極性攪拌磁子萃取-GC/MS分析主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分

李晶，耿永勤，徐濟(jì)倉，陳建華，繆恩銘，魏玉玲，李雪梅

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，安全評價(jià)部，云南省昆明市高新區(qū)科醫(yī)路41號云南煙草科學(xué)研究院 650106

極性攪拌磁子萃取-GC/MS分析主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分

李晶，耿永勤，徐濟(jì)倉，陳建華，繆恩銘，魏玉玲，李雪梅

云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，安全評價(jià)部，云南省昆明市高新區(qū)科醫(yī)路41號云南煙草科學(xué)研究院 650106

建立了極性攪拌磁子吸附萃取-熱脫附（TD）-GC-MS法，分析了主流煙氣被口腔模擬吸收液吸收的極性成分。優(yōu)化后的試驗(yàn)條件為：極性攪拌磁子轉(zhuǎn)速800 rpm，萃取時間60 min，萃取后的攪拌磁子在220℃的溫度下熱脫附3 min，并用-50℃的冷阱進(jìn)行收集進(jìn)樣，利用氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行多種成分全掃分析。在優(yōu)化條件下，該方法具有較好的重復(fù)性（RSD<12%）。該方法靈敏度高，操作方便，適用于研究煙氣成分對消費(fèi)者味覺感受的影響。

攪拌磁子吸附萃?。粺崦摳?；氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)；主流煙氣；口腔模擬吸收

攪拌磁子吸附萃取(Stir bar sorptive extraction,SBSE)是一種新的固相微萃取前處理技術(shù)，由Baltussen等[1]在1999年首次提出，2000年Gerstel公司將其商品化，是一種無溶劑或少溶劑，集萃取、凈化、富集為一體的樣品前處理技術(shù)。SBSE具有固定相體積大，萃取容量高，無需外加攪拌部件的優(yōu)點(diǎn)；SBSE可以在完成攪拌的同時吸附目標(biāo)物，還可消除其余雜質(zhì)的吸附競爭，樣品前處理方法方便、簡易[2-4]。目前，SBSE已經(jīng)在食品[5]、環(huán)境[6]和農(nóng)藥殘留[7]前處理中得到廣泛的應(yīng)用。最初的SBSE使用非極性的PDMS涂層，只能對非極性成分進(jìn)行萃取，對極性成分只能通過衍生化或者更換涂層性質(zhì)等繁瑣操作才能實(shí)現(xiàn)萃取，目前Gesterl公司實(shí)現(xiàn)了極性攪拌磁子的商品化（EG-SBSE），表面涂層為聚乙二醇，可以對酚類等極性成分進(jìn)行分析檢測，大大拓寬了攪拌吸附萃取技術(shù)的應(yīng)用范圍，目前暫未見在煙草化學(xué)分析中的應(yīng)用。

卷煙產(chǎn)品是一種依靠感官感受為主的產(chǎn)品[8-9]，卷煙消費(fèi)時，主流煙氣暴露于口腔中，與口腔黏膜短暫作用后，部分特征化學(xué)成分通過口腔黏膜進(jìn)行接觸、吸附、溶解、吸收、轉(zhuǎn)化，從而引起感官感受，這一部分化學(xué)成分是抽煙引起的感官生理反應(yīng)的核心與關(guān)鍵。這部分物質(zhì)多為極性成分。目前此類研究多集中在煙草化學(xué)成分[10-13]、煙氣化學(xué)成分[14-15]成分對感官抽吸品質(zhì)的影響，模擬吸收的技術(shù)、裝置以及吸收液分析方面的研究較少[16-17]。

本研究方法利用人工口腔模擬吸收液對主流煙氣進(jìn)行口腔模擬吸收，應(yīng)用SBSE技術(shù)萃取模擬吸收液中的極性成分，利用熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜（TDGCMS）進(jìn)行分析檢測，建立了基于SBSE- TDGCMS技術(shù)分析主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

