種中藥兩兩不同組合對大腸桿菌在體外活性的抑制效果順序為：甘草+黃柏＞蘆根+甘草＞蘆根+黃柏＞菊花+甘草＞菊花+黃柏＞地丁+甘草＞地丁+黃柏＞地丁+蘆根＞菊花+蘆根＞菊花+地丁。甘草+黃柏的抑菌圈直徑為12.86 mm，蘆根+甘草的抑菌圈直徑為12.42 mm，蘆根+黃柏的抑菌圈直徑為11.8 mm，甘草+黃柏、蘆根+甘草和蘆根+黃柏對大腸桿菌在體外的抑制效果較強；菊花+甘草的抑菌圈直徑為10.76 mm，菊花+黃柏的抑菌圈直徑為10.52 mm，地丁+甘草的抑菌圈直徑為10.44 mm，地丁+黃柏的抑菌圈直徑為10.1 mm，菊花+甘草、菊花+黃柏、地丁+甘草和地丁+黃柏對大腸桿菌在體外的抑制效果次之；地丁+蘆根的抑菌圈直徑為9.44 mm，菊花+蘆根的抑菌圈直徑為9.36 mm，菊花+地丁的抑菌圈直徑為8.5 mm，地丁+蘆根、菊花+蘆根和菊花+地丁對大腸桿菌在體外的抑制效果較弱。

4 分析與討論

本試驗中單味中草藥對大腸桿菌的抑制程度甘草最強，平均抑菌圈直徑為10.42 mm，黃柏次之，抑菌圈直徑為10.16 mm，表明甘草、黃柏在體外對大腸桿菌活性的抑制效果最好，菊花、蘆根的抑菌效果一般，而地丁無明顯抑菌效果。

這5種中草藥兩兩組合以后，藥液的抑菌作用都得到了一定程度的增強，其中甘草+黃柏和甘草+蘆根效果增加最為明顯。甘草+黃柏、蘆根+甘草和蘆根+黃柏對大腸桿菌在體外的抑制效果較強，菊花+甘草菊、花+黃柏、地丁+甘草和地丁+黃柏對大腸桿菌在體外的抑制效果次之，地丁+蘆根、菊花+蘆根和菊花+地丁對大腸桿菌在體外的抑制效果較弱，這些可能與各種中草藥的產(chǎn)地、成分和性能有關(guān)。

黃柏為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮。經(jīng)動物試驗表明，黃柏煎劑、水浸出液或乙醇浸出液對化膿性細菌的抑制作用較強，如綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌都有較強的抑制效果[11]。黃柏能增強白細胞的吞噬能力，提高機體的非特異性免疫力。臨床應(yīng)用方面最新報道，黃柏對治療口腔扁平苔蘚、流行性腦脊髓膜炎、痔瘡合并感染、燒燙傷、慢性咽炎等各類病癥或感染性疾病都具有良好的療效[12]。

紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁的干燥全草。紫花地丁對金黃色葡萄球菌、腐生菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、變形桿菌均有抑制作用，但對金黃色葡萄球菌和腐生菌的抑制作用較強。紫花地丁水提物對角叉菜膠致炎小鼠具有顯著的抗炎作用，其抗炎作用機制可能與降低角叉菜膠致炎小鼠血清TNF-α，IL-1β及炎性組織中PGE2含量的表達有關(guān)[13]。

蘆根為禾本科植物蘆葦?shù)母稍锔o。蘆根中的天門冬酰胺能有效地抑制癌細胞的生長、擴散并能使癌細胞生長正?；?。

杭白菊還未完全開放時采摘的菊花稱為胎菊，試驗所用的胎菊產(chǎn)自河南省焦作市武陟縣，武陟縣是懷慶府之中的一個縣，因此稱為懷府胎菊。相關(guān)資料表明，胎菊在體外對大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、變形菌以及綠膿桿菌和霍亂弧菌等細菌具有完全的抑制作用，對人體的結(jié)核桿菌可產(chǎn)生抑制效果，菊花對中樞神經(jīng)也有抑制作用。

