大豆異黃酮對圍絕經(jīng)期綜合征動物模型性激素水平及病理變化的影響

黎桂玉，段雪琳，林基勇，彭　岳，趙鐵建（廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧　530001）

大豆異黃酮對圍絕經(jīng)期綜合征動物模型性激素水平及病理變化的影響

黎桂玉，段雪琳，林基勇，彭岳，趙鐵建
（廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧530001）

［目的］觀察大豆異黃酮對圍絕經(jīng)期綜合征動物模型的影響，并探討其作用機理，以期為臨床上圍絕經(jīng)期綜合征的治療提供實驗依據(jù)。［方法］選雌性SD大鼠50只隨機分為5組，每組10只，分別為正常組、假手術組、模型組、乙烯雌酚組、大豆異黃酮組，除正常組和假手術組外，其余三組均摘除卵巢造模，形成圍絕經(jīng)期大鼠模型后，分別予生理鹽水、乙烯雌酚、大豆異黃酮灌胃，正常組和假手術組分別予相同劑量生理鹽水和大豆異黃酮灌胃。各組分別連續(xù)灌胃給藥6周后，腹主動脈取血，分離血清，采用放射免疫分析法，測雌二醇（E2）、孕酮（P）、睪酮（T）水平。并分別摘取腦垂體、子宮、腎上腺組織，制備病理切片，用光鏡觀察實驗效應，采用免疫組化法觀察腦垂體中卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）水平。［結果］放射免疫分析結果顯示：大豆異黃酮組大鼠血清E2水平升高，與模型組比較有顯著性差異（P＜0．05），而對血清P、T水平影響不大。病理結果顯示：大豆異黃酮組子宮壁及子宮內膜增厚介于模型組和假手術組之間，表面上皮呈柱狀，腺體增多；大豆異黃酮組腦垂體中去勢細胞介于模型組和正常組之間；大豆異黃酮組腎上腺組織改變不明顯。免疫組化結果顯示：大豆異黃酮組腦垂體組織中的FSH和LH細胞水平低于模型組。［結論］大豆異黃酮能使圍絕經(jīng)期綜合征動物模型的子宮壁及內膜增厚，并具有提高其血清E2水平，但對血清P、T水平及腎上腺組織影響不大。

大豆異黃酮；圍絕經(jīng)期綜合征；雌二醇；孕酮；睪酮；卵泡刺激素；黃體生成素

圍絕經(jīng)期綜合征又稱更年期綜合征，是由于卵巢功能退行性改變、腦垂體功能亢進、雌激素水平低下等所致的一組植物神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂伴心理癥狀的癥候群［1］，嚴重影響了婦女圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期的健康問題和生活質量。本實驗旨在通過更年期大鼠模型，觀察大豆異黃酮對更年期大鼠血清中雌二醇（E2）、孕酮（P）、睪酮（T）水平的影響，對卵巢、腎上腺組織及腦垂體組織中卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）的作用，從而探討大豆異黃酮對大鼠更年期綜合征的作用機理，為臨床上更年期綜合征的治療提供實驗依據(jù)。

1　實驗材料

1．1實驗藥品及試劑大豆異黃酮，由陜西方晟生物科技有限公司提供，純度90%；乙烯雌酚為上海醫(yī)藥（集團）有限公司華聯(lián)制藥生產(chǎn)；孕酮血清藥盒（批號：0505）、雌二醇血清藥盒（批號：050501）及睪酮血清藥盒（批號：0505）均由北京市福瑞生物工程公司生產(chǎn)。

1．2實驗動物SPF級雌性SD大鼠，50只，4～6月齡，體重180～220 g，由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK桂2003－0001。

2　實驗方法

2．1實驗分組將50只雌性SD大鼠分成5組：正常組、模型組、假手術組、乙烯雌酚組、大豆異黃酮組，每組10只。

2．2模型制備除正常組和假手術組外，其余各組均予摘除卵巢術造模，具體參照并改良李曉泓等方法［2］：予4%戊巴比妥鈉（0．2ml/kg）腹腔注射麻醉，仰位固定，常規(guī)消毒，在腹部正中稍偏左處做一切口約1．3 cm。用眼科鑷夾出卵巢，結扎輸卵管峽部后，切除卵巢，同法切除右側卵巢，縫合切口，碘伏消毒切口。假手術組操作方法同上，但僅切除卵巢周圍部分脂肪組織。術后每日兩次腹腔注射慶大霉素（0．25m l/kg），連續(xù)3 d，防止感染。