（1）試劑。丙酸苯乙酯(純度≥99.5%，美國Supelco公司)；NaCl, KCl, NaOH, 無水CaCl2,NaH2PO4·H2O，Na2S，尿素均為分析純（購自西隴化工廠）； 實(shí)驗(yàn)用水均為超純水； 2種市售卷煙。

（2）儀器。Agilent 7890A 型氣相色譜儀，串聯(lián)具有電子轟擊離子源(EI源)的5975C質(zhì)譜檢測器(Agilent 公司)；色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 mm,0.25 μm); Gerstel TDS-2 熱脫附儀（德國，Gerstel公司）；Gerstel 極性攪拌磁子（0.5 mm×10 mm，EGSilicone-SBSE）；TC2老化器(德國，Gerstel公司)；熱脫附管（O.D. 6.0 mm，I.D. 4.5 mm，德國，Gerstel公司），IKA RH basic2磁力攪拌器（美國IKA公司）；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；AE200分析天平（瑞士 METTLER公司）；SK5200型超聲波振蕩器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；20 mL頂空進(jìn)樣瓶(美國Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 口腔模擬吸收液的配制

口腔模擬吸收液按照ISO/TR10271標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行配制，配制方法為：0.4 g/L NaCl，0.4 g/L KCl, CaCl2·H2O 0.795 g/L, Na2S·2H2O 0.005 g/L,NaH2PO4·H2O 0.78 g/L, 尿素 1 g/L，溶液利用蒸餾水配制，最后利用NaOH將口腔模擬吸收液pH值調(diào)至6.8±0.5。

1.2.2 口腔模擬吸收液對主流煙氣的吸收

模擬吸收過程主要模擬消費(fèi)者在抽吸卷煙過程中，煙氣進(jìn)入口腔，而后擴(kuò)散、吸附或者吸收后，再被排出的循環(huán)過程。根據(jù)GB/T16447-2004的條件[19]，對待測卷煙進(jìn)行平衡，平衡48 h的煙支按照標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件進(jìn)行抽吸[20]。主流煙氣吸收主要按照圖1所示進(jìn)行吸收。

圖1 口腔模擬吸收液對主流煙氣的吸收Fig.1 Trap of mainstream smoke by a dental simulator

實(shí)驗(yàn)操作如下：在主流煙氣模擬吸收瓶中放入經(jīng)口腔模擬吸收液浸泡后的口腔仿生黏膜（實(shí)驗(yàn)室自制,長12.5 cm，寬8.0 cm），用于模擬人體口腔內(nèi)部黏膜對主流煙氣的吸收。抽吸前，連接吸收裝置和吸煙機(jī)，檢查氣密性并對抽吸容量等抽吸參數(shù)進(jìn)行校正；抽吸煙支時，主流煙氣進(jìn)入吸收瓶，保持5 s停駐時間，之后經(jīng)煙氣排出口排出， 然后繼續(xù)進(jìn)行下一次抽吸動作，直至煙支抽吸完成。每次實(shí)驗(yàn)抽吸5支煙，之后將口腔仿生黏膜取出，并利用口腔模擬吸收液對吸收瓶進(jìn)行多次潤洗，最后將黏膜和吸收瓶潤洗液合并，利用超聲波儀對口腔仿生黏膜進(jìn)行超聲萃取20 min，收集萃取液并定容至20 mL，以備后續(xù)分析用。

1.2.3 攪拌磁子吸附萃取

攪拌磁子使用前需要進(jìn)行老化處理，以保證每個樣品的平行結(jié)果，老化處理操作如下：將放有攪拌磁子的熱脫附管放入老化器中，在惰性氣體（高純氮?dú)猓┑谋Ｗo(hù)下，加熱到220℃,老化45 min，之后冷卻備用。

取2 mL 1.2.2中收集的主流煙氣口腔模擬吸收液于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入10 μL 100 μg/L丙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)以及2 mL超純水；再放入1個老化后的攪拌磁子，并將頂空瓶進(jìn)行密封，于800 rpm轉(zhuǎn)速下攪拌萃取60 min；萃取完成后，利用鑷子取出攪拌磁子，并用少量超純水清洗攪拌磁子表面，最后利用無塵紙擦拭攪拌磁子，干燥，備用。

