雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究

郭慧

江西省宜春市婦幼保??；藥劑科，江西宜春336000

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究

郭慧

江西省宜春市婦幼保??；藥劑科，江西宜春336000

目的研究雷公藤內(nèi)酯醇（TP）對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為的影響。方法培養(yǎng)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株，用0、10、20、40、80 nmol/L的TP處理，0 nmol/L TP處理的為正常對(duì)照（NC）組，10、20、40、80 nmol/L TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組，測(cè)定細(xì)胞活力及細(xì)胞Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA含量。結(jié)果TP處理能以劑量依賴性和時(shí)間依賴性的方式降低卵巢癌細(xì)胞活力，同組不同時(shí)間點(diǎn)及同時(shí)間點(diǎn)多組間的細(xì)胞活力比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。10、20、40、80 nmol/L TP組細(xì)胞Bcl-2mRNA含量（0.83±0.11、0.68±0.07、0.54±0.08、0.33±0.04）均低于NC組（1.00±0.15），BaxmRNA含量（1.32±0.15、1.66±0.21、2.19±0.35、3.22±0.63）均高于NC組（1.00±0.13），Beclin-1 mRNA含量（1.44±0.18、1.76± 0.24、2.51±0.32、3.10±0.47）均高于NC組（1.00±0.18），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19、1.81±0.22、2.49±0.31、3.41±0.51）均高于NC組（1.00±0.17），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同劑量TP組Bcl-2、Bax、Beclin-1mRNA含量及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)、細(xì)胞自噬的途徑來(lái)抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株的增殖。

卵巢癌；雷公藤內(nèi)酯醇；增殖；自噬

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期缺乏典型的臨床癥狀，確診時(shí)多數(shù)已發(fā)展至中晚期，預(yù)后情況較差、5年存活率不足30%。卵巢癌的死亡率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的前列，是威脅女性生命健康的重要疾病。化療是臨床上治療晚期卵巢癌的常用方法，但是受到化療藥物不良反應(yīng)、耐藥性等因素制＜，整體的化療效果并不理想［1-2］。近年來(lái)，臨床學(xué)者致力于探尋更加低毒性、高殺傷性的藥物來(lái)治療卵巢癌。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）是從中藥材雷公藤中分離得到的二萜內(nèi)酯類化合物，對(duì)子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)均有抑制作用［3-4］。但是，關(guān)于單獨(dú)應(yīng)用TP是否能影響卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究主要分析TP對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株購(gòu)于中科；細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)基、牛血清均購(gòu)于Gibco公司，TP購(gòu)于Sigma公司，MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司，PCR試劑盒購(gòu)于北京天根公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)SKOV-3細(xì)胞株復(fù)蘇后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%的密度后用0.125%的胰酶進(jìn)行消化，取消化后的細(xì)胞并重懸，接種在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用于繼續(xù)傳代，培養(yǎng)板中的細(xì)胞用于藥物處理。

1.2.2 細(xì)胞處理取培養(yǎng)板中的細(xì)胞，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%左右，將含有血清的培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，24 h后在細(xì)胞孔內(nèi)加入不同劑量的TP，培養(yǎng)孔內(nèi)的藥物終濃度分別為0、10、20、40、80 nmol/L。0 nmol/L TP處理的為正常對(duì)照（NC）組，不同劑量TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組。連續(xù)處理不同時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。每批細(xì)胞重復(fù)5次。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí)，細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞板中，藥物處理12、24、48 h，分別在培養(yǎng)基中加入20μLMTS檢測(cè)試劑，繼續(xù)孵育4 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 mRNA含量測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞中mRNA含量時(shí)，細(xì)胞接種在12孔細(xì)胞板中，藥物處理24 h后，棄盡培養(yǎng)基，采用RNA提取試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，得到mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA樣本；取cDNA樣本并進(jìn)行稀釋，然后采用PCR試劑盒配置反應(yīng)體系，具體體系如下：cDNA樣本1μL、Mastermix反應(yīng)液10μL、20μmol/L的上下游引物各0.4μL、去離子水8.2μL。按照下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃、15 s，特異性退火溫度、20 s，72℃、25 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成擴(kuò)增曲線及對(duì)應(yīng)的起跳循環(huán)數(shù)（Ct值），通過(guò)2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA含量。擴(kuò)增的基因包括Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1以及β-actin。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力比較

TP處理24 h的半最大效應(yīng)濃度（EC50）為36.8 nmol/L，處理48 h的EC50為13.5 nmol/L。同時(shí)間點(diǎn)多組間比較：處理后12、24、48 h，TP組細(xì)胞OD值均顯著低于NC組，且TP劑量越大，細(xì)胞OD值越低；同組不同時(shí)間點(diǎn)比較：TP組細(xì)胞處理后12、24、48 h的OD值有差異，處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞OD值越低。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活力比較（x±s）

2.2 各組細(xì)胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較

處理后24 h，TP組細(xì)胞Bcl-2 mRNA含量顯著低于NC組，BaxmRNA含量顯著高于NC組，且TP劑量越大，細(xì)胞Bcl-2mRNA含量越低、Bax mRNA含量越高。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較（x±s）

2.3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1mRNA含量比較

處理后24 h，TP組細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量均顯著高于NC組；TP劑量越大，細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量越高。見(jiàn)表3。