2．3給藥劑量與方法形成更年期大鼠模型后，兩藥物干預組分別予乙烯雌酚和大豆異黃酮灌胃，灌胃容積均為1m l/kg，乙烯雌酚組給藥劑量為0．6 mg/kg，1次/天；大豆異黃酮組給藥量為0．5 mg/kg，1次/天。模型組和正常組予生理鹽水10 m l/kg灌胃，1次/天。假手術組予大豆異黃酮灌胃，給藥量為0．5 g/kg，1次/天。各組實驗動物均予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。各組分別連續(xù)灌胃給藥6周。

2．4觀察指標及方法于第6周末將各組大鼠腹腔麻醉，剖腹，腹主動脈取血，于3 500 r/min離心15min，制備血清標本，用于各指標檢測。用放射免疫分析法檢測血清中E2、P、T水平，各步驟嚴格按相關試劑盒說明書操作。同時取各組大鼠腎上腺、子宮及腦垂體各相同部位新鮮組織2．2 cm×1．8 cm× 0．5 cm，固定于4%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，6μm厚切片，HE染色，制備病理切片用于光鏡觀察。采用免疫組化法觀察FSH和LH水平，陽性細胞胞漿呈棕黃色。

2．5統(tǒng)計學處理采用SPSS 12．0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，各組間比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析。

3　結　果

3．1大豆異黃酮對圍絕經(jīng)期綜合征大鼠血清E2、P、T水平的影響見表1。

表1結果顯示，與正常組及假手術組比較，模型組血清E2水平下降，差異具有顯著性意義（P＜0．01），符合圍絕經(jīng)期女性特征。與模型組比較，乙烯雌酚組和大豆異黃酮組血清E2水平均明顯升高（P＜0．05）。而各組間P、T水平變化不明顯（P＞0．05）。

3．2子宮組織形態(tài)學變化正常組：子宮分內膜、肌層及外膜三層。子宮內膜厚，表面上皮呈高柱狀，單層，局部呈假復層；上皮下見散在分布的腺體，腺體大小一致，圓形。假手術組：基本同正常組。模型組：子宮壁明顯變薄，尤以子宮內膜變薄明顯，內膜表面上皮低柱狀，單層。乙烯雌酚組：子宮壁明顯增厚，子宮內膜厚，表面上皮高柱狀。部分區(qū)域呈復層，甚至篩狀增生。腺體增多，大小不一，部分腺腔擴張明顯。部分發(fā)生鱗化。大豆異黃酮組：子宮壁及子宮內膜增厚，介于模型組與假手術組之間。表面上皮呈柱狀，局部假復層。腺體有所增多（見圖1）。

表1　各組大鼠血清E2、P、T水平比較?。▁±s）

3．3腎上腺組織形態(tài)學變化腎上腺組織改變不明顯。正常組：腎上腺分皮質，髓質。皮質占大部分，髓質占比例少，鏡下皮質球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶可分出。假手術組：同正常組。模型組：腺體梢萎縮，皮質變薄，分界欠清。乙烯雌酚組：腺體較模型組增大，皮質稍增厚。大豆異黃酮組：同乙烯雌酚組（見圖2）。

圖1　各組子宮組織病理變化（HE×100）

圖2　各組腎上腺組織病理變化（HE×100）

3．4腦垂體組織形態(tài)學及FSH、LH變化鏡下（FSH染色）：陽性細胞胞漿呈棕黃色。正常組：腺垂體結構正常，各細胞成分均見，分布正常。免疫組化見FSH、LH散在細胞表達。假手術組：基本同正常組。模型組：疏松排列的腺垂體細胞減少，發(fā)現(xiàn)去勢細胞較多（體積較大細胞為去勢細胞，胞漿內部沒有顆粒，具有大空泡，部分空泡內現(xiàn)均質粉紅色分泌物，被擠到一邊的細胞核呈現(xiàn)月牙狀，大部分去勢細胞呈嗜堿性細胞變化）。免疫組化見FSH、LH染色陽性細胞明顯增多，符合更年期綜合征的特征。乙烯雌酚組：腺垂體細胞增多，與正常組相似，但仍見少數(shù)去勢細胞，去勢細胞體積較模型組小，胞漿內有小空泡，亦可見粉紅色分泌物，核圓形或卵圓形，被擠在一側，但不呈月牙狀。未見大空泡細胞。免疫組化見FSH、LH染色陽性細胞少，接近或甚至比正常組少。大豆異黃酮組：去勢細胞及免疫組化FSH、LH染色陽性細胞介于模型組與正常組之間（見圖3～5）。