1.2.4 熱脫附-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

將1.2.3中萃取完成的攪拌磁子放入熱脫附儀的熱脫附管中，密閉儀器，進(jìn)行熱脫附-氣相色譜-質(zhì)譜分析。

熱脫附儀分析條件：初始溫度40℃，以1℃/s的速度進(jìn)行加熱，加熱至220℃后保持3 min；傳輸線溫度為300℃；冷阱溫度為-50℃，以12℃/s的速度升至280℃，保持5 min；采用溶劑排空模式進(jìn)樣。

氣相色譜-質(zhì)譜分析條件：色譜柱：Agilent DBWAX(0.25 mm×30 m, 0.25 μm；載氣：氦氣(He);流速：1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度40℃，保持5 min,以5℃/min升至150℃，以2℃/min升至180℃，以5℃/min速度升至230℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度：230℃，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源：EI；離子化能量：70 eV; 離子源溫度：230℃；全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為35-350(m/z)。

2 結(jié)果與討論

2.1 攪拌速度對主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分萃取效果的影響

攪拌磁子萃取主要通過溶液中的目標(biāo)物質(zhì)在磁子的攪拌下，在溶液中進(jìn)行擴(kuò)散，從而吸附到攪拌磁子上，因此攪拌速度的快慢會影響目標(biāo)物質(zhì)的擴(kuò)散，從而影響萃取的結(jié)果。如果攪拌速度較慢，物質(zhì)擴(kuò)散到攪拌磁子附近就較少，萃取效果不佳，而如果攪拌速度過快，目標(biāo)物質(zhì)剛擴(kuò)散到磁子附近就被帶走，沒有發(fā)生吸附作用，萃取結(jié)果依然不理想。因此本實(shí)驗(yàn)在室溫下，保持萃取時間為60 min不變，考察了600～1200 rpm不同轉(zhuǎn)速對于萃取效果的影響，考察以全掃模式下，匹配度大于70%的色譜峰的總峰面積為指標(biāo)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 萃取轉(zhuǎn)速對萃取效果的影響圖Fig.2 Effect of rotation rate on extraction efficiency

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著轉(zhuǎn)速增大萃取峰面積也逐漸增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速到達(dá)800 rpm時，萃取成分峰面積最大，而隨著轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大，萃取效果發(fā)生了明顯的下降。根據(jù)峰面積，最優(yōu)轉(zhuǎn)速為800 rpm。

2.2 萃取時間對主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分萃取效果的影響

攪拌磁子通過攪拌運(yùn)動，使溶液中的各個組分從溶液擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到攪拌磁子上，從而達(dá)到萃取富集的效果。由于在溶液中的擴(kuò)散和吸附等作用，萃取時間對于萃取效果的影響較為重要，時間過短目標(biāo)物質(zhì)不能盡可能多的被富集在攪拌磁子上，時間過長，攪拌磁子上的目標(biāo)物質(zhì)反而會重新回到溶液中，達(dá)不到萃取的效果，而且過長的實(shí)驗(yàn)時間不利于實(shí)驗(yàn)的順利開展。本實(shí)驗(yàn)在室溫下，保持萃取轉(zhuǎn)速為800 rpm不變，選擇30 min，60 min，90 min，120 min，180 min 5個不同萃取時間進(jìn)行考察，分析萃取時間對于萃取效果的影響。各個萃取時間下主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分的峰面積比較結(jié)果如圖3所示。

圖3 萃取時間對于萃取效果影響圖Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

由圖3中可以看出，隨著萃取時間增長，萃取峰面積有一個明顯的上升，但是萃取時間超過60 min后，萃取效率有所降低，盡管120 min和180 min由于萃取時間較長，萃取峰面積有了一個微弱的上升，但是基本差異不大，因此本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的萃取時間為60 min。