表3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1m RNA含量比較（x±s）

3 討論

化療是目前臨床上治療晚期卵巢癌的主要方法，配合以放療能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但是整體預(yù)后并不理想，5年生存率也較低［5-7］。癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌化療效果不佳的主要原因［8-9］，探尋更為有效的卵巢癌化療藥物一直是臨床學(xué)者研究的熱點(diǎn)。雷公藤是臨床上用于抗炎、抗腫瘤、兔疫調(diào)節(jié)等治療的中藥材，TP是從雷公藤中分離得到的二萜內(nèi)酯類化合物，也是雷公藤的有效成分。已有離體研究證實(shí)，TP對(duì)子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制效應(yīng)，能夠造成DNA斷裂、染色質(zhì)凝集以及凋亡小體形成［3-4］。

近年來(lái)，有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了TP聯(lián)用紫杉醇、順鉑等化療藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外活性具有抑制作用［10-11］，但是關(guān)于TP單藥處理對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10、20、40、80 nmol/L的TP來(lái)處理體外培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活力可知，TP能以劑量依賴性和時(shí)間依賴性的方式降低卵巢癌細(xì)胞的活力。由此初步證實(shí)，TP對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖具有抑制效應(yīng)，推測(cè)其具備用于卵巢癌治療的潛在價(jià)值。

線粒體凋亡途徑是調(diào)節(jié)細(xì)胞活力的重要機(jī)制，Bcl-2家族是介導(dǎo)線粒體凋亡途徑的主要分子［12-13］。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡分子，能與線粒體膜結(jié)合并形成滲透性膜轉(zhuǎn)移孔復(fù)合物，調(diào)節(jié)線粒體膜轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放和關(guān)閉，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C并通過(guò)下游Caspase家族來(lái)造成細(xì)胞凋亡［14-15］；Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡分子，能與Bax形成異源二聚體，拮抗Bax誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C釋放的作用，從而抑制下游Caspase分子的活化及其所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［16］。在使用TP處理后24 h檢測(cè)，TP能減少Bcl-2的mRNA含量，增加Bax的mRNA含量，且藥物劑量越大，細(xì)胞Bcl-2的mRNA含量越低、Bax的mRNA含量越高。這說(shuō)明TP能通過(guò)Bcl-2/Bax所介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌的活力。

自噬是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，又稱為Ⅱ型程序性死亡，指細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解自身受損細(xì)胞器及異常大分子物質(zhì)的過(guò)程［17-18］。在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，自噬過(guò)程顯著受到抑制，無(wú)法清除體內(nèi)異常增殖的腫瘤細(xì)胞，從而造成腫瘤發(fā)生和發(fā)展［19］。LC3是公認(rèn)的自噬標(biāo)志分子，在自噬處于低水平時(shí)，非活化狀態(tài)的LC3-Ⅰ表達(dá)量高于活化狀態(tài)的LC3-Ⅱ；自噬被激活時(shí)，LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著上調(diào)、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例增加［20-21］。同時(shí)，在自噬激活及自噬體形成的過(guò)程中，自噬相關(guān)基因ATG-6的同源基因Beclin-1高表達(dá)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用［20，22-23］。TP處理后的細(xì)胞自噬水平測(cè)定結(jié)果顯示，TP能夠顯著增加細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量，且TP劑量越大，細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量越高。這說(shuō)明自噬是TP調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞活力的另一個(gè)途徑。

綜上所述，TP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達(dá)、細(xì)胞自噬的途徑來(lái)抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株的增殖。

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Experimental study on the effect of triptolide on m alignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3

GUOHui
Department of Pharmacy，Maternal and Child Health Hospital of Yichun City，Jiangxi Province，Yichun 336000，China

Objective To study the effect of triptolide（TP）onmalignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3.M ethods Ovarian cancer SKOV-3 cellswere cultured，treated with 0，10，20，40，80 nmol/L TP and 0 nmol/L TP treatmentwas NC group，10，20，40，80 nmol/L TP treatmetwas 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group respectively.Cell viability and mRNA contents of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，Beclin-1 were determined.Resu lts TP decreased cell viability of ovarian cancer cell on dose dependent and time dependentmanner，there were significant differences on cell viability in different time points the same group and the same time point between groups（P＜0.05）.Bcl-2mRNA contents（0.83±0.11，0.68±0.07，0.54±0.08，0.33±0.04）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were lower than that of NC group（1.00± 0.15）；BaxmRNA contents（1.32±0.15，1.66±0.21，2.19±0.35，3.22±0.63）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.13）；Beclin-1 mRNA contents（1.44±0.18，1.76±0.24，2.51±0.32，3.10±0.47）of10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TPgroup，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.18）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19，1.81±0.22，2.49±0.31，3.41± 0.51）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.17），with statistical differences（P＜0.05）.Bcl-2，Bax，Beclin-1mRNA contents and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin different doses of TP group were compared，with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion TP can inhibit the proliferation of ovarian cancer cell line SKOV-3 through regulating the expression of Bcl-2/Bax and cell autophagy.

Ovarian cancer；Triptolide；Proliferation；Autophagy

R737.31

A

1673-7210（2016）05（a）-0024-04

2016-01-16本文編輯：李亞聰）