4　討　論

女性生殖內分泌調節(jié)系統(tǒng)是由下丘腦－垂體－卵巢3個水平所組成的復雜反饋系統(tǒng)。下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（GnRH），促進垂體分泌FSH和LH，它們促進卵巢分泌E2和P，后兩者又對下丘腦和垂體的內分泌活動具有反饋調節(jié)作用。此外，卵巢能分泌少量雄激素T，但T主要來自腎上腺皮質。T不僅是合成雌激素的前體，而且是維持女性正常生殖功能的重要激素［3］。女性進入更年期，下丘腦－垂體－卵巢性腺軸活動異常，血中E2、P、T水平下降，伴隨出現(xiàn)一系列圍絕經(jīng)期綜合征癥狀，影響女性身心健康和正常生育。這種垂體功能失常除與下丘腦調節(jié)功能異常有關外，還與卵巢雌激素分泌減少，對垂體抑制作用減弱有關。

圖3　各組腺垂體組織光鏡圖（HE×400）

圖4　各組FSH細胞變化（HE×400）

圖5　各組LH細胞變化（HE×400）

FSH和LH這兩種激素是由垂體前葉分泌的，F(xiàn)SH能刺激卵泡發(fā)育成熟，在LH、FSH的共同作用下，促進成熟卵泡排卵。女性進入絕經(jīng)期后，卵巢功能減退，卵泡及雌激素分泌逐漸減少，垂體因缺乏雌激素的反饋調節(jié)而FSH和LH分泌升高［4］。因此，研究更年期大鼠用藥前后血清中E2、P、T水平，觀察腎上腺、子宮、腦垂體組織的病理改變及腦垂體組織中FSH、LH的變化，更有助于闡明更年期垂體功能紊亂的機制。

目前單獨運用雌激素或聯(lián)合孕激素被認為是治療圍絕經(jīng)期綜合征最有效的方法，然而，這種治療方案會出現(xiàn)嚴重的副作用，如乳腺癌和心血管事件的增加［5］。美國婦女健康倡議（WHI）曾在健康絕經(jīng)后女性中進行雌激素聯(lián)合孕激素干預的隨機試驗，但該實驗后來被提前終止了，其原因是激素治療對健康的總體風險大于益，其中患浸潤性乳腺癌風險的增加為主要的副作用［6］，同時深靜脈血栓形成、膽囊疾病和中風的風險亦增加［7］。從而引起人們對雌激素替代療法的廣泛關注，尋求更為安全的雌激素替代療法已成為目前國內外研究的焦點［8］。而植物性雌激素（phytoest rogen，PE）正是其中之一。豆類食品中所含的異黃酮是研究最深入的植物性雌激素，前研究表明，大豆異黃酮具有抗氧化［9］、抗腫瘤［10］、類雌激素樣作用［11］及改善心血管系統(tǒng)的作用［12］。

本研究結果顯示模型組去勢大鼠血清E2降低及FSH、LH細胞數(shù)目增多，符合圍絕經(jīng)期綜合征的特征，可作為女性圍絕經(jīng)期綜合征模型進行實驗研究。同時，大豆異黃酮能提高原下降的血清E2水平，降低原升高的FSH、LH，提示大豆異黃酮具有調節(jié)更年期綜合征激素水平的作用，其機制可能是通過下丘腦－垂體－卵巢軸的反饋調節(jié)。大豆異黃酮不僅可調節(jié)圍絕經(jīng)期綜合征的激素水平，相較雌激素還具有安全無副作用的優(yōu)點，使得大豆異黃酮可作為圍絕經(jīng)期綜合征的激素替代療法之一。

［1］曹澤毅．中華婦產(chǎn)科學：上冊［M］．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004∶1152．

［2］李曉泓，鄭玲，翟景慧，等．逆針灸對去卵巢大鼠子宮保護效應的觀察［J］．針刺研究，2008，33（4）：229－234．

［3］樂杰．婦產(chǎn)科學［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：32．

［4］黃星銘，閔曉霞，黃郁蓉．血清FSH、LHⅡ、E2檢測在更年期婦女中的意義［J］．北方藥學，2011，8（5）：57－58．

［5］Jarry H．Estrogen receptor beta and its selective ligands：an option for treatment of menopausal vasomotor symptoms？［J］．Horm Mol Biol Clin Investig，2013，16（1）：7－12．