2.3 加鹽效應(yīng)對主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分萃取效果的影響

實(shí)驗(yàn)在室溫下，萃取時間為60 min，萃取轉(zhuǎn)速800 rpm等實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，考察了添加0%，2%，5%，10%的NaCl的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加NaCl并不能明顯提高萃取效率，因此本實(shí)驗(yàn)不考慮加鹽作用。

2.4 熱脫附條件對主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分分析結(jié)果的影響

所分析的目標(biāo)物質(zhì)萃取到攪拌磁子上后，通過熱脫附儀進(jìn)行脫附，脫附后的待測物質(zhì)被收集在冷阱中后，經(jīng)過統(tǒng)一加熱脫附，進(jìn)入氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測。因此熱脫附的條件對于目標(biāo)物質(zhì)的分析影響很大，也直接影響分析檢測的效果。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)的方法，考察熱脫附溫度，熱脫附時間和冷阱溫度3個因素對于分析結(jié)果的影響。每個因素選取3個考察水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表格見表1。考察對象以峰面積為優(yōu)選因子（匹配度大于70%的色譜峰的總峰面積為指標(biāo)）。

表1 熱脫附溫度、熱脫附時間和冷阱溫度對分析結(jié)果的影響Tab.1 Effect of desorption temperature, desorption time and cryofocusing temperature on analysis results

從表1中可以發(fā)現(xiàn)，對于實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果影響最大的為熱脫附溫度，其次為冷阱溫度，最后為熱脫附時間。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的熱脫附條件為：熱脫附溫度為220℃，脫附時間為3 min，冷阱溫度設(shè)置為-50℃。

為了考察熱脫附實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，對同一個樣品平行測定5次，以組分峰面積和的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，RSD<12%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.5 主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分分析結(jié)果

以某種市售卷煙作為樣品，按照1.2.2進(jìn)行煙氣的模擬吸收實(shí)驗(yàn)，采用優(yōu)化后的萃取條件和熱脫附條件進(jìn)行萃取和熱脫附，分析吸收液中的極性成分。圖4是某卷煙樣品的主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分的全掃分析色譜圖，表2為某卷煙樣品主流煙氣口腔模擬吸收液中的分析成分和相對含量匯總表。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬吸收液中的極性成分以酚類物質(zhì)為主，還包括部分溶劑以及煙堿。

圖4 某卷煙樣品的主流煙氣口腔模擬吸收液中極性成分的GC/MS全掃分析色譜圖Fig.4 Total ion current chromatogram of mainstream smoke polar compounds of a cigarette sample trapped by a dental simulator

傳統(tǒng)煙氣成分分析主要采用濾片捕集的方式，并通過非極性有機(jī)溶劑萃取后進(jìn)行分析，劍橋?yàn)V片捕集的各種揮發(fā)和半揮發(fā)性的香氣物[15,21]大部分為非極性物質(zhì)；本實(shí)驗(yàn)采用水相的吸收介質(zhì)，模擬卷煙抽吸者口腔黏膜對主流煙氣選擇性吸附的過程，只關(guān)注煙氣被口腔唾液吸附和溶解的部分，通過極性攪拌磁子對煙氣吸收液進(jìn)行選擇性吸附，被分析物主要集中在主流煙氣中的極性成分上。有文獻(xiàn)報(bào)道部分酚類對呼吸道具有強(qiáng)烈的刺激性[15,22]，可能對口感造成辣味，澀味或不干凈等不良影響，因此，該實(shí)驗(yàn)方法著重以煙氣吸收液中極性成分為研究對象，不僅可以作為傳統(tǒng)煙氣成分分析的補(bǔ)充，也可以為開展極性成分與卷煙抽吸品質(zhì)相關(guān)性研究作為參考。

表2 某卷煙主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分及其相對含量Tab.2 Mainstream smoke polar compounds of a cigarette trapped by a dental simulator and their relative contents