甘草性平，味甘，氣微。歸心、肺、脾、胃經(jīng)。甘草的化學(xué)組成較為復(fù)雜，目前為止從甘草中分離出的化合物有甘草甜素、甘草次酸、甘草苷、新甘草苷、甘草素、異甘草素等數(shù)10種化合物，但這些成分和數(shù)量通常會隨甘草的種類、種植區(qū)域、采收時間等因素的不同而不同[14]。大量的試驗研究表明，甘草甜素和黃酮類物質(zhì)是甘草中最重要的生理活性物質(zhì)，主要存在于甘草根表皮以內(nèi)的部分。

目前的許多試驗表明，很多中草藥具有抑菌殺菌作用，其作用的有效成分也較為多樣，其有效成分多為揮發(fā)油、有機酸、生物堿、萜類、黃酮、醌類、多糖類等[15]。

試驗結(jié)果表明，單味中草藥中黃柏和蘆根對大腸桿菌的抑制效果最強。不同中藥的兩兩組合中黃柏+蘆根、黃柏+蘆根和蘆根+甘草的抑菌效果較為明顯，菊花+甘草、菊花+黃柏、地丁+甘草和地丁+黃柏對大腸桿菌的抑制效果一般，而菊花+地丁、菊花+蘆根和地丁+蘆根對大腸桿菌的抑制性較弱。中草藥兩兩不同組合的藥性增加可能與中藥中活性物質(zhì)的互相協(xié)同有關(guān)。

5 結(jié)論

懷府胎菊、紫花地丁、甘草、蘆根和黃柏這5種中草藥的水煎劑對大腸桿菌有一定的抑制效果，這5種中草藥兩兩組合后，對大腸桿菌的抑制效果有一定的增強，其中黃柏+蘆根、黃柏+甘草和蘆根+甘草的抑菌效果最為明顯。

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Comparison of Antibacterial Effect of Five Kinds of Different Combinations of Chinese Herbal Medicinein Vitro

WANG Yujiao1,LIU Bingxuan2,DONG Jiaqi3,JIN Sanjun3,DIAO Xin ping3*

（1.College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;
2.College of Resources and Environment,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;
3.College of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

Traditional Chinese medicine,with the feature of natural,comprehensive,widely antimicrobial spec?trum,little side effect and no residue.They could be used in combination,choosing the Huai Fu fetal chrysanthemum, Herba Violae,Corktree bark,liquorice,Rhizoma Phragmitis five kinds of traditional Chinese medicine pairwise differ?ent combinations and tested the bacteriostasis experiment.Using paper disc agar diffusion method,sensitivity tests were performed on the Escherichia coli and traditional Chinese medicine used the traditional decocting method,the first antimicrobial tests of single flavor Chinese herbal medicine.Each herb was setⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴrepeated experi?ments were carried out,and their average values were taken,the antibacterial effect was analyzed.The results showed that in the test of single herbs liquorice inhibitory effects on the activity of Escherichia coli best was Cortex Phelloden?dri.In pairwise combinations of different Glycyrrhiza+Cortex Phellodendri bacteriostatic circle diameter was 12.86 mm.The inhibition zone diameter of reed rhizome and licorice was 12.42 mm,reed rhizome and Cortex Phellodendri was 11.8 mm,antibacterial effect of licorice root and phellodendron bark,reed rhizome and licorice root and Rhizoma Phragmitis and Cortex Phellodendri on Escherichia coli was the best,chrysan?themum and liquorice,chrysanthemum and Cortex Phellodendri,Viola yedoensis+licorice and Viola ye?doensis and Cortex Phellodendri inhibitory effect on Escherichia coli was better,chrysanthemum+violet, chrysanthemum+Rhizoma Phragmitis and violet+Phragmites on Escherichia coli inhibitory effect was the weakest.

Traditional Chinese medicine(TCM);E.coil,drug sensitivity test;antibacterial

R286；R285.6

A

1001-0084（2016）10-0026-06

2016-09-14

黑龍江省科技廳對外合作攻關(guān)項目（WB13B101）

王玉姣（1990-），女，河南?？h人，碩士研究生，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)微生物與免疫。

*通訊作者：副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail:diaoxp63@163.com。