［6］Rossouw J E，Anderson G L，Prentice R L，et al．Writing Group for the Women's Health Initiative Investigators．Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women：principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial［J］．JAMA，2002，288（3）：321－333．

［7］Roehm E．A Reappraisal ofWomen's Health Initiative Estrogen－Alone Trial：Long－Term Outcomes inWomen 50－59 Years of Age［J］．Obstet Gynecol Int，2015（2015）：713295．

［8］馬貴洲，徐榮和，蔡志雄，等．雌激素及其受體與心血管系統(tǒng)疾?。跩］．心血管病學進展，2009，27（3）：448－453．

［9］鄭靈芝，李素霞，袁勤生．大豆異黃酮抗氧化性質的研究［J］．食品與藥品，2006，8（2）：48－50．

［10］徐春華，張治廣，謝明杰．大豆異黃酮的抗氧化和抗腫瘤活性研究［J］．大豆科學，2010，29（5）：870－873．

［11］周軼琳，趙敏，楊杏芬，等．大豆異黃酮對去勢大鼠類雌激素樣作用的研究［J］．華南預防醫(yī)學，2007，33（3）：20－23，26．

［12］楊科峰，蔡美琴．異黃酮對心血管作用的研究進展［J］．上海第二醫(yī)科大學學報，2005，25（5）：532－534．

（編輯陳明偉）

Effects of Soybean Isoflavone on Sexhormone Levels and Pathological Changes in Climacteric Syndrome Animal Model

LIGui－yu，DUAN Xue－lin，LIN Ji－yong，PENG Yue，ZHAO Tie－jian
（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi530001）

［Objective］To observe the effect of soybean isoflavone on the climacteric syndromemodel of female rats，and to finditsmechanism，in order to provide experimental evidence for the clinical treatmentofmenopausal syndrome．［Methods］50 female SD rats were randomly divided into five groups，10 rats in each group，including the normal control group，sham operation group，model group，diethylstilbestrol group，soybean isoflavone treated group，except the normal control group and sham operation group，the other groups were ovariectomized rats，the formation model of climacteric rats treated with normal saline，diethylstilbestrol，soybean isoflavone by gavage，normal control group and sham operation group were given the same dose of normal saline and soybean isoflavone by gavage．A fter 6 weeks of continuous treatment，abdominal aorta was taken blood，the serum was isolated，and Radioimmunoassay method tomeasure Eestradiol（E2），Progesterone（P），Testosterone（T）．And removal of the pituitary gland，uterine and adrenal prepared pathological section，experimental effectwas observed by lightm icroscopy，using immunohistochem icalmethod to observe the brain pituitary Follicle－Stimulating Hormone（FSH）and Luteinizing hormone（LH）levels．［Results］Radiation immune analysis results show that soybean isoflavone can significantly improve serum E2level in ovariectomized rats，compared with themodel group，the statistical analysis shows significant difference（P＜0．05），but the serum P and T level have little effect．The pathological results show：Between the uterus：soybean isoflavone group of uterine wall and endometrial thickening betweenmodel group and sham operation group，the surface epithelium is columnar，glands increased．Between the pituitary gland：soybean isoflavone ovariectomized group cells between model group and normal group．Adrenal：soybean isoflavone group adrenal tissue did not change significantly．Immunohistochem ical results shown：Soybean isoflavone group pituitary tissues of FSH and LH cells compared with the model group decreased significantly．［Conclusion］Soybean isoflavones canmake the animalmodel of perimenopausal syndrome of uterus wall and endometrial thickening，improve the serum level of E2in ovariectomized rats，and decrease the level of FSH and LH，but have little effecton the adrenal tissues，level of T and P．

Soybean isoflavone；Climacteric syndrome；E2；P；T；FSH；LH

R285．5

A

2095-4441（2016）03－0004－05

2016－08－13

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃基金資助項目（No：JGY2014082）；廣西中醫(yī)學院自然科學研究課題（No：P2005006）

黎桂玉（1990－），女，漢族，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結合治療圍絕經(jīng)期綜合征

段雪琳，女，講師，碩士，研究方向：中西醫(yī)結合治療圍絕經(jīng)期綜合征；E－mail：403605650＠qq．com