將2種市售卷煙抽吸后主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)不同的卷煙的部分極性成分的相對含量有所不同。表3列舉了2種市售卷煙煙氣模擬吸收液中幾種不同極性成分的對比結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)主流煙氣被口腔模擬吸收液吸收后，其溶解的極性化合物相對含量各有不同，表3中2種卷煙的煙堿含量相當(dāng)，但是卷煙2的苯酚、對甲苯酚、3-甲基-1H-吲哚含量比卷煙1高出較多，根據(jù)卷煙感官評價(jià)結(jié)果，卷煙1的口腔刺激性比卷煙2的小，這說明研究中的酚類物質(zhì)的含量與卷煙感官抽吸品質(zhì)具有一定的相關(guān)性?；诖搜芯拷Y(jié)果，結(jié)合極性成分相對含量與不同卷煙產(chǎn)品的類型，可以為研究煙氣成分對口腔刺激的作用提供一定的技術(shù)支持，也可協(xié)助煙氣特殊成分含量與卷煙抽吸味覺感官品質(zhì)影響研究。

表3 2種卷煙幾種極性成分相對含量和感官評價(jià)對比列表Tab.3 Comparison of the relative contents of some polar compounds and the sensory evaluations of 2 cigarettes

3 結(jié)論

建立了極性攪拌磁子吸附萃取-熱脫附（TD）-GC-MS法，用以分析主流煙氣被口腔模擬吸收液吸收的極性成分。在優(yōu)化條件下，該方法具有較好的重復(fù)性（RSD<12%），靈敏度高，操作方便，適用于研究煙氣成分對消費(fèi)者味覺感受的影響。研究共檢出有20種極性化學(xué)成分，研究發(fā)現(xiàn)部分極性成分（如：苯酚、對甲苯酚、3-甲基-1H-吲哚等）的相對含量與卷煙抽吸口腔刺激性有一定相關(guān)性。

該方法為探討煙氣成分與口腔感官反應(yīng)的相關(guān)性研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究方法，但相關(guān)物質(zhì)與感官的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究，以期尋找到確切引起口腔刺激反應(yīng)的關(guān)鍵煙氣成分。

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Analysis of polar components in mainstream smoke-absorbed simulated buccal cavity absorption solution using EG-SBSE extraction- gas chromatography-mass spectrometry

LI Jing, GENG Yongqin, XU Jicang, CHEN Jianhua, MIAO Enming, WEI Yuling, LI Xuemei
China Tobacco Yunnan Industrial Co., Ltd, Kunming 650106, China

A method using EG-SBSE (stir bar sorptive extraction)-thermal desorption coupled with gas chromatography-mass spectrometry was established for the analysis of polar components in mainstream smoke-absorbed simulated buccal cavity absorption solution. A stir bar was used for extraction of polar components at rotation speed-800 rpm for 60 min. Extracted analytes were prepared under a thermal desorption temperature-220℃ for 3 min, collected by a cryofocus at temperature of -50℃, then tested by gas chromatographymass spectrometry for full scan detection. Under optimized experimental conditions, the method showed a good repeatability (<12%, for 5 tests). This novel method including many advantages such as high sensitivity and convenience for operation and can be used for studying effect of smoke components in sensory research.

EG-SBSE (EG-stir bar sorptive extraction); thermal desorption; gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS);mainstream smoke; dental simulator

李晶，耿永勤，徐濟(jì)倉，等. 極性攪拌磁子萃取-GC/MS分析主流煙氣口腔模擬吸收液中的極性成分[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016,22（3）

云南中煙公司科研資助項(xiàng)目(No. 2016JC03)；云南中煙公司技術(shù)中心科研資助項(xiàng)目(No. JSZX2014JC09)

李 晶（1982—），博士，工程師，主要研究方向：主要從事煙草化學(xué)色譜、質(zhì)譜分析，Tel：0871-68319118，Email：lijing_1107@163.com

李雪梅（1972—）， Tel：0871-68316047，Email：xmlikm@126.com

2015-08-03

:LI Jing, GENG Yongqin, XU Jicang, et al. Analysis of polar components in mainstream smoke-absorbed simulated buccal cavity absorption solution using EG-SBSE extraction- gas chromatography-mass spectrometry [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